阅读说明：本技术 一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法 (Method for measuring quality of conidia of corynebacterium polystachyum ) 是由 柴阿丽 李宝聚 赵倩 石延霞 谢学文 李磊 范腾飞 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法。所述测定方法包括如下步骤：将供试多主棒孢菌菌株进行活化和扩繁,利用粘附材料粘取多主棒孢菌分生孢子,利用差值法得到多主棒孢菌孢子粉的质量；配制多主棒孢菌分生孢子悬浮液；吸取悬浮液并滴加至血球计数板的表面,在光学显微镜下统计计数区多主棒孢菌分生孢子的数量,按照式1得到单个孢子的质量。本发明利用分析天平对孢子粉的质量进行称量,操作简单,无需特殊仪器设备,适用于绝大多数真菌物种；在光学显微镜下利用血球计数板定量计数区观察到的孢子个数,不仅能有效解决真菌孢子个体微小,肉眼无法直接计数的问题,而且仅对计数区的孢子个数进行统计,避免了对全部样品个数进行统计耗时、费力的过程。(The invention discloses a method for measuring the quality of conidia of a polyspora clavuligera. The determination method comprises the following steps: activating and propagating the tested corynespora polybotrya strain, picking up the conidia of the corynespora polybotrya by using an adhesive material, and obtaining the quality of the spore powder of the corynespora polybotrya by using a difference method; preparing a conidium suspension of the corynebacterium polystachyum; and (3) sucking the suspension, dropwise adding the suspension onto the surface of a blood counting chamber, counting the number of conidia of the corynebacterium polybotrys in the counting area under an optical microscope, and obtaining the quality of a single spore according to the formula 1. The method utilizes the analytical balance to weigh the mass of the spore powder, is simple to operate, does not need special instruments and equipment, and is suitable for most fungal species; the spore number observed in the quantitative counting area of the blood counting chamber is utilized under an optical microscope, so that the problems that fungal spore individuals are small and naked eyes cannot count directly can be effectively solved, the spore number in the counting area is only counted, and the time-consuming and labor-consuming process of counting all the sample numbers is avoided.)

一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法，属于微生物技术领域。

背景技术

多主棒孢菌Corynespora cassiicola是一种世界性真菌，在中国、美国、荷兰、日本等57个国家普遍发生。该菌寄主范围非常广泛，可侵染90科252属349种作物，主要包括蔬菜、水果、花卉、谷物、林木等，其中对橡胶、棉花、大豆等经济作物，以及黄瓜、番茄、豇豆等蔬菜的危害最为严重。2005年以来，我国蔬菜棒孢叶斑病每年发生面积超过1000万亩，经济损失超过50亿元。尤其是黄瓜棒孢叶斑病，至今已遍及北京、山东、辽宁等19个省市区，田间发病率一般为10％～25％，严重时可达60％～70％，甚至100％，对产业发展构成严重威胁。

空气传播是造成病原真菌广寄主和宽地域分布的根本原因，是导致病害短时间、大面积暴发的重要途径。多主棒孢菌侵染植株后，在发病部位表面产生病征(分生孢子梗和分生孢子)，孢子成熟后释放并随气流快速扩散。田间从出现中心病株到整棚(田)发病，一般需要5天，最快2天即可完成整个过程。开展真菌气传研究是遏制病害传播蔓延的关键，对作物绿色、安全、优质生产具有重要指导意义。

分生孢子是真菌的无性孢子，具有抵抗高温、低温、干燥和营养缺乏等不良环境的能力，同时也是真菌病害的重要传播媒介。作为病原物的传播体，孢子质量与其浮力和沉降速度直接相关，决定着传播距离和高度，并明显地随物种变化，是影响病害流行的一个重要因素。

绝大部分真菌的孢子均为微米级，个体极其微小，现有仪器设备不能直接实现单个分生孢子质量的准确称量。至今仍没有称量真菌孢子质量的合适方法。明确孢子质量是开展真菌气传研究工作的基础，更是长久以来病原流行病学研究亟待解决的科学问题，无论是在理论上还是在实践中都具有不可忽视的意义。因此，急切需要寻找一种新的快速、简便称量真菌孢子质量的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法，操作简单、步骤简便、适用性强，能够称量真菌分生孢子质量的方法，解决了真菌传播流行研究的迫切需求。本发明方法能够实现绝大部分真菌孢子质量的称量，有助于真菌学家模拟预测病菌传播轨迹，推动真菌流行病学的进一步发展。

本发明采用分析天平称量大量孢子粉的质量，将不可实现的个体研究转化为可操作的群体研究，能有效解决无仪器设备可用的难题；在光学显微镜下利用血球计数板定量观察到的孢子个数，能有效解决真菌孢子个体微小，肉眼无法直接识别统计的问题；另外，仅需对血球计数板0.1mm³计数区的孢子个数进行统计，避免了对全部样品个数进行统计耗时、费力的过程。

本发明通过如下方法实现多主棒孢菌分生孢子质量的测定：收集多主棒孢菌孢子粉并称重、制备多主棒孢菌孢悬液、统计血球计数板计数区内多主棒孢菌分生孢子个数、通过公式计算多主棒孢菌单个分生孢子的质量。

具体地，本发明提供的多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法，包括如下步骤：

S1、将供试多主棒孢菌菌株进行活化和扩繁，利用粘附材料粘取多主棒孢菌分生孢子，利用差值法得到多主棒孢菌孢子粉的质量；

S2、配制多主棒孢菌分生孢子悬浮液；

S3、吸取所述多主棒孢菌分生孢子悬浮液并滴加至血球计数板的表面，在光学显微镜下统计计数区多主棒孢菌分生孢子的数量，按照下述式(1)得到单个孢子的质量：

上述的测定方法中，步骤S1中，在如下条件下进行活化：

在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行，于28℃黑暗培养5天；

在如下条件下进行扩繁：

在28℃、波长为265nm、高度为50cm的紫外光下照射培养10天。

上述的测定方法中，步骤S1中，所述粘附材料为称量纸；

所述称量纸的大小为3～3.5cm×1～1.5cm。

上述的测定方法中，步骤S1中，按照下述方法得到多主棒孢菌孢子粉的质量：

将粘附有多主棒孢菌分生孢子的所述粘附材料置于无菌离心管中，然后进行离心；所述离心结束后，称量所述离心管和所述多主棒孢菌孢子粉的总质量，进而得到所述多主棒孢菌孢子粉的质量；

离心时，用管盖压住上述粘附材料的边侧，防止在离心时压缩在离心管底部。

上述的测定方法中，所述离心的条件为：

转速为8000～12000rpm，时间为1～2min。

上述的测定方法中，步骤S2中，采用体积含量为70％的乙醇水溶液配制所述多主棒孢菌分生孢子悬浮液。

上述的测定方法中，步骤S2中，配制所述多主棒孢菌分生孢子悬浮液的过程中，添加研磨珠进行涡旋振荡；

所述研磨珠的直径为1～3mm，每个离心管中添加6～10粒所述研磨珠，涡旋振荡时间为3～5s。

上述的测定方法中，步骤S3中，所述光学显微镜的放大倍数为100倍；

所述血球计数板计数区所述多主棒孢菌分生孢子的数量为随机进行10次取样的平均值。

上述的测定方法中，步骤S3中，当所述多主棒孢菌分生孢子悬浮液的密度为1mg/mL，计数区体积为0.1mm³时，按照式(2)得到单个孢子的质量：

本发明利用分析天平对孢子粉的质量进行称量，操作简单，无需特殊仪器设备，一般微生物实验室均可进行，适用于绝大多数真菌物种。在光学显微镜下利用血球计数板定量计数区观察到的孢子个数，不仅能有效解决真菌孢子个体微小，肉眼无法直接计数的问题；而且仅对计数区的孢子个数进行统计，避免了对全部样品个数进行统计耗时、费力的过程。本发明大大提高了称量真菌孢子质量的速度和可行性，便于其他真菌工作者的后续研究。

附图说明

图1为不同类型孢子粘附材料对多主棒孢菌收集情况示意图；其中，图1A1、图1A2和图1A3分别为用于孢子收集的称量纸、锡箔纸、普通打印纸；图1B1、图1B2、图1B3分别为离心后称量纸、锡箔纸、普通打印纸的离心管；图1C1、图1C2、图1C3分别为离心后的称量纸、锡箔纸、普通打印纸。

图2为多主棒孢菌孢悬液的配置及其显微视野；其中，图2A和图2B分别为用无菌水和70％乙醇溶液在离心管中配置得到的孢悬液；图2C和图2D分别为离心管中不加研磨珠和添加研磨珠震荡后孢悬液的显微视野。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的多主棒孢菌分生孢子质量的测定方法，包括多主棒孢菌孢子粉的收集和称重、配置孢悬液、统计血球计数板计数区孢子个数等步骤，具体包括如下步骤：

1)将活化的供试多主棒孢菌菌株在紫外光下进行扩繁(28℃下培养10天)，以诱导大量产孢。待菌落长满培养基时，使用称量纸粘附孢子粉，在1.5mL无菌离心管中12000rpm，离心2min，将孢子粉收集到离心管底部，通过质量差值法计算得到孢子粉的质量。

2)使用体积分数为70％的乙醇溶液，配制密度为1mg/mL的孢悬液，该过程通过添加研磨珠并进行涡旋振荡，确保孢子分散彻底、孢悬液均一稳定。

3)取10μL配置好的孢悬液，滴加到血球计数板计数区，在100倍光学显微镜下统计体积为0.1mm³计数区内多主棒孢菌分生孢子的数量，为随机进行10次取样的平均值。

4)通过简化的质量计算公式(式(2))计算得到单个多主棒孢菌分生孢子的质量。

本发明以多主棒孢菌菌株GS1(“武军.我国多主棒孢菌遗传多样性研究.中国农业科学院，2019.”)为试验材料，每次重复孢子粉的质量进行三次称量取平均值，血球计数板计数区孢子个数为10次取样统计的平均值，共设三次重复。结果表明：多主棒孢菌单个分生孢子的质量为5.69±0.67ng。

实施例1、孢子粉最佳粘附材料的筛选

将洁净的粘附材料在长满培养基的多主棒孢菌平板上轻轻粘压，使粘附材料表面粘取一层孢子粉。然后使用镊子小心地将粘附孢子粉的材料放入空的1.5mL无菌离心管中，用管盖压住材料的边侧，12000rpm，离心2min。

设置称量纸、锡箔纸、普通打印纸共3种材料，通过观察离心后离心管底部收集到的孢子粉量以及离心后粘附材料表面的洁净程度，筛选出最佳的孢子粉粘附材料。

结果如图1所示，易于孢子被离心下来的材料为称量纸和锡箔纸，而普通打印纸离心后仍有大量的孢子残留。另外离心后，装有称量纸的离心管底部的孢子粉量明显多于装有锡箔纸的离心管底部。因此，最适合进行孢子粘附的材料为称量纸。

实施例2、孢悬液最佳配制方法的筛选

根据离心管底部收集到的孢子粉质量，添加适量的溶液配制成密度为1mg/mL的孢悬液。设置无菌水和70％乙醇2种溶液，通过观察涡旋振荡5s后孢子粉的溶解情况以及在离心管内的挂壁情况，确定用于孢子悬浮的最佳溶液。随后，设置离心管内不添加研磨珠和添加研磨珠两个处理，通过观察涡旋振荡5s后孢悬液中孢子的离散程度，确定用于孢悬液配置的最佳方法。

结果如图2所示，可以看出，使用70％乙醇溶解孢子粉，涡旋振荡后孢悬液溶解程度优于使用无菌水直接溶解，同时离心管壁残留的孢悬液明显少于水溶。另外，由于多主棒孢菌呈链生，不添加研磨珠的处理配置的孢悬液孢子成团聚集，而添加研磨珠的处理配置的孢悬液孢子离散程度大大提高，更有利于后续使用血球计数板进行计数。因此，孢悬液最佳配制方法优选采用70％乙醇作为溶剂，离心管内放置适量研磨珠，进行涡旋振荡。

实施例3、多主棒孢菌分生孢子质量的测定

使用移液枪吸取10μL密度为1mg/mL的多主棒孢菌孢悬液，滴加到血球计数板计数区，在100倍光学显微镜下统计体积为0.1mm³计数区内多主棒孢菌分生孢子的数量，每次重复观察记录10个视野。然后按照式(2)计算单个分生孢子的质量。

表1多主棒孢菌分生孢子质量计算数据统计

如表1所示，多主棒孢菌单个分生孢子的质量为4.95～6.25ng，平均为5.69±0.67ng。

本发明方法适于测定多主棒孢菌分生孢子的质量，使用分析天平称量大量孢子粉的质量，将不可实现的个体研究转化为可操作的群体研究，能有效解决无仪器设备可用的难题；通过将孢子粉配制成孢悬液，仅统计血球计数板计数区观察到的孢子个数，不仅解决了真菌孢子个体微小，肉眼不可识别的问题，并且大大简化了统计全部待测样品数量耗时、费力的过程。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性活动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。