野黑樱苷在制备治疗脂肪性肝病和肝纤维化的药物中的应用
阅读说明：本技术 野黑樱苷在制备治疗脂肪性肝病和肝纤维化的药物中的应用 (Application of prunasin in preparation of medicine for treating fatty liver disease and hepatic fibrosis ) 是由 刘伟 刘平 张定棋 王长虹 张聪聪 陈佳美 杨海琳 王永丽 戚胜兰 于 2021-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及野黑樱苷在制备治疗脂肪性肝病和肝纤维化的药物中的应用。本发明发现对于高脂高糖饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型,野黑樱苷干预可显著改善肝组织病理学变化,抑制肝组织脂质聚集,减少肝组织TG含量,降低血清AST和ALT的活性以及血清TG、TC和LDL的含量,效果显著优于阳性对照药；对于四氯化碳诱导的小鼠化学性损伤肝纤维化模型和胆管结扎构建的大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型,野黑樱苷干预可显著改善肝组织病理学变化,抑制胶原沉积,减少肝组织Hyp的含量,降低血清AST和ALT的活性以及总胆红素水平,效果显著优于阳性对照药。将野黑樱苷与临床药物联用发现,野黑樱苷联合索拉非尼能显著改善四氯化碳诱导的肝纤维化,表现出协同作用。(The invention relates to application of prunasin in preparing a medicament for treating fatty liver disease and hepatic fibrosis. The invention discovers that for a mouse non-alcoholic steatohepatitis model induced by high-fat high-sugar diet, the intervention of the prunasin can obviously improve the pathological change of liver tissues, inhibit the lipid aggregation of the liver tissues, reduce the TG content of the liver tissues, reduce the activity of AST and ALT in serum and the content of TG, TC and LDL in the serum, and the effect is obviously better than that of a positive control drug; for a mouse chemical injury hepatic fibrosis model induced by carbon tetrachloride and a rat cholestatic hepatic fibrosis model constructed by bile duct ligation, the intervention of the elaeagnus mollis glucoside can obviously improve the pathological change of liver tissues, inhibit collagen deposition, reduce the content of Hyp in the liver tissues, reduce the activity of AST and ALT in serum and the total bilirubin level, and the effect is obviously better than that of a positive control medicament. The combination of the prunasin and clinical drugs shows that the prunasin and sorafenib can obviously improve the hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride and show synergistic effect.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，涉及野黑樱苷在制备治疗脂肪性肝病和肝纤维化的药物中的应用。
背景技术
野黑樱苷(Prunasin)存在于杏、桃、枇杷、青梅、杨梅等植物的种仁中，目前仅在一些药物的代谢过程中见报道，相关药理药效研究报道很少。野黑樱苷的化学结构见图1。
脂肪性肝病是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，脂肪性肝病正严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。脂肪性肝病(fatty liverdisease,FLD)包括非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)和酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)，其发病率逐年上升，已成为全球重要的健康问题，其中非酒精性脂肪性肝炎已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生物化学指标异常的首要原因，而糖尿病、肥胖、血脂异常患者非酒精性脂肪性肝病患病率更显著。NAFLD包括一系列脂肪在肝脏堆积所产生的弥漫性肝细胞大泡性脂肪性变为主要病变的临床病理综合征，是一种遗传-环境-代谢-应激相关性疾病，疾病谱包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)及其相关肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。ALD是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，其病理学改变主要为大泡性或大泡性为主伴小泡性的混合性肝细胞脂肪变性，根据病理改变分为酒精性脂肪肝(alcoholic simple fatty liver,AFL)、酒精性肝炎(alcoholichepatitis,AH)、酒精性肝硬化。
肝纤维化是指在各种慢性肝病时，肝细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激，导致机体发生修复反应，大量纤维增生同时伴有纤维降解相对或绝对不足，细胞外基质在肝内大量沉积。肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理阶段，包括病毒性肝炎、FLD、自身免疫性肝病、药物性肝炎等。肝纤维化进一步可进展为肝硬化，肝衰竭，甚至肝癌。
目前用于治疗肝纤维化或非酒精性脂肪性肝病的药物多处于临床试验和实验研究阶段，尚无针对肝纤维化或肝脏脂质沉积的生物和化学药物被推荐用于临床。而天然药物通常毒副作用较小，在疾病治疗中有突出优势。
目前还未见野黑樱苷在治疗肝病方面的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供野黑樱苷在制备治疗脂肪性肝病和肝纤维化的药物中的应用。
第一方面，本发明提供了野黑樱苷在制备治疗脂肪性肝病(fatty liverdisease,FLD)或肝纤维化(liver fibrosis)的药物中的应用。
作为一个优选例，所述脂肪性肝病为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fattyliver disease,NAFLD)或酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)；所述肝纤维化为化学性损伤肝纤维化或胆汁淤积性肝纤维化。
更优选地，所述非酒精性脂肪性肝病为非酒精性单纯性脂肪肝(non-alcoholicfatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)或其相关的肝纤维化与肝硬化；所述酒精性肝病为酒精性脂肪肝(alcoholic simple fattyliver,AFL)、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis,AH)或酒精性肝硬化。
更优选地，所述非酒精性脂肪性肝病是由高脂高糖饮食导致的。
作为另一优选例，所述野黑樱苷为唯一的活性成分。
第二方面，本发明提供了一种治疗肝纤维化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包含野黑樱苷和索拉非尼。
第三方面，本发明提供了所述药物组合物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。
第四方面，本发明提供了野黑樱苷在制备研究脂肪性肝病或肝纤维化的病理机制的实验试剂中的应用。
作为一个优选例，所述研究脂肪性肝病或肝纤维化的病理机制，所采用的研究为体外或体内研究。
作为另一优选例，所述体内研究基于高脂饲料诱导的非酒精性脂肪性肝炎动物模型、四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型或胆管结扎建立的胆汁淤积性肝纤维化动物模型。
本文中，所述“药物”指用以预防、治疗及诊断疾病的物质；所述“实验试剂”是指基于实验的目的，为实现化学反应、分析化验、研究试验、教学实验、化学配方使用的纯净化学品。
本发明优点在于：
1、首次发现野黑樱苷对非酒精性脂肪性肝病具有较好的治疗作用。对肝脏损伤时的异常生化指标有明显的改善作用，并且显著减少肝脏脂质聚集。本发明已完成的动物模型实验表明，对于高脂高糖饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型，使用野黑樱苷干预后可显著改善肝细胞脂肪变，肝细胞气球样变及炎症细胞浸润，抑制肝组织脂质聚集，减少肝组织甘油三酯含量，降低血清天门冬氨酸氨基转移酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶活性，以及血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白含量。
2、首次发现野黑樱苷对肝纤维化有较好的治疗作用，对肝脏损伤时的异常生化指标有明显的改善作用，并且显著减少肝脏胶原纤维沉积。本发明已完成的动物模型实验表明，对于四氯化碳诱导的小鼠化学性损伤肝纤维化模型和胆管结扎诱导的大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型，使用野黑樱苷干预后可显著改善肝组织病理学变化，抑制胶原沉积，减少肝组织羟脯氨酸的含量，降低血清天门冬氨酸氨基转移酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶活性，以及总胆红素水平。
3、考察野黑樱苷与临床药物联用对肝病的治疗作用，发现野黑樱苷与索拉非尼具有协同作用，能显著改善四氯化碳诱导的肝纤维化，治疗后小鼠化学性损伤肝纤维化基本恢复正常。
综上，野黑樱苷可作为活性成分制备药物，用于众多肝病的治疗，包括脂肪性肝病、药物性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝病等慢性肝病。应用野黑樱苷与索拉非尼的组合物治疗肝纤维化可达到减毒增效的目的。
附图说明
图1.野黑樱苷的化学结构式；
图2.高脂高糖饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎模型的肝脏病理切片H&E染色；
图3.高脂高糖饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎模型的肝脏冰冻切片油红O染色；
图4.四氯化碳诱导肝纤维化模型的肝脏病理切片H&E染色；
图5.四氯化碳诱导肝纤维化模型的肝脏病理切片天狼星红染色；
图6.胆管结扎构建胆汁淤积性肝纤维化模型的肝脏病理切片H&E染色；
图7.胆管结扎构建胆汁淤积性肝纤维化模型的肝脏病理切片天狼星红染色；
图8.四氯化碳诱导肝纤维化模型评价联合用药的肝脏病理切片H&E染色；
图9.四氯化碳诱导肝纤维化模型评价联合用药的肝脏病理切片天狼星红染色；
上述图中，野黑樱苷-L：野黑樱苷低剂量组，野黑樱苷-M：野黑樱苷中剂量组，野黑樱苷-H：野黑樱苷高剂量组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1.实验目的：考察野黑樱苷对高脂高糖诱导小鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用
2.实验方法：
实验动物：本发明所用实验动物为C57BL/6小鼠，体重20-22g，雄性，由上海吉辉实验动物饲养有限公司提供，饲养于上海中医药大学实验动物中心。
实验用低脂对照饲料和高脂饲料购自Research Diets有限公司，果糖和蔗糖购自Sigma公司，奥贝胆酸购自大连美仑生物技术有限公司，野黑樱苷购自云南西力生物技术有限公司，结构通过NMR及MS确定，纯度采用HPLC面积归一化法测定大于98％。
C57BL/6J小鼠48只，SPF级，分为正常对照组，高脂高糖模型组，野黑樱苷低剂量组(野黑樱苷-L)，野黑樱苷中剂量组(野黑樱苷-M)，野黑樱苷高剂量组(野黑樱苷-H)，奥贝胆酸组，每组8只。造模方式，对照组给予低脂对照饲料喂养，其余组给予高脂饲料喂养和高糖(果糖和蔗糖)饮水，共喂养20周。从第14周起在继续喂养相应饲料的同时，对照组和模型组予以等体积的0.3％CMC-Na溶液，野黑樱苷组灌胃分别给予1.25、2.5及5mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬野黑樱苷溶液，奥贝胆酸组给予10mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬奥贝胆酸溶液，每日1次，共干预6周。第20周末结束处死所有小鼠，留取血清及肝组织，检测血清肝功能与血脂、肝组织甘油三酯含量(TG)、肝组织病理(H&E)以及肝组织油红O染色。
统计方法：采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用非参数检验，数据以表示，组间多重比较分析采用One-way ANOVA结合LSD多重比较分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.实验结果：
3.1野黑樱苷对小鼠血清学相关指标的影响
与对照组比较，模型组血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清谷氨酸丙酮酸转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平显著升高(P<0.001)；与模型组比较，野黑樱苷组AST、ALT、TC及LDL水平显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，且野黑樱苷高剂量组较奥贝胆酸组降低更明显，具体见表1。
表1血清学相关指标变化
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.
3.2野黑樱苷对甘油三酯(TG)的影响
与正常组相比，模型组小鼠血清和肝组织TG含量显著增加(P<0.001)，而野黑樱苷各剂量组和奥贝胆酸组TG的含量均显著低于模型组(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，其中野黑樱苷组减少更为明显，具体见表2。
表2血清和肝脏TG含量
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.
3.3野黑樱苷对小鼠肝脏组织学变化的影响
肝组织H&E染色显示，对照组小鼠可见肝组织形态结构均正常，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状排列，血管周围无炎症细胞浸润，存在一定量的小空泡。与对照组比较，模型组小鼠肝组织可见肝细胞脂肪变，大量脂肪空泡，肝细胞气球样变，炎症细胞浸润；与模型组比较，野黑樱苷各剂量组与奥贝胆酸组小鼠肝组织脂肪变、炎症细胞浸润均得到明显改善。且野黑樱苷组较奥贝胆酸组改善更明显(图2)。对H&E染色肝组织进行NAS积分评判，结果见表3，模型组小鼠NAS积分＞4分，提示小鼠NASH模型造模成功，而各药物组均可显著降低NAS评分(P<0.01，P<0.001)。
表3小鼠肝脏组织学NAS积分
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001.
3.4野黑樱苷对小鼠肝脏脂质沉积的影响
肝组织油红O染色结果见图3，与对照组比较，模型组小鼠肝组织内大量红色脂滴沉积，形态大小不一，排列紧密；而野黑樱苷各剂量组和奥贝胆酸组小鼠肝组织脂滴沉积较模型组明显减少。油红O染色阳性面积比结果显示：与对照组比较，模型组油红O染色面积比显著增加(P<0.001)，而野黑樱苷各剂量组与奥贝胆酸组小鼠肝组织油红O染色面积比较模型组显著降低(P<0.05，P<0.01)，且野黑樱苷组改善更为明显，具体见表4。
表4肝组织油红O染色面积比
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01.
4实验结论：
野黑樱苷对非酒精性脂肪性肝炎具有较好的治疗效果，可以用于制备药物。
实施例2
1.实验目的：考察野黑樱苷对四氯化碳诱导的肝纤维化的作用
2.实验方法
实验动物：本发明所用实验动物为C57BL/6小鼠，体重20-22g，雄性，由上海吉辉实验动物饲养有限公司提供，饲养于上海中医药大学实验动物中心。
实验用四氯化碳(CCl4)、橄榄油购自国药集团化学试剂有限公司；索拉非尼购自Sigma公司。
C57BL/6J小鼠48只，SPF级，分为正常对照组，CCl4模型组，野黑樱苷低剂量组(野黑樱苷-L)，野黑樱苷中剂量组(野黑樱苷-M)，野黑樱苷高剂量组(野黑樱苷-H)，索拉非尼组，每组8只。造模方式：对照组给予橄榄油腹腔注射，其余各组均给予15％CCl4橄榄油腹腔注射，2mL/kg，每周注射3次，共注射6周。从第4周起，对照组和模型组予以等体积的0.3％CMC-Na溶液，野黑樱苷组灌胃分别给予1.25、2.5及5mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬野黑樱苷溶液，索拉非尼组给予10mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬索拉非尼溶液，每日1次，共干预3周。第6周末结束后麻醉处死所有小鼠，留取血清及肝组织，检测血清肝功能、肝组织羟脯氨酸含量(Hyp)以及肝组织病理(H&E)。
统计方法：采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用非参数检验，数据以表示，组间多重比较分析采用One-way ANOVA结合LSD多重比较分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.实验结果：
3.1野黑樱苷对血清学指标的影响
与对照组比较，模型组血清AST和ALT活性，TBiL含量显著升高(P<0.001)；与模型组相比，野黑樱苷各剂量组血清AST、ALT活性和TBiL含量显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，具体见表5。
表5小鼠血清学指标变化
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01.
3.2野黑樱苷对肝组织Hyp含量的影响
与对照组相比，模型组小鼠肝组织Hyp含量显著增加(P<0.001)，而野黑樱苷各剂量组Hyp含量显著低于模型组(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，具体见表6。
表6肝组织Hyp含量
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.
3.3野黑樱苷对肝脏组织学变化的影响
H&E染色显示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周放射排列；模型组小鼠肝细胞广泛坏死，正常肝小叶结构消失，纤维间隔见大量炎性细胞浸润；与模型组相比，野黑樱苷各剂量组肝细胞坏死和炎症细胞浸润明显减少(图4)。天狼星红染色显示，正常小鼠肝脏仅在汇管区和中央静脉周围见少量胶原沉积；模型组小鼠肝脏出现大量纤维间隔，形成假小叶结构；与模型组相比，野黑樱苷各剂量组胶原沉积明显减少，纤维间隔疏松，完整的假小叶结构少见(图5)。天狼星红染色片全片扫描半定量分析结果显示，与正常组比较，模型组胶原面积显著增加(P<0.001)，而与模型组比较，野黑樱苷各剂量组的胶原面积显著减少(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，具体见表7。
表7天狼星红染色阳性面积比
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.
4.实验结论：
野黑樱苷对肝纤维化具有较好的治疗效果，可以用于制备药物。
实施例3
1.实验目的：考察野黑樱苷对胆管结扎建立的胆汁淤积性肝纤维化的作用
2.实验方法
实验动物：本发明所用实验动物为Wistar大鼠，体重160-180g，雄性，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，饲养于上海中医药大学实验动物中心。
Wistar大鼠48只，SPF级，分为正常对照组，胆管结扎模型组，野黑樱苷低剂量组(野黑樱苷-L)，野黑樱苷中剂量组(野黑樱苷-M)，野黑樱苷高剂量组(野黑樱苷-H)，DAPT组，每组8只。造模方式：模型组、野黑樱苷-L组、野黑樱苷-M组、野黑樱苷-H组及DAPT组大鼠在麻醉状态下行胆管结扎术，而正常组大鼠行胆管假手术作为对照。从第3周起正常组和模型组予以等体积的0.3％CMC-Na溶液，野黑樱苷组灌胃分别给予1.25、2.5及5mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬野黑樱苷溶液，灌胃体积为20mL/kg，DAPT组给予30mg/kg DAPT溶液腹腔注射，注射体积为1mL/kg，每日1次，共干预3周。第6周末结束后麻醉处死所有大鼠，留取血清及肝组织，检测血清肝功能、肝组织羟脯氨酸含量(Hyp)以及肝组织病理(H&E)。
统计方法：采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用非参数检验，数据以表示，组间多重比较分析采用One-way ANOVA结合LSD多重比较分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.实验结果：
3.1野黑樱苷对血清学指标的影响
与正常组比较，模型组血清AST和ALT活性及TBil含量显著升高(P<0.001)；与模型组相比，野黑樱苷各剂量组血清AST、ALT活性及TBil含量显著下降(P<0.05，P<0.01)，具体见表8。
表8大鼠血清学指标变化
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01.
3.2野黑樱苷对肝组织Hyp含量的影响
与正常组相比，模型组大鼠肝组织Hyp含量显著增加(P<0.001)，而野黑樱苷各剂量组Hyp含量显著低于模型组(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，具体见表9。
表9大鼠肝脏Hyp含量
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.
3.3野黑樱苷对肝脏组织学变化的影响
H&E染色显示，正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周放射排列；模型组大鼠胆管细胞增生，肝细胞广泛坏死，纤维间隔形成，可见大量炎性细胞浸润；与模型组相比，野黑樱苷各剂量组胆管细胞增生，肝细胞坏死，纤维间隔形成及其炎性细胞浸润被显著改善(图6)。天狼星红染色显示，正常大鼠肝脏仅在汇管区和中央静脉周围见少量胶原沉积；模型组大鼠肝脏出现大量胶原沉积，且胶原沉积广泛的沉积在增生的胆小管附近；与模型组相比，野黑樱苷各剂量组的胶原沉积得到显著改善(图7)。天狼星红染色片全片扫描半定量分析结果显示，与正常组比较，模型组胶原面积显著增加(P<0.001)，而与模型组比较，野黑樱苷各剂量组的胶原面积显著减少(P<0.05，P<0.01)，具体见表10。
表10天狼星红染色阳性面积比
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01.
4.实验结论：
野黑樱苷对胆汁淤积性肝纤维化有较好的治疗效果，可以用于制备药物。
实施例4
1.实验目的：考察野黑樱苷联合索拉非尼对四氯化碳诱导的肝纤维化的作用
2.实验方法：
实验动物：本发明所用实验动物为C57BL/6小鼠，体重20-22g，雄性，由上海吉辉实验动物饲养有限公司提供，饲养于上海中医药大学实验动物中心。
实验用四氯化碳(CCl4)、橄榄油购自国药集团化学试剂有限公司；野黑樱苷购自云南西力生物技术有限公司，结构通过NMR及MS确定，纯度采用HPLC面积归一化法测定大于98％；索拉非尼购自Sigma公司。
C57BL/6J小鼠40只，SPF级，分为正常对照组，CCl4模型组，野黑樱苷组，索拉非尼组，野黑樱苷+索拉非尼组，每组8只。造模方式：对照组给予橄榄油腹腔注射，其余各组均给予15％CCl4橄榄油腹腔注射，2mL/kg，每周注射3次，共注射6周。从第4周起，对照组和模型组予以等体积的0.3％CMC-Na溶液，野黑樱苷组灌胃给予5mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬野黑樱苷溶液，索拉非尼组给予10mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬索拉非尼溶液，野黑樱苷+索拉非尼组灌胃给予2.5mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬野黑樱苷溶液和5mg/kg 0.3％CMC-Na配制的混悬索拉非尼溶液。每日1次，共干预3周。第6周末结束后麻醉处死所有小鼠，留取血清及肝组织，检测血清肝功能、肝组织羟脯氨酸含量(Hyp)以及肝组织病理(H&E)。
统计方法：采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用非参数检验，数据以表示，组间多重比较分析采用One-way ANOVA结合LSD多重比较分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.实验结果：
3.1各组小鼠血清学指标
与对照组比较，模型组血清AST和ALT活性，TBiL含量显著升高(P<0.001)；与模型组相比，野黑樱苷组的血清AST、ALT活性和TBiL含量显著降低(P<0.01，P<0.001)，野黑樱苷+索拉非尼组的血清AST、ALT活性和TBiL含量也显著降低(P<0.001)，野黑樱苷和索拉非尼联用表现出协同作用，具体见表11。
表11小鼠血清学指标变化
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001.
3.2各组小鼠肝组织Hyp含量
与对照组相比，模型组小鼠肝组织Hyp含量显著增加(P<0.001)，野黑樱苷组Hyp含量显著低于模型组(P<0.001)，野黑樱苷+索拉非尼组的Hyp含量也显著低于模型组(P<0.001)，野黑樱苷和索拉非尼联用表现出协同作用，具体见表12。
表12肝组织Hyp含量
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001.
3.3各组小鼠肝脏组织学变化
H&E染色显示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周放射排列；模型组小鼠肝细胞广泛坏死，正常肝小叶结构消失，纤维间隔见大量炎性细胞浸润；与模型组相比，野黑樱苷组肝细胞坏死和炎症细胞浸润明显减少，野黑樱苷+索拉非尼组肝细胞坏死和炎症细胞浸润减少最为显著，肝小叶结构较清晰，肝细胞索由中央静脉向四周放射排列(图8)。天狼星红染色显示，正常小鼠肝脏仅在汇管区和中央静脉周围见少量胶原沉积；模型组小鼠肝脏出现大量纤维间隔，形成假小叶结构；与模型组相比，野黑樱苷组胶原沉积明显减少，纤维间隔疏松，完整的假小叶结构少见，野黑樱苷+索拉非尼组肝脏胶原沉积显著减少，与正常组小鼠肝脏接近(图9)。天狼星红染色片全片扫描半定量分析结果显示，与正常组比较，模型组胶原面积显著增加(P<0.001)，与模型组比较，野黑樱苷组的胶原面积显著减少(P<0.001)，野黑樱苷+索拉非尼组的胶原面积也显著减少(P<0.001)，具体见表13。
表13天狼星红染色阳性面积比
注：表示与对照组比较，###P<0.001；表示与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001.
4.实验结论：
野黑樱苷与索拉非尼联用对肝纤维化具有显著的治疗效果，表现出协同作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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