阅读说明：本技术 一种安替安吉肽有关物质的检测方法 (Detection method of related substances of Antiaoji peptide ) 是由 滕宁宁 吕晓利 张甲姝 赵佳欣 马胜楠 梁东娜 赵光超 梁丽娜 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物检测领域,具体涉及一种安替安吉肽有关物质的检测方法。所述检测方法为取安替安吉肽待测品配制供试品溶液,然后以磷酸盐缓冲液为流动相A、乙腈水溶液为流动相B进行HPLC检测,所述HPLC检测的色谱柱采用二苯基键合硅胶作为填充剂。本发明通过建立灵敏度强,专属性、稳定性及耐用性良好的安替安吉肽有关物质的检测方法,能够有效控制安替安吉肽的质量,使安替安吉肽质量达到稳定、可控及安全。(The invention belongs to the field of drug detection, and particularly relates to a detection method of an amphetamine related substance. The detection method comprises the steps of preparing a sample solution from an amphetamine to be detected, performing HPLC detection by using a phosphate buffer solution as a mobile phase A and using an acetonitrile aqueous solution as a mobile phase B, and using diphenyl bonded silica gel as a filler for a chromatographic column of the HPLC detection. According to the invention, by establishing the detection method of the related substances of the Anji peptide, which has strong sensitivity and good specificity, stability and durability, the quality of the Anji peptide can be effectively controlled, so that the quality of the Anji peptide is stable, controllable and safe.)

一种安替安吉肽有关物质的检测方法

技术领域

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种安替安吉肽有关物质的检测方法。

背景技术

安替安吉肽是整合素阻断剂类合成多肽，研究发现，它能够有效抑制内皮细胞的迁移，但对肿瘤细胞增殖无影响。其合成工艺采用固项合成方法，以Fmoc-Asp(Otbu)-wangresin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至十八肽，该工艺过程中，缺乏有效的中间过程控制，导致收率低，工艺稳定性差。

安替安吉肽作为一类创新药物，质量标准还未见国内外药典收载。目前关于多肽类药物的质量标准中，针对有关物质的检测方法多为以十八烷基键合硅胶为填充剂的高效液相法。然而采用该填充剂的色谱柱(规格为4.6*250mm，5μm)进行试验探究，基线干扰性大，并且主成分与邻近杂质无法达到基线分离。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的发明人根据安替安吉肽的结构特征以及市售色谱柱特色，选用联苯键合系列的色谱柱探究专属性强、稳定性及耐用性好的有关物质检测方法。鉴于此，本发明提供一种安替安吉肽有关物质的检测方法。

具体来说，本发明提供了如下技术方案。

一种安替安吉肽有关物质的检测方法，取安替安吉肽待测品配制供试品溶液，然后以磷酸盐缓冲液为流动相A、乙腈水溶液为流动相B进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱柱采用二苯基键合硅胶作为填充剂。

优选的，上述检测方法中，所述二苯基键合硅胶为二苯基键合表面多孔的核壳结构硅胶。

优选的，上述检测方法中，所述色谱柱的孔径为80埃，碳载量为6％，粒径为2.6μm，内径为2.1mm，柱长为100mm。

优选的，上述检测方法中，所述安替安吉肽为小分子多肽，其分子量为1779.99±1Da。

优选的，上述检测方法中，所述流动相A为0.01～0.03mol/L的磷酸二氢钾水溶液，所述磷酸二氢钾水溶液用磷酸调节pH值为2.5～3.5，所述流动相B为80％乙腈水溶液。

优选的，上述检测方法中，所述磷酸二氢钾水溶液中添加峰形改善剂，所述峰形改善剂为二乙胺、三乙胺、三氟乙酸、甲基磺酸钠、戊烷磺酸钠或辛烷磺酸钠。

优选的，上述检测方法中，所述磷酸二氢钾水溶液具体为：取磷酸二氢钾2.72g，三氟乙酸1mL，加水溶解并稀释至1000mL，磷酸调节pH值至3.0。

优选的，上述检测方法中，所述HPLC检测的洗脱程序为：以所述流动相的总体积为100％计，

在第0～10min，所述流动相A的体积由95％递减为90％，所述流动相B的体积由5％递增为10％；

在第10～20min，所述流动相A的体积由90％递减为89％，所述流动相B的体积由10％递增为11％；

在第20～25min，所述流动相A的体积为89％，所述流动相B的体积为11％；

在第25～25.5min，所述流动相A的体积由89％递增为95％，所述流动相B的体积由11％递减为5％；

在第25.5～30min，所述流动相A的体积为95％，所述流动相B的体积为5％。

优选的，上述检测方法中，所述HPLC检测的流速为0.3mL/min；

和/或，柱温为40℃；

和/或，检测波长为210nm；

和/或，在检测过程中，主峰保留时间为17.5±0.5min，主峰峰纯度匹配值大于980，显示为单组分。

优选的，上述检测方法中，所述供试品溶液的浓度为0.1～1.0mg/mL。

优选的，上述检测方法中，将所述供试品溶液稀释100倍作为对照品溶液，然后以检测所述供试品溶液的条件对所述对照品溶液进行HPLC检测，按照主成分自身对照法测得有关物质的含量。

本发明所取得的有益效果：

(1)本发明所述的检测方法灵敏度高，能有效检出低浓度药物溶液中的工艺杂质和降解杂质，可节约安替安吉肽药物的检测成本。

(2)本发明所述的检测方法专属性强，鉴于多肽药物的杂质谱复杂的特殊性，本说明方法可有效控制安替安吉肽的质量，对于工艺和质量控制具有积极意义。

(3)本发明所述的安替安吉肽所采用的色谱柱基于表面多孔增强核技术，采用联苯替代十八烷基，具备π电子相互作用和双键选择性，分离效果明显优于C18色谱柱。

(4)本发明的广泛目的在于，为多肽类药物的质量标准提高和工艺控制提供参考。

对安替安吉肽有关物质检测方法进行优化，建立更完善的分析测试方法，制定高技术水平的控制安替安吉肽质量的检测指标和分析方法，使之更加科学化、规范化，增强竞争力，具有重大的实际意义和学术价值。本发明通过建立专属性强的有关物质测定方法，能够有效控制安替安吉肽的质量，使安替安吉肽质量达到稳定、可控及安全。

附图说明

图1为实施例1中利用DAD检测器对供试品溶液纯度检查的HPLC色谱图。

图2为实施例1中利用DAD检测器对水解破坏样品溶液纯度检查的HPLC色谱图。

图3为实施例1中利用DAD检测器对酸破坏样品溶液纯度检查的HPLC色谱图。

图4为安替安吉肽有关物质检测限的HPLC色谱图。

图5为对比例1中利用DAD检测器对供试品溶液纯度检查的HPLC色谱图。

图6为对比例1中利用DAD检测器对水解破坏样品溶液纯度检查的HPLC色谱图。

图7为对比例1中利用DAD检测器对酸破坏样品溶液纯度检查的HPLC色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的实验原料和相关设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种安替安吉肽有关物质的HPLC色谱分析检测方法，具体步骤如下：

1、【待测样品准备】

供试品溶液：称取待测样品安替安吉肽适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含有安替安吉肽0.5mg的溶液。

水解破坏样品溶液：取供试品溶液室温放置72小时，即得。

酸破坏样品溶液：称取待测样品安替安吉肽适量，加2M盐酸溶液1ml，静置6小时，加2M氢氧化钠溶液1ml终止破坏，最后加水稀释制成每1ml中约含有安替安吉肽0.5mg的溶液。

检测限浓度溶液：称取安替安吉肽对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含有安替安吉肽0.5mg的溶液，取上述溶液分步稀释并检测，当信噪比为3左右时，即为检测限浓度溶液。

2、【测定方法】

精密量取待测样品溶液1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，以二苯基键合表面多孔实心核硅胶为填充剂(Thermo Accucore Biphenyl，2.1mm×100mm，2.6μm)，以磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH值至3.0，加三氟乙酸1.0ml)为流动相A，以乙腈-水溶液(80:20)为流动相B，流速为每分钟0.3ml，检测温度为40℃，检测波长为210nm，按表1进行梯度洗脱。精密量取对照溶液5μL注入液相色谱仪，调节仪器的灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10％，记录色谱图。精密量取待测样品溶液5μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

表1

3、【峰纯度测定】

在高效液相色谱仪上用二极管阵列检测器同步检测峰纯度。检测谱图中，安替安吉肽的色谱峰匹配值大于980，其色谱峰紫外吸收光谱图、三维图谱以及5点光谱图完全重合，则表明为单一纯物质峰，若色谱峰匹配值小于980，则表明有杂质未与主成分有效分离。

4、【测定结果】

图1为实施例1中利用DAD检测器对供试品溶液纯度检查的HPLC色谱图，可以看出基线相对稳定，保留时间在17分钟左右的峰为主成分安替安吉肽，二极管阵列检测峰纯度的匹配值为997，表明为单一组分；根据图谱，待测样品在未破坏时共计检出4个杂质，相邻杂质峰与主峰的分离度分别为3.52和2.19，符合规定；

图2为实施例1中利用DAD检测器对水解破坏样品溶液纯度检查的HPLC色谱图，保留时间在17分钟左右的峰为主成分安替安吉肽，二极管阵列检测峰纯度的匹配值为998，表明为单一组分；该批样品水解后共检出15个杂质，相邻杂质峰与主峰的分离度分别为4.03和2.44，符合规定；

图3为实施例1中利用DAD检测器对酸破坏样品溶液纯度检查的HPLC色谱图，安替安吉肽二极管阵列检测峰纯度的匹配值为998，表明为单一组分；该批样品酸破坏后共检出15个杂质，相邻杂质峰与主峰的分离度分别为1.57和1.75，符合规定；

图4为安替安吉肽有关物质检测限的HPLC色谱图，安替安吉肽的信噪比(S/N)为3.1，经计算，其检测限浓度为0.200μg/ml。

对比例1

对比例1为传统的安替安吉肽有关物质检测方法，其与实施例1的不同点在于：以十八烷基键合硅胶为填充剂，以0.2％三氟乙酸的磷酸盐缓冲溶液(取磷酸二氢钾10.89g，加水900ml溶解，加1mol/L磷酸溶液10ml，用水稀释至1000ml)为流动相A，以0.1％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；检测波长为220nm；流速为1ml/min。

利用本发明实施例1的检测方法得到的谱图基线相对稳定，专属性强，在样品未破坏(供试品溶液)时可检出4个杂质，而如图5所示，对比例1的传统检测方法仅能检出3个杂质，且基线波动干扰较大，影响杂质检出和方法的灵敏性；实施例1的检测方法在样品降解研究时可检出较多杂质，且各杂质间分离情况良好，而如图6和图7所示，对比例1的传统检测方法对降解杂质的检出个数相对较少；此外，实施例1的检测方法的检测限浓度为0.200μg/ml，较传统检测方法更为灵敏准确。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。