具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有规定，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有规定，否则它们不限于特定的试剂，因而，它们当然也可有所变化。另外应当了解，本文使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。

A.定义

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”“一种”“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定不是这样。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两个或更多这样的载体的混合物等。

范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每一个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每一个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开了“小于或等于”值、“大于或等于”值时，也公开了如本领域技术人员所恰当理解的介于值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每一个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

术语“受试者”在本文中定义为包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施例中，受试者是人。

向受试者“给药/施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行施用，包括口服、局部、静脉、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内(intra-joint)、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉、肌肉内、关节内(intra-articular)、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用(simultaneous administration或administered simultaneously)”意指化合物在同一时间点施用或基本上紧接着施用。在后一种情况下，该两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点施用化合物时获得的结果不可区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部施用”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻施用点的一个或多个区域，并且不以治疗上显著的量系统地引入该药剂。例如，局部施用的药剂在局部施用点的附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。施用包括自我施用和他人施用。

“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对受试者无毒并且不对受体造成显著的副作用。

“包含”意指组合物、方法等包括所提到的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应指包括所列举的要素，但排除对组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药用载体，诸如磷酸盐缓冲液、防腐剂等。“由……组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于施用本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个所定义的实施例都在本发明的范围内。

“对照”是在实验中出于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。

“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。

药剂的“有效量”是指药剂提供所需的效果的足够数量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天施用若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。

“减少”可以指导致较少的基因表达、蛋白质表达、症状数量、疾病、组合物、病症或活动的任何变化。当含有该物质的基因产物的遗传产量与不含该物质的基因产物的遗传产量相比较小时，物质也被理解为减少基因的遗传产量。此外，举例来说，减少可以是一种障碍症状的改变，使得症状比以前观察到的要少。减少可以是统计学上显著的量的病症、症状、活动、组合物中的任何个体、中位数或平均减少。因此，只要减少非常显著，减少可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

“抑制(Inhibit、inhibiting和inhibition)”意指降低活性、反应、病症、疾病或其他生物参数。这可以包括但不限于活动、反应、病症或疾病的完全消融。这也可以包括，例如，与未经处理的或对照水平相比，活动、反应、病症或疾病减少10％。因此，与未经处理的或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于两者之间的任何减少量。

如本文所用，术语“预防(prevent、preventing或prevention)”及其语法变体是指部分或完全延迟或阻止疾病和/或其一个或多个伴随症状的发生或复发，或阻止受试者获得或重新获得疾病或减少受试者获得或重新获得疾病或一个或多个伴随症状的风险。

“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，即该组分可掺入本发明的药物制剂中并施用到如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人类的施用时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲液、水、乳液(诸如油/水或者水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。

“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。

“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应，其中治疗效应例如治疗障碍或其他不良生理病症，预防效应例如预防障碍或其他不良生理病症(例如，非免疫原性癌症)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药用的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药用的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。

组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(诸如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确的所需治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年施用多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。

在本说明书及随后的权利要求书中，将引用多个术语，将其定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本申请所涉及的技术现状。所公开的参考文献也单独并且具体地以引用方式并入本文，参考文献中包含的材料在参考文献所依据的句子中予以讨论。

B.组合物

本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当本发明公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每一个在本文中均予以特别考虑和描述。例如，如果公开并且讨论了特定的生物响应水凝胶基质并且讨论了可对包含生物响应水凝胶基质的多个分子进行多种修改，除非指明是相反情况，否则具体考虑到生物响应水凝胶基质的各种和每种组合和排列以及可能的修改。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子的实例，则公开了A-D，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了个体和集体考虑的含义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。

在此，使用活性氧(ROS)响应接头设计出一种抗PD-1(aPD1)在核中并且抗CD47(aCD47)在壳中([email protected]复合物)的基于白蛋白的复合物，以用于组合疗法。本文示出，在富集ROS的TME中，ROS响应[email protected]复合物首先可从外壳持续释放aCD47，以活化先天免疫系统对癌细胞的识别并增强T细胞应答。然后，随后释放的aPD1可以发挥PD1阻断作用，以便有效增加同种异体反应性T细胞以攻击癌细胞。此外，ROS响应复合物不仅用作用于抗体的控释的贮库，而且调节TME中的ROS水平(图1A)。ROS为免疫系统中的重要的信号传导信使，与免疫抑制性应答密切相关，促进肿瘤的发展和进展。因此，ROS可降解复合物可通过aCD47和aPD1的受控顺序释放与TME内的ROS敏感信号的下调一起来促进有效的抗肿瘤免疫应答。

本文公开了生物响应水凝胶基质，该生物响应水凝胶基质包含CD47/SIRPα抑制剂(诸如Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621)和免疫检查点阻断抑制剂(诸如PD-1/PD-L1抑制剂和/或CTLA-4/B7-1/2抑制剂)。

在一个方面，可用于所公开的生物响应水凝胶基质的阻断抑制剂可为免疫检查点阻断抑制剂的任何抑制剂，诸如PD-1/PD-L1阻断抑制剂，和/或CTLA-4/B7-1/2阻断抑制剂(诸如，易普利单抗)。用于所公开的生物响应水凝胶基质中的PD-1/PD-L1阻断抑制剂的实例可包括本领域已知的任何PD-1/PD-L1阻断抑制剂，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、皮地珠单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。

如本文所述，所公开的生物响应水凝胶基质利用CD47/信号调节蛋白α(SIRPα)抑制剂(诸如Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和/或TTI-621)抑制剂以使受试者对免疫检查点抑制疗法敏感。应当理解并且在本文中预期，用于所公开的生物响应水凝胶基质的CD47/SIRPα抑制剂可包括任何已知的CD47/SIRPα抑制剂，包括但不限于Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和/或TTI-621。

为了促进这些功能，生物响应水凝胶基质可设计为聚合物。“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”涵盖所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。在一个方面，凝胶基质可包括共聚物、嵌段共聚物、二嵌段共聚物和/或三嵌段共聚物。

在一个方面，生物响应水凝胶基质可包含生物相容性聚合物(诸如，甲基丙烯酸酯化的透明质酸(m-HA))。在一个方面，可交联生物相容性聚合物。此类聚合物还可用于将脂肪褐变剂和/或脂肪调节剂缓慢释放到组织中。如本文所使用的，生物相容性聚合物包括但不限于多糖；亲水性多肽；聚(氨基酸)诸如聚-L-谷氨酸(PGS)、γ-聚谷氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-L-丝氨酸或聚-L-赖氨酸；聚亚烷基二醇和聚环氧烷诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚(环氧乙烷)(PEO)；聚(氧乙烯化多元醇)；聚(烯烃醇)；聚乙烯吡咯烷酮；聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)；聚(羟烷基甲基丙烯酸)；聚(糖)；聚(羟基酸)；聚(乙烯醇)、多羟基酸诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-乙醇酸)；聚羟基脂肪酸酯诸如聚3-羟基丁酸或聚4-羟基丁酸；聚己内酯；聚(正酯)；聚酸酐；聚(磷腈)；聚(丙交酯-己内酯)；聚碳酸酯诸如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；聚酯；聚(二氧环己酮)；聚(烷基烯)；疏水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸盐；聚羟基戊酸盐；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸盐；聚(马来酸)及其共聚物。生物相容性聚合物还可包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醇(PVA)、甲基丙烯酸酯(m-PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、乙基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(醋酸乙烯酯、聚氯乙烯聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、线性和支链共聚物及其嵌段共聚物，以及其共混物。示例性可生物降解聚合物包括聚酯、聚(邻位酯)、聚(乙烯胺)、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基戊酸酯)、聚酸酐、聚(丙烯酸)、聚乙二醇、聚(氨基甲酸乙酯)、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈及其衍生物、线性和支链共聚物及其嵌段共聚物，以及其共混物。

在一些实施例中，生物响应水凝胶基质包含生物相容性和/或可生物降解聚酯或聚酸酐，诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-乙醇酸)。生物响应水凝胶基质可包含以下聚酯中的一种或多种：包括乙醇酸单元(本文称为“PGA”)的均聚物和乳酸单元(诸如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯、和聚-D,L-丙交酯5，在本文中统称为“PLA”)和己内酯单元(诸如聚(己内酯)，在本文中统称为“PCL”)；和包括乳酸和乙醇酸单元的共聚物(诸如以乳酸与乙醇酸之比为特征的各种形式的聚(乳酸-乙醇酸)和聚(丙交酯-乙交酯)，在本文中统称为“PLGA”)；和聚丙烯酸酯，以及其衍生物。示例性聚合物还包括聚乙二醇(PEG)和上述聚酯的共聚物，诸如各种形式的PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，在此统称为“PEG化聚合物”。在某些实施例中，该PEG区域可与聚合物共价缔合以通过可裂解的接头产生“PEG化聚合物”。在一个方面中，该聚合物包含至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的缩醛侧基。

本文所公开的三嵌段共聚物包含核心聚合物，诸如，例如，聚乙二醇(PEG)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙烯吡咯烷酮-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚己内酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、纤维素衍生物(诸如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等)。在一个方面，该核心共聚物侧翼可为多肽嵌段。

可在本文所公开的胶束中使用的二嵌段共聚物的实例包含聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇(PVA)、聚吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙烯吡咯烷酮-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚己内酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)。

应当理解并且在本文中预期，生物响应水凝胶基质可设计为对肿瘤的微环境具有生物响应，并在暴露于微环境内的因子时将CD47/SIRPα抑制剂(诸如，Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621)和免疫检查点阻断抑制剂(诸如PD-1/PD-L1抑制剂和/或CTLA-4/B7-1/2抑制剂)以及任何其他抗癌剂释放至肿瘤微环境中，该微环境内的因子(诸如活性氧)，包括但不限于过氧化物(例如过氧化氢)、超氧化物、羟基自由基和单线态氧；酸性的存在；氧化还原电位(谷胱甘肽(GSH))；特定肿瘤相关酶；缺氧；和腺苷-5′-三磷酸(ATP)。因此，在一个方面，本文所公开的生物响应水凝胶基质包含生物响应支架，该生物响应支架在暴露于微环境内的因子时将CD47/SIRPα抑制剂(诸如，Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621)和免疫检查点阻断抑制剂(诸如，PD-1/PD-L1抑制剂和/或CTLA-4/B7-1/2抑制剂)和/或其他抗癌剂释放至肿瘤微环境中(例如，活性氧(ROS)可降解水凝胶)。在一个方面，水凝胶可包括交联聚乙烯醇(PVA)和N¹-(4-二羟硼基苄基)-N³-(4-二羟硼基苯基)-N¹,N¹,N³,N³-四甲基丙烷-1,3-二胺(TSPBA)。在一个方面，ROS响应水凝胶可通过将聚(乙烯醇)(PVA)与ROS不稳定型接头进行交联而获得：N¹-(4-二羟硼基苄基)-N³-(4-二羟硼基苯基)-N¹,N¹,N³,N³-四甲基丙烷-1,3-二胺(TSPBA)，其经由N¹,N¹,N³,N³-四甲基丙烷-1,3-二胺与过量4-(溴甲基)苯硼酸的季铵化反应来合成。TSPBA含有两种苯硼酸，它们与PVA上的多个二醇络合。当在肿瘤微环境中暴露于H₂O₂时，TSPBA会被氧化和水解，导致聚合物支架的解离以及PVA和有效载荷的释放。在另一个方面，水凝胶可包含经由双-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的2,2'-[丙烷-2,2-二基双(硫代)]二乙酸(NHS-IE-NHS)交联剂交联至CD47/SIRPα抑制剂和免疫检查点阻断抑制剂两者的白蛋白。

在一个方面，CD47/SIRPα抑制剂(诸如，Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621)和免疫检查点阻断抑制剂(诸如，PD-1/PD-L1抑制剂和/或CTLA-4/B7-1/2抑制剂)可以核-壳结构排列在生物响应水凝胶基质中，以促进CD47/SIRPα抑制剂和免疫检查点阻断抑制剂的顺序释放，使得在壳结合抑制剂释放之后将核结合抑制剂释放至肿瘤微环境中。因此，在一个方面，本文公开了生物响应水凝胶基质，其中生物响应水凝胶基质包括内核和外壳；并且其中CD47/SIRPa抑制剂交联至外壳并且免疫检查点抑制剂交联至内核，或者其中CD47/SIRPa抑制剂交联至内核并且免疫检查点抑制剂交联至外壳。

可用于所公开的生物响应水凝胶基质的抗癌剂可包括本领域已知的任何抗癌剂，包括但不限于阿贝西利、乙酸阿比特龙、Abitrexate(甲氨蝶呤)、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米微粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、Adcetris(本妥昔单抗)、ADE、Ado-曲妥珠单抗Emtansine、阿霉素(盐酸阿霉素)、马来酸阿法替尼、Afinitor(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼)、Aldara(咪喹莫特)、阿地白介素、Alecensa(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿伦单抗、爱宁达(培美曲塞二钠)、Aliqopa(盐酸Copanlisib)、用于注射的爱克兰(盐酸美法仑)、爱克兰片(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布加替尼)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥)、Amboclorin苯丁酸氮芥)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、Aredia(帕米磷酸二钠)、Arimidex(阿那曲唑)、Aromasin(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、菊欧文氏菌天冬酰胺酶、阿特朱单抗、安维汀(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、Becenum(卡莫司汀)、Beleodaq(贝林司他)、贝林司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(Inotuzumab奥佐米星)、贝伐单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、Blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、Bosulif(博舒替尼)、博舒替尼、本妥昔单抗、布加替尼、BuMel、白消安、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、Cabometyx(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、Campath(阿仑单抗)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Carac(氟尿嘧啶-局部用)、卡铂、卡铂-紫杉醇、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、Casodex(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼、Cerubidine(盐酸Daunombicin)、Cervarix(重组HPV双价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-强的松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、盐酸Copanlisib、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(更生霉素)、Cotellic(考比替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫卢单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、更生霉素、达雷木单抗、Darzalex(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸Daunombicin和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素-白喉毒素连接物、地诺单抗、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地妥昔单抗、多西他赛、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗、Efudex(氟尿嘧啶-局部用)、Elitek(拉布立酶)、Ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、Eloxatin(奥沙利铂)、艾曲波帕乙醇胺、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、Erivedge(维莫德吉)、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(菊欧文氏菌天冬酰胺酶)、Ethyol(氨磷汀)、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射)、5-FU(氟尿嘧啶-局部用)、Fareston(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludara(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶-局部用)、氟尿嘧啶注射、氟尿嘧啶-局部用、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、加卫苗(重组HPV四价疫苗)、加卫苗9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(阿妥珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、GEMOTABINE-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗-奥佐米星、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入物)、羧肽酶、乙酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、Herceptin(曲妥珠单抗)、HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、重组Hycamtin(盐酸拓扑替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗Tiuxetan、依鲁替尼、ICE、Iclusig(盐酸帕纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、Imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、Inotuzumab奥佐米星、干扰素α-2b、重组白介素-2(阿地白介素)、Intron A(重组干扰素α-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、易普利单抗、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、柠檬酸伊沙佐米、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗Emtansine)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(派姆单抗)、Kisqali(瑞博西尼)、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、乙酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(苯丁酸氮芥)、乙酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(三氟尿苷和盐酸替比嘧啶)、Lupron(乙酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(乙酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(乙酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸甲基苄肼)、盐酸氮芥、乙酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPL(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、Myleran(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥珠单抗-奥佐米星)、纳米微粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米微粒制剂)、Navelbine(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、Nerlynx(马来酸来那替尼)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、Neulasta(聚乙二醇非格司亭)、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼罗替尼、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武单抗、Nolvadex(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿妥珠单抗、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕尼、奥拉单抗、高三尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素-白喉毒素连接物)、Opdivo(纳武单抗)、OPPA、奥斯替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米微粒制剂、PAD、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米磷酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素α-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸甲基苄肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(地诺单抗)、Promacta(艾曲波帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、雷莫卢单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和透明质酸酶人)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和透明质酸酶人、盐酸罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、Rubidomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、司兰索胸膜内气溶胶(Talc)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、索马杜林储库型(乙酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(Talc)、Steritalc(Talc)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、Tagrisso(奥斯替尼)、Talc、Talimogene Laherparepvec、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼罗替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Tecentriq(阿特朱单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-局部用)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(替西罗莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、三氟尿苷和盐酸替比嘧啶、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(地妥昔单抗)、三乙酸尿苷、VAC、凡得他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉吡坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VelP、Velban(硫酸长春花碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春花碱)、维罗非尼、Venclexta(维奈托克)、维奈托克、Verzenio(阿贝西利)、Viadur(乙酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三乙酸尿苷)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(亚叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地诺单抗)、Xofigo(镭223二氯化物)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yervoy(易普利单抗)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(Ziv-阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、Zelboraf(维罗非尼)、Zevalin(替伊莫单抗Tiuxetan)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(乙酸戈舍瑞林)、唑来磷酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来磷酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)、和/或Zytiga(乙酸阿比特龙)。

1.抗体

(1)一般抗体

本文在广义上使用术语“抗体”，并且该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子以外，术语“抗体”中还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，并且还公开了人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段。可使用本文所述的体外测定或类似方法测试抗体所需的活性，然后根据已知的临床试验方法来测试它们的体内治疗和/或预防活性。存在以下五大类人类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些还可以分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员将识别小鼠的可比类。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均匀的抗体群中获得的抗体，即，除了可能存在于抗体分子的小亚群中自然发生的突变外，群中的单个抗体是相同的。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的拮抗活性。

可使用产生单克隆抗体的任何程序制备所公开的单克隆抗体。例如，所公开的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein，自然(Nature)，256:495(1975)所描述的方法。在杂交瘤方法中，小鼠或其他适当的宿主动物通常用免疫剂免疫以诱导产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将特异性地结合到该免疫剂上。可替换地，淋巴细胞可以在体外免疫。

单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备。可以使用常规程序来容易地对编码所公开的单克隆抗体的DNA进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。抗体库或活性抗体片段也可以使用噬菌体展示技术生成和筛选，例如，如Burton等人的美国专利号5,804,440以及Barbas等人的美国专利号6,096,441所述。

体外方法也适用于制备单价抗体。使用本领域已知的常规技术可以消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例见1994年12月22日出版的WO 94/29348和美国专利号4,342,566中所述的那些。木瓜蛋白酶消化抗体通常产生两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段)，每一个片段都有一个抗原结合位点和一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理后产生了具有两个抗原结合位点并仍能交联抗原的片段。

如本文所用，术语“抗体或其片段”涵盖具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等片段，这些片段包括杂合片段。因此，提供保留结合其特异性抗原能力的抗体片段。这些抗体和片段可以通过本领域已知的技术制备，并且可以根据实例中所述的方法和用于产生抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法来筛选特异性和活性(参见Harlow和Lane，Antibodies,A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988))。

在“抗体或其片段”的含义中还包括抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物。

片段，无论是否附加到其他序列，也可以包括插入、删除、替换或对特定区域或特定氨基酸残基的其他选择修饰，前提是抗体或抗体片段的活性与未经修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可以提供一些额外的特性，诸如去除/添加能够形成二硫键合的氨基酸、延长其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，该抗体或抗体片段必须具有生物活性特性，诸如与其同源抗原的特异性结合。该抗体或抗体片段的功能或活性区域可通过对蛋白质的特定区域进行诱变，然后对表达的多肽进行表达和检测来确定。这些方法对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以包括编码该抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变(Zoller,MJ.Curr.Opin.Biotechnol.3:348-354,1992)。

如本文所用，术语“抗体(antibody或antibodies)”也可指人类抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如，来自小鼠、大鼠或兔子的抗体)在人类中是天然的抗原，因此在施用到人类时会引起不良免疫应答。因此，在这些方法中使用人类或人源化抗体有助于减少给人类施用抗体引起不良免疫应答的可能性。

(2)人类抗体

所公开的人类抗体可以使用任何技术制备。所公开的人类抗体也可以从转基因动物中获得。例如，已经描述了能够在免疫反应中产生全套人类抗体的转基因突变小鼠(参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551-255(1993)；Jakobovits等人，Nature，362:255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.，7:33(1993))。具体而言，在这些嵌合和生殖系突变小鼠中，抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失导致内源性抗体产生完全抑制，而将人类生殖系抗体基因阵列成功地转移到这些生殖系突变小鼠中则导致在抗原攻击时产生人类抗体。如本文所述，使用Env-CD4共受体复合物选择具有所需的活性的抗体。

(3)人源化抗体

抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一个或多个多肽链的DNA序列。据此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或抗体链(或其片段，诸如sFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合部分)，其包含来自整合到人类(受体)抗体框架中的非人类(供体)抗体的抗原结合位点的一部分。

为了产生人源化抗体，来自受体(人类)抗体分子的一个或多个互补决定区(CDR)的残基被来自已知具有所需的抗原结合特性(例如，对目标抗原有一定的特异性和亲和力)的供体(非人类)抗体分子的一个或多个CDR的残基取代。在一些情况下，人类抗体的Fv框架(FR)残基被相应的非人类残基取代。人源化抗体也可能含有既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。实际上，人源化抗体通常是人类抗体，其中一些CDR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代，且一些FR残基可能被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。人源化抗体通常含有抗体恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类抗体恒定区(Jones等人，Nature，321:522-525(1986)，Reichmann等人，Nature，332:323-327(1988)，以及Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。

用于人源化非人类抗体的方法是本领域熟知的。例如，可根据Winter和同事的方法(Jones等人，Nature，321:522-525(1986)，Riechmann等人，Nature，332:323-327(1988)，Verhoeyen等人，Science，239:1534-1536(1988))通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人类抗体的相应序列来生成人源化抗体。可用于产生人源化抗体的方法也描述于美国专利号4,816,567(Cabilly等人)、美国专利号5,565,332(Hoogenboom等人)、美国专利号5,721,367(Kay等人)、美国专利号5,837,243(Deo等人)、美国专利号5,939,598(Kucherlapati等人)、美国专利号6,130,364(Jakobovits等人)和美国专利号6,180,377(Morgan等人)。

2.药物载体/药品的递送

如上所述，这些组合物也可以药用载体的形式施用到体内。“药学上可接受”意指非生物学上或其他方面不良的材料，即，该材料可与核酸或载体一起施用到受试者，不会造成任何不良生物效应或以有害方式与含其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知，该载体将自然地被选择，以最小化该活性成分的任何降解，并最小化该受试者中的任何不利副作用。

可经口服、肠外(例如静脉)、肌肉注射、腹腔注射、经皮、体外、局部等方式施用组合物，包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指通过一个或两个鼻孔将该组合物递送至鼻腔和鼻腔通道，且可包括通过喷雾机制或液滴机制递送，或通过核酸或载体的雾化递送。通过吸入剂的组合物的施用是经鼻腔或口腔、通过喷雾或液滴机制递送。通过插管，递送也可以直接到达呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需组合物的确切数量因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄、体重和一般情况、所治疗过敏性障碍的严重程度、所使用的特定核酸或载体、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切数量。然而，适当的量可以由本领域的普通技术人员通过仅使用本文给出教导的常规实验来确定。

该组合物的肠外施用(如果使用)通常以注射为特征。注射剂可以制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适合在注射前于液体中溶解悬浮液的固体形式，或者是乳剂。最近修订的肠外施用方法包括使用缓释或缓释系统，以保持恒定剂量。参见，例如，美国专利号3,610,795，其通过引用并入本文。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)。它们可能通过抗体、受体或受体配体靶向于特定的细胞类型。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Senter等人，Bioconjugate Chem.，2:447-451，(1991)；Bagshawe、K.D.，Br.J.Cancer，60:275-281，(1989)；Bagshawe等人，Br.J.Cancer，58:700-703，(1988)；Senter等人，Bioconjugate Chem.，4:3-9，(1993)；Battelli等人，CancerImmunol.Immunother.,35:421-425,(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992)；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。“隐形”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的针对结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内小鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向等载体。以下参考文献为利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Hughes等人，Cancer Research,49:6214-6220,(1989)；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta,1104:179-187,(1992))。一般来说，受体参与内吞作用的通路，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白所包被的小窝中，通过网格蛋白所包被的囊泡进入细胞，通过对受体进行分类的酸化的核内体，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化通路具有多种功能，如营养吸收、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节等。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价态和配体浓度，许多受体遵循不止一个细胞内通路。已综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene，DNA and CellBiology 10:6,399-409(1991))。

a)药学上可接受的载体

组合物包括抗体，可在治疗上与药学上可接受的载体结合使用。

合适的载体及其制剂在以下文献中有所描述：Remington:The Science andPractice of Pharmacy(第19版)，A.R.Gennaro编辑，Mack Publishing Company,Easton,PA 1995。通常，在该制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使该制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该溶液的pH值优选为约5至约8，且更优选为约7至约7.5。载体还包括缓释制剂，诸如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透膜基质，其基质为成型制品的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，某些载体可能更可取，例如取决于施用途径和所施用的组合物的浓度。

本领域技术人员已知药物载体。这些通常是给人类施用药物的标准载体，包括无菌水、生理盐水和生理pH下的缓冲液等溶液。这些组合物可以肌肉注射或皮下注射。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

除了所选择的分子，药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，诸如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。

根据是否需要局部或全身治疗以及治疗区域的不同，药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内)、口服、吸入或肠外，例如静脉滴注、皮下、腹腔或肌肉注射。所公开的抗体可经静脉、腹腔、肌肉、皮下、腔内或经皮施用。

用于肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，诸如例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

局部施用制剂可包括软膏、乳液、面霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。传统的药物载体、水、粉末或油性碱、增稠剂等可能是必要的或可取的。

口服施用组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、袋剂或片剂。增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是可取的。

一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸或碱加成盐给予，并通过无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和延胡索酸)反应形成，或无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(如一、二、三烷基和芳基胺及取代乙醇胺)反应形成。

b)治疗用途

可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。组合物的施用剂量范围应足够大，以产生所需的效果，从而影响障碍的症状。剂量不应太大以致引起不利副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病症、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以通过本领域技术人员来确定。如果有任何禁忌症，也可以由个体医生来调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一剂量或多剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到针对适当剂量的指南。例如，在抗体治疗用途的文献中可以找到选择适当剂量抗体的指南，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编，NogesPublications,Park Ridge,N.J.,(1985)第22章和第303-357页；Smith等人，Antibodiesin Human Diagnosis and Therapy，Haber等人编，Raven Press,New York(1977)第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量可能在每天约1μg/kg至100mg/kg体重或以上的范围内。

C.治疗癌症的方法

在一个方面，本文公开了治疗、预防、抑制和/或减弱受试者的癌症和/或转移的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的任何生物响应水凝胶基质。例如，本文公开了治疗、预防、抑制和/或减弱受试者的癌症和/或转移(诸如，具有低PD-L1表达的癌症或选自由以下项组成的组的非免疫原性癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈部癌和/或膀胱癌)的方法，该方法包括向受试者施用生物响应水凝胶基质，该生物响应水凝胶基质包含CD47/SIRPα抑制剂(诸如Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621)和免疫检查点阻断抑制剂(诸如PD-1/PD-L1抑制剂和/或CTLA-4/B7-1/2抑制剂)。

“治疗(Treat、treating或treatment)”及其在本文中使用的语法变体包括组合物的施用，其目的在于部分或完全预防、延迟、治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改进、改善、稳定、减缓和/或降低强度或一种或多种疾病或病症的频率，一种疾病或病症的症状，或一种疾病或病症的根本原因。根据本发明所述的治疗可防范性、预防性、姑息性或补救性地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在出现明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状之后)或在癌症的确定发展之后施用到受试者。预防性施用可在感染症状出现之前一天或数天至数年发生。

在一个方面，在所公开的治疗、预防、抑制和/或减弱受试者的癌症和/或转移的方法中使用的免疫检查点阻断抑制剂包括本领域已知的免疫检查点的任何抑制剂，诸如PD-1/PD-L1阻断抑制剂或CTLA-4/B7-1/2阻断抑制剂(诸如，易普利单抗)。用于所公开的生物响应水凝胶基质中的PD-1/PD-L1阻断抑制剂的实例可包括本领域已知的任何PD-1/PD-L1阻断抑制剂，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、皮地珠单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559。因此，在一个方面，本文公开了治疗、预防、抑制和/或减弱受试者的癌症和/或转移的方法，该方法包括向受试者施用生物响应水凝胶基质，该生物响应水凝胶基质包含CD47/SIRPα抑制剂(诸如，Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621)和免疫检查点阻断抑制剂；其中阻断抑制剂为PD-1/PD-L1阻断抑制剂，诸如纳武单抗、派姆单抗、皮地珠单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和BMS-936559；或CTLA-4/B7-1/2抑制剂，诸如易普利单抗。应当理解并且在本文中预期，生物响应水凝胶基质可设计为同时包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种阻断抑制剂。

在一个方面，所公开的治疗、预防、抑制和/或减弱癌症和/或转移的方法可包括以适用于治疗受试者的特定癌症的任何频率施用药物组合物或生物响应水凝胶基质，该方法包括向受试者施用本文所公开的任何治疗剂递送载体或药物组合物以及生物响应水凝胶基质，包括但不限于包含CD47/SIRPα抑制剂(诸如，Hu5F9-G4、CV1、B6H12、2D3、CC-90002和TTI-621)和免疫检查点阻断抑制剂)。例如，药物组合物和/或生物响应水凝胶基质可至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用给患者。在一个方面，药物组合物和/或生物响应水凝胶基质每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。

如本文所公开的，生物响应水凝胶基质支架可设计为当水凝胶响应于肿瘤微环境中的因素而发生降解时，释放封装在水凝胶中的任何CD47/SIRPα抑制剂、免疫检查点阻断抑制剂和/或附加抗癌剂。因此，本文公开了治疗、预防、抑制和/或减弱受试者的癌症和/或转移的方法，其中生物响应水凝胶基质包含生物响应支架，该生物响应支架在暴露于肿瘤微环境内的因子时将CD47/SIRPα抑制剂、免疫检查点阻断抑制剂和/或其他封装的抗癌剂释放至肿瘤微环境中。在一个方面，生物响应水凝胶包括活性氧(ROS)可降解水凝胶。应当理解并且在本文中预期，由生物响应水凝胶基质将CD47/SIRPα抑制剂、免疫检查点阻断抑制剂和/或任何其他封装的抗癌剂释放至肿瘤微环境中受到微环境的影响。在一个方面，本文公开了治疗、预防、抑制和/或减弱受试者的癌症和/或转移的方法，其中生物响应水凝胶基质将CD47/SIRPα抑制剂、免疫检查点阻断抑制剂和/或任何其他封装的抗癌剂释放至肿瘤微环境中至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。

在一个方面，本文所公开的施用给受试者以供所公开的方法中使用的药物组合物和/或生物响应水凝胶基质的量可包括医师所确定的适用于治疗受试者的特定癌症的任何量。例如，药物组合物和/或生物响应水凝胶基质的量可为约10mg/kg至约100mg/kg。例如，所施用的药物组合物、所施用的生物响应水凝胶的量可为至少10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg。因此，在一个方面，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，其中施用的药物组合物和/或生物响应水凝胶基质的剂量为约10mg/kg至约100mg/kg。

如上所述，应当理解并且在本文中预期，所公开的治疗、预防、抑制和/或减弱受试者的癌症和/或转移的方法可进一步包括施用将进一步有助于减弱、抑制、治疗和/或消除癌症和/或转移的任何抗癌剂(诸如，吉西他滨)。用于本文所公开的减弱、抑制、治疗和/或消除受试者的癌症和/或转移的方法的可在所公开的生物响应水凝胶中使用或用作除了所公开的药物组合物和/或生物响应水凝胶基质以外的附加治疗剂的抗癌剂可包括本领域已知的任何抗癌剂，包括但不限于阿贝西利、乙酸阿比特龙、Abitrexate(甲氨蝶呤)、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米微粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、Adcetris(本妥昔单抗)、ADE、Ado-曲妥珠单抗Emtansine、Adriamycin(盐酸阿霉素)、马来酸阿法替尼、Afinitor(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼)、Aldara(咪喹莫特)、阿地白介素、Alecensa(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿仑单抗、Alimta(培美曲塞二钠)、Aliqopa(盐酸Copanlisib)、用于注射的爱克兰(盐酸美法仑)、爱克兰片(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布加替尼)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥)、Amboclorin苯丁酸氮芥)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、Aredia(帕米磷酸二钠)、Arimidex(阿那曲唑)、Aromasin(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、菊欧文氏菌天冬酰胺酶、阿特朱单抗、安维汀(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、Becenum(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(Inotuzumab奥佐米星)、贝伐单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、博纳吐单抗、Blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、Bosulif(博舒替尼)、博舒替尼、本妥昔单抗、布加替尼、BuMel、白消安、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、Cabometyx(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、Campath(阿仑单抗)、Camptosar、(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Carac(氟尿嘧啶-局部用)、卡铂、卡铂-TAXOL、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、Casodex(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼、Cerubidine(盐酸Daunombicin)、Cervarix(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-强的松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、盐酸Copanlisib、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(更生霉素)、Cotellic(考比替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫卢单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、更生霉素、达雷木单抗、Darzalex(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸Daunombicin和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素-白喉毒素连接物、地诺单抗、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地妥昔单抗、多西他赛、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、德瓦鲁单抗、Efudex(氟尿嘧啶-局部用)、Elitek(拉布立酶)、Ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗、Eloxatin(奥沙利铂)、艾曲波帕乙醇胺、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、Erivedge(维莫德吉)、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(菊欧文氏菌天冬酰胺酶)、Ethyol(氨磷汀)、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射)、5-FU(氟尿嘧啶-局部用)、Fareston(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludara(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶-局部用)、氟尿嘧啶注射、氟尿嘧啶-局部用、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、FolexPFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、加卫苗(重组HPV四价疫苗)、加卫苗9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(阿妥珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、GEMOTABINE-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗-奥佐米星、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入物)、羧肽酶、乙酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、Herceptin(曲妥珠单抗)、HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、重组Hycamtin(盐酸拓扑替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗Tiuxetan、依鲁替尼、ICE、Iclusig(盐酸帕纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、Imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、Inotuzumab奥佐米星、干扰素α-2b、重组白介素-2(阿地白介素)、Intron A(重组干扰素α-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、易普利单抗、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、柠檬酸伊沙佐米、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗Emtansine)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(派姆单抗)、Kisqali(瑞博西尼)、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、乙酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(苯丁酸氮芥)、乙酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(三氟尿苷和盐酸替比嘧啶)、Lupron(乙酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(乙酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(乙酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸甲基苄肼)、盐酸氮芥、乙酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPL(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、Myleran(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥珠单抗-奥佐米星)、纳米微粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米微粒制剂)、Navelbine(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、Nerlynx(马来酸来那替尼)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、Neulasta(聚乙二醇非格司亭)、Neupogen(Lilgrastim)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼罗替尼、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武单抗、Nolvadex(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿妥珠单抗、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕尼、奥拉单抗、高三尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素-白喉毒素连接物)、Opdivo(纳武单抗)、OPPA、奥斯替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米微粒制剂、PAD、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米磷酸二钠、帕尼单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素α-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸甲基苄肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(地诺单抗)、Promacta(艾曲波帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、雷莫卢单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和透明质酸酶人)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和透明质酸酶人、盐酸罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、Rubidomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、司兰索胸膜内气溶胶(Talc)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、索马杜林储库型(乙酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(Talc)、Steritalc(Talc)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、Tagrisso(奥斯替尼)、Talc、Talimogene Laherparepvec、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼罗替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Tecentriq(阿特朱单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-局部用)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(替西罗莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、三氟尿苷和盐酸替比嘧啶、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(地妥昔单抗)、三乙酸尿苷、VAC、凡得他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉吡坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VelP、Velban(硫酸长春花碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春花碱)、维罗非尼、Venclexta(维奈托克)、维奈托克、Verzenio(阿贝西利)、Viadur(乙酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三乙酸尿苷)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(亚叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地诺单抗)、Xofigo(镭223二氯化物)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yervoy(易普利单抗)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(Ziv-阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、Zelboraf(维罗非尼)、Zevalin(替伊莫单抗Tiuxetan)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(乙酸戈舍瑞林)、唑来磷酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来磷酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)、和/或Zytiga(乙酸阿比特龙)。

所公开的组合物可用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病(诸如癌症和转移)，包括但不限于具有低PD-L1表达的癌症或非免疫原性癌症。所公开的组合物可用于治疗的代表性但不限于以下的癌症列表：淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金病、骨髓性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等肺癌、神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔鳞癌、咽喉鳞癌、喉癌和肺鳞癌、宫颈癌、子宫颈癌、乳腺癌、以及上皮癌、肾癌、泌尿生殖道癌、肺癌、食管癌、头颈癌、大肠癌、造血癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。

D.实例

提出以下实例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示范而非旨在限制公开。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，温度为℃或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

1.实例1：用于增强的免疫疗法的aPD1和aCD47抗体的活性氧响应蛋白质复合物

a)生物响应抗体复合物的形成

ROS响应抗体复合物经由ROS响应交联剂：双-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的2,2'-[丙烷-2,2-二基双(硫代)]二乙酸(NHS-IE-NHS)通过交联aPD1和aCD47而得到。简而言之，此蛋白质复合物经由两个步骤制备：1)将aPD1和白蛋白与NHS-IE-NHS混合以形成aPD1(白蛋白)核心复合物；2)加入aCD47、附加白蛋白和NHS-IE-NHS，以允许aCD47(白蛋白)涂覆在预合成的aPD1(白蛋白)核上。所获得的[email protected]复合物示出了较高的抗体结合效率(约90％)。核心复合物的平均直径为96nm，并且最终核-壳复合物示出了220nm的增加的尺寸(图1B和1C)。元素映射进一步验证了蛋白质复合物中的aPD1(钙螯合)和aCD47(钆螯合)的核-壳分布(图1D)。

为了验证复合物的ROS响应解离行为，将蛋白质复合物溶于含有500μM H₂O₂的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。经由动态光散射和TEM成像来观察复合物的解离(图1E)。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来对aPD1和aCD47的释放曲线进行定量。与预期一致，aPD1和aCD47从含有H₂O₂的PBS溶液中的复合物中释放，而在纯PBS溶液中释放的抗体量最小(图1F)。如预期那样，首先释放aCD47，然后是aPD1的释放。这种aPD1和aCD47的不同释放行为促进了它们在TME中的相应作用。此外，ROS敏感接头可有效地清除PBS溶液中的H₂O₂(图1G)。

b)复合物的ROS清除效应

在肿瘤发展过程中，癌症中的ROS水平升高，这通常与免疫抑制性TME相关联，增加了肿瘤迁移、侵入和耐药的可能性。考虑到复合物捕获ROS的能力，研究了TME中的ROS水平和不同免疫细胞的免疫应答。如预期那样，在瘤间(i.t.)注射空白复合物(由IgG抗体形成)后，TME中的ROS水平显著降低(图2A和2B)。已知ROS敏感信号和氧化还原敏感转录因子NF-kB刺激异常癌细胞增殖，并且提升基质金属蛋白酶(MMP)水平，促进肿瘤的侵入过程和转移过程。因此，在用ROS敏感空白复合物处理后，还检查了肿瘤中NF-kB和MMP-2的表达。与对照组(未处理)相比，观察到肿瘤中NF-kB和MMP-2两者的明显下调(图2C)。

为了进一步研究在使用空白复合物剥夺ROS后由氧化应激介导的免疫效应，检查了不同的免疫细胞群，该免疫细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)。尽管MDSC(CD45⁺CD11b⁺Gr-1⁺)没有明显降低，但在注射空白复合物的肿瘤中观察到M2型TAM(CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD206^hl)和Treg(CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺)的显著减少(图2D、2E和2F)。此外，肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞(CD3⁺,TIL)和细胞毒性T淋巴细胞(CD3⁺CD8⁺,CTL)的百分比也略有增加(图2G和图3)。综上所述，使用ROS响应复合物清除TME中的ROS可抑制NF-kB和MMP-2的表达，减少免疫抑制性细胞，并且增强有效T细胞的浸润(图2H)。

c)由CD47阻断诱导的免疫应答

包括树突状细胞(DC)和巨噬细胞在内的先天免疫细胞经由吞噬作用和抗原的呈递，在适应性免疫系统的启动中起到重要作用。然而，癌细胞通常可通过上调CD47(“别吃我”信号)的表达来逃避吞噬作用。为了验证aCD47可促进巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，首先在体外研究了癌细胞与巨噬细胞之间的相互作用。将用绿色荧光信号标记的骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)与红色荧光标记的B16F10细胞进行孵育，该细胞已用IgG或aCD47抗体预孵育。与IgG处理的B16F10细胞相比，更多的用aCD47预孵育的癌细胞由BMDM吞噬(图4A和4B)。为了验证aCD47活化抗肿瘤免疫应答的能力，将aCD47复合物瘤间注射至肿瘤中。更多的包括巨噬细胞和DC的吞噬细胞浸润至肿瘤中(图4C)。为了进一步评估aCD47治疗后的免疫应答，通过流式细胞术研究DC刺激。观察到DC成熟(CD80⁺CD86⁺)显著增加以及CD103⁺DC的百分比增加，这对抗原传输、T细胞活化和扩增以及完整的抗肿瘤免疫至关重要(图4D和4E)。

d)使免疫调节有效载荷的释放得到延伸的复合物

考虑到抗体复合物的独特的核-壳结构，复合物表面上的aCD47可与癌细胞结合，从而延长了肿瘤中的抗体的保留时间。为了验证这一点，在体内研究免疫调节抗体的保留。aPD1和aCD47分别用花菁5.5(aPD1-Cy5.5)和吲哚菁绿(aCD47-ICG)进行标记。然后，向小鼠中的肿瘤位点注射“游离的aPD1和aCD47”或“[email protected]复合物”制剂，并且在注射后的不同时间点处使用体内荧光成像系统来进行监测。据观察，来自游离aPD1-Cy5.5的信号在随后的三天内迅速减少，证明aPD1迅速扩散出肿瘤，而封装在复合物的核中的aPD1-Cy5.5仍在肿瘤中表现出所观察到的aPD1信号(图5A)。aCD47的信号在两组中为相当的，证实了aCD47与癌细胞之间的有效结合，这也促进了复合物的保留(图5B)。此外，肿瘤切片的共聚焦成像进一步证实了aPD1在肿瘤中的延长的保留，其中在注射[email protected]复合物的小鼠中观察到更强的aPD1的红色信号(图5C)。

e)[email protected]复合物在体内的抗肿瘤功效

然后，在体内评估基于[email protected]复合物的组合疗法的抗肿瘤活性。将患有黑色素瘤B16F10肿瘤的C57BL6小鼠随机分为五组：未处理(G1)、aPD1复合物(在核和壳两者中的aPD1，每只小鼠100μg)(G2)、aCD47复合物(在核和壳两者中的aCD47，每只小鼠100μg)(G3)、[email protected]复合物(在壳中的aCD47，每只小鼠50μg；在核中的aPD1，每只小鼠50μg)(G4)，以及游离的aPD1和aCD47(aCD47：每只小鼠50μg，aPD1：每只小鼠50μg)。在接下来的几天，通过生物发光成像来监测肿瘤的生长，并通过传统卡尺测得(图6A、6B和6C)。用[email protected]复合物处理的小鼠的肿瘤生长显著慢于其他四组。与经aPD1复合物或aCD47复合物处理的组相比，[email protected]复合物处理取得了明显的协同效应。值得注意的是，由于游离的aPD1的迅速扩散，经游离抗体处理的组中的肿瘤生长仅在头两天受到抑制。此外，不同组中的小鼠的体重未受影响。

为了研究不同处理后的肿瘤中的免疫应答，在处理五天后收集肿瘤并且通过流式细胞术和免疫荧光成像来进行分析。与未处理组相比，比其他四个处理组更多的TIL(CD3⁺细胞)浸润至小鼠的肿瘤中。此外，在用[email protected]复合物处理后，肿瘤中的CD4⁺细胞和CD8⁺T细胞的绝对数量显著增加(图6D、6E、6F和6G)。免疫荧光成像直观地表明，有更多的CD8⁺细胞膨胀至用[email protected]复合物处理后的肿瘤中。总的来说，这些观察结果表明，使用[email protected]复合物的组合疗法触发了增强的T细胞介导的抗癌免疫应答。

接下来，研究了局部注射[email protected]复合物是否可诱导全身免疫应答以抑制癌症转移。将B16F10肿瘤细胞接种在每只小鼠的左右两胁。向作为原发性肿瘤的右胁中的肿瘤注射[email protected]复合物，而相反位点上的远处肿瘤未经处理，以模拟癌症转移(图7A)。在注射[email protected]复合物的小鼠中，肿瘤的生物发光信号和肿瘤的尺寸显著降低。值得注意的是，对于在其原发性肿瘤中注射[email protected]复合物的小鼠，该小鼠的远处肿瘤也得到有效抑制(图7B和1C)。与这些结果一致，经[email protected]复合物处理的小鼠中的原发性肿瘤和远处肿瘤的重量也显著下降，这与CD3⁺TIL的百分比的增加相一致(图7D、7E、7F)。此外，CD8⁺和CD4⁺ T细胞的瘤间百分比也在经处理的小鼠中的原发性肿瘤和远处肿瘤两者中显著增加(图7G和7H)。综上所述，这些结果表明，局部注射[email protected]复合物可活化全身免疫应答以抑制潜在转移。

f)讨论

在此研究中，设计了使用ROS敏感接头以用于增强免疫检查点阻断的基于蛋白质的复合物，该复合物包含在核中的aPD1和在壳中的aCD47。在TME中产生的ROS通常作为免疫系统中的信号传导信使而起到重要作用，这与肿瘤相关免疫抑制和T细胞的功能障碍相关联。本文示出了通过生物响应蛋白质复合物可实现协同治疗功效。考虑到TME中丰富的ROS和独特的核-壳结构，[email protected]复合物可依次从外壳释放aCD47，从内核释放aPD1。所释放的aCD47阻断肿瘤细胞中“别吃我”信号，促进先天免疫系统对癌细胞的识别并活化T细胞免疫应答。随后进一步释放的aPD1可阻断TIL上的PD-1，增加同种异体反应性T细胞群。aCD47在蛋白质复合物的表面上分布可延长抗体在肿瘤中的保留时间。此外，ROS响应接头不仅有助于抗体的控释，而且作为ROS的清除剂以逆转免疫抑制性TME。观察到NF-kB和MMP-2的表达下调、包括TAM和Treg的免疫抑制性细胞减少，以及肿瘤中的有效T细胞的浸润增强。此外，ROS响应蛋白质复合物的局部治疗可生成全身抗肿瘤免疫应答，该免疫应答不仅可抑制原发性肿瘤生长，还可预防癌症转移的可能性。

总之，生物响应蛋白质复合物可有效逆转免疫抑制性TME并且促进免疫检查点阻断。复合物中的aCD47和aPD1的独特的核-壳分布延长了抗体的保留时间并且实现了抗体在肿瘤位点中的依次释放。然而，与蛋白质复合物相关联的参数需要进一步优化，诸如优化ROS响应线型以及aCD47和aPD1的百分比。

g)材料和方法

(1)[email protected]复合物的制备和表征。

为了合成ROS响应交联剂，将2,2'-[丙烷-2,2-二基双(硫代)]二乙酸(5.0mg，1当量)、EDC(6.9mg，2当量)和NHS(5.1mg，2当量)在二甲基亚砜(DMSO)中混合并在室温下搅拌6小时。为了获得aPD1核心复合物，将来自小鼠血清的白蛋白(20当量)和aPD1(1当量)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合，然后缓慢加入DMSO中的ROS响应交联剂(200当量)。该混合物在4℃下搅拌过夜。在20000rpm下离心以去除游离的白蛋白或抗体后，所获得的aPD1核心复合物被纯化。之后，将附加白蛋白(20当量)、aCD47(1当量)和ROS响应交联剂(200当量)加入aPD1复合物溶液中并在4℃下搅拌过夜。在20000rpm下离心以去除游离的白蛋白或抗体后，所获得的[email protected]复合物被纯化。按照相同程序，使用来自大鼠的IgG来制备对照空白复合物，以取代相对抗体。

(2)表征。

aPD1复合物和[email protected]复合物的大小分布和形态分别由动态激光散射(DLS)和TEM(JEOL 2000FX)测得。使用分析TEM(Titan)对抗体在复合物中的分布进行表征(aCD47和aPD1分别螯合钆和钙的。由ELISA(大鼠IgG总ELISA试剂盒，eBioscience，目录号88-50490-22；兔IgG总ELISA试剂盒，Thermo Fisher，目录号15137)测量复合物中缀合的不同抗体(来自大鼠血清的IgG表示aCD47，来自兔血清的IgG表示aPD1)的量。

(3)体外吞噬测定。

用CellTracker Green(C7025,Thermo-Fisher Scientific)对从C57BL/6小鼠体分离出的骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)进行染色，用CellTracker DeepRed(C34565,Thermo-Fisher Scientific,USA)对B16F10细胞进行染色。用IgG或aCD47阻断癌细胞，然后在无血清培养基中与巨噬细胞共培养。在37℃下培养2h后，使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710)和CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)以研究巨噬细胞对癌细胞的吞噬行为。

(4)体内肿瘤模型和治疗。

为了测量[email protected]复合物的组合治疗效应，将fLuc-B16F10黑色素瘤细胞(1x10⁶)皮下(s.c.)注射至每只C57BL/6小鼠的右胁中。七天后，将小鼠随机分为五组(n＝6)。向小鼠瘤内注射(i.t.)不同制剂，该不同制剂包括aCD47复合物(aCD47：每只小鼠100μg)、aPD1复合物(aPD1：每只小鼠100μg)、[email protected]复合物(aCD47：每只小鼠50μg，aPD1：每只小鼠50μg)、游离aPD1和游离aCD47(aCD47：每只小鼠50μg，aPD1：每只小鼠50μg)。对于转移性肿瘤模型，将总共1x10⁶个fLuc-B16F10黑色素瘤细胞皮下注射至每只C57BL/6小鼠的两胁。一周后，将[email protected]复合物(aCD47：每只小鼠50μg，aPD1：每只小鼠50μg)瘤内注射至每只小鼠的右胁的肿瘤中。测量肿瘤的体积，并根据以下式对其进行计算：宽度²x长度x0.5。也通过体内成像仪器(IVIS)Spectrum系统(Perkin Elmer Ltd)来观察肿瘤的生长。将d-荧光素(Thermo Scientific^TM Pierce^TM)(0.15mg/g)腹腔注射至每只小鼠十分钟后，对小鼠进行成像，曝光时间为5分钟。当示出健康状态不完美的迹象或其肿瘤尺寸超过1.5cm³时，对动物实施安乐死。

(5)材料、细胞系和动物。

包括2,2'-[丙烷-2,2-二基双(硫代)]二乙酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在内的所有化学品均购自Sigma-Aldrich。来自小鼠血清的白蛋白、来自大鼠血清的免疫球蛋白G(IgG)和来自兔血清的IgG均购自Sigma-Aldrich。抗CD47抗体(aCD47)(目录#127518,Clone:miap301)和抗PD1抗体(aPD1)(目录#135233，克隆：29F.1A12)购自Biolegend Inc。小鼠B16F10黑色素瘤细胞系购自UNC组织培养设施。B16F10-luc细胞为北卡罗来纳大学教堂山分校Leaf Huang博士的馈赠。在37℃和5％的CO₂下，细胞在含有100U/mL青霉素(Invitrogen)和10％胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)的Dulbecco's改良伊格尔培养基(Gibco,Invitrogen)中进行培养。雌性C57BL/6小鼠(6-10周龄)购自Jackson实验室。所有小鼠研究均按照北卡罗来纳大学教堂山分校和北卡罗来纳州立大学实验动物管理和使用委员会批准的方案来进行。

(6)流式细胞术。

为了研究肿瘤中的不同免疫细胞，将从小鼠收集的经过不同处理的肿瘤切成小块，并且在冷染色缓冲液中加以均质化以形成单细胞。细胞用荧光标记的抗体CD45(Biolegend，目录号103108,Clone:30-F11)、CD11b(Biolegend，目录号101212,Clone:Ml/70)、F4/80(Biolegend，目录号123128,Clone:BM8)、CD80(Biolegend，目录号104708,Clone:16-10A1)、CD206(Biolegend，目录号141706,Clone:C068C2)、Gr-1(Biolegend，目录号108408,Clone:RB6-8C5)、CD3(Biolegend，目录号100236,Clone:17A2)、CD8(Biolegend，目录号100734,Clone:53-6.7)、CD4(Biolegend，目录号100406,Clone:GK1.5)、Foxp3(Biolegend，目录号126404,Clone:MF-14)、CDllc(Biolegend，目录号117310,Clone:N418)、CD86(Biolegend，目录号105028,Clone:GL-1)和CD103(Biolegend，目录号121406,Clone:2E7)按照制造商的说明来进行染色。这里使用的所有抗体均稀释200倍。染色的细胞在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)上加以测量，并且由FlowJo软件包(10.0.7版；TreeStar，USA，2014)进行分析。

(7)免疫荧光染色。

从不同组中的小鼠收获肿瘤，并且在最佳切割温度(OCT)培养基中冷冻。肿瘤经由冷冻切片机加以切割，安装在载玻片上，并且用CD8(Abeam，目录号ab22378)一抗在4℃下染色过夜。随后，加入荧光标记的山羊抗大鼠IgG(H+L；Thermo Fisher Scientific，目录号A18866)二抗。使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710)来记录载玻片。实验中使用的所有这些抗体均稀释了200倍。

(8)蛋白质印迹。

将具有由二喹啉甲酸蛋白质测定试剂盒(BCA)确定的等量的蛋白质的每个样品与等体积的2×Laemmli缓冲液混合，并在95℃下煮沸5min。完成凝胶电泳和蛋白质转化后，根据制造商的说明，将抗NF-kB p65抗体(Abeam，目录号ab237591)、抗MMP2抗体(Abeam，目录号ab92536)和抗β-肌动蛋白抗体(Abeam，目录号ab8226)用作一抗。将包括山羊抗小鼠抗体(Novus Biologicals，目录号：NBP1-75151)和山羊抗兔抗体(Novus Biologicals，目录号：NBP2-30348H)在内的二抗用于这些印迹。

(9)统计分析。

如图所示，所有结果均表示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)。图基事后检验和单因素方差分析(ANOVA)用于多重比较，并且双尾学生t检验用于两组比较。通过对数秩检验确定生存益处。所有统计分析均由Prism软件包(PRISM 5.0；GraphPad Software,USA,2007)进行。统计显著性的阈值为P<0.05。

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