具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更加全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是本发明可以通过不同的形式来实现，并不限于文本所描述的实施例，相反的，提供这些实施例是为了使对本发明公开的内容更加透彻全面。

本发明的香叶基香叶基焦磷酸GGPP结合并变构激活人源FBP1在制备抗肝细胞癌药物中的应用，所述的香叶基香叶基焦磷酸GGPP的化学式如式(I)所示：

所述的人源FBP1蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

所述的香叶基香叶基焦磷酸GGPP特异地与FBP1结合并上调FBP1的酶活促进糖异生，且抑制肝实质细胞和肝癌细胞的迁移。

所述的香叶基香叶基焦磷酸GGPP通过敏化其靶点蛋白FBP1偶联糖脂代谢平衡，进而调节肝细胞癌发生、发展的分子机制，并作用于肝细胞癌。

合成带有Biotin标签的GGPP探针，利用生物素--链霉亲和素亲和纯化体系富集小鼠原代肝实质细胞中的GGPP结合蛋白并进行质谱检测，筛选出了多个与糖脂代谢相关的GGPP潜在靶点蛋白，糖异生途径的果糖-1，6-二磷酸酶1，糖酵解途径的肝脏丙酮酸激酶和参与脂质氧化的肉毒碱棕榈酰转移酶1。

所述的GGPP特异地与FBP1结合并上调FBP1的酶活促进糖异生，逆转肿瘤的Warburg效应从而抑制多种肿瘤的发生发展。

所述的抗肿瘤药物为抗肝细胞癌药物。

实施例1

带有Biotin标签的GGPP探针，利用生物素--链霉亲和素亲和纯化体系富集小鼠原代肝实质细胞中的GGPP结合蛋白并进行质谱检测，筛选出了多个与糖脂代谢相关的GGPP潜在靶点蛋白，例如糖异生途径的果糖-1，6-二磷酸酶1(Fructose-1,6-bisphosphatase，FBP1)，糖酵解途径的肝脏丙酮酸激酶(Liver pyruvate kinase，LPK)和参与脂质氧化的肉毒碱棕榈酰转移酶1(Carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)等。其中，FBP1由于与GGPP结合的显著性(如图5-8所示)、在糖脂代谢调控中的重要作用以及与多种癌症的相关性引起了关注。

1.建立富集和鉴定代谢小分子GGPP直接结合蛋白的技术路线

1.1 Biotin-GGPP探针的设计和合成

为了富集肝脏中与GGPP直接结合的蛋白，本发明合成了带有生物素标签的GGPP探针(BGPP，图2)。在该BGPP分子中，生物素被加在了带有生物素标签的GGPP分子长链碳骨架的C3位置，以保证GGPP前端疏水长链和后端焦磷酸的灵活性并且可以暴露出来和其结合蛋白相互作用。图2为本发明的带有生物素标签的Biotin-GGPP(BGPP)分子图。

所述的GGPP(中文名称：香叶基香叶基焦磷酸)化学式如式(I)所示：

1.2通用的代谢小分子或药物小分子靶点蛋白筛选技术路线

本发明建立了一种通用的代谢小分子或药物小分子靶点蛋白筛选技术路线(图3)。为了鉴定肝脏中与GGPP直接结合并受其调控的靶点蛋白，我们合成了带有生物素标签的GGPP分子，以单独的生物素和GGPP作为对照，分别处理分离、培养的8周龄C57BL/6J雄性小鼠原代肝实质细胞。裂解细胞提取总蛋白后，通过链霉亲和素磁珠亲和纯化GGPP结合蛋白，并利用2D LC-MS/MS进行质谱分析，进而结合基于谱图数计算的非标记蛋白质组学定量和生信分析，获得了成年小鼠原代肝实质细胞中可能的GGPP相互作用蛋白组。通过该技术路线，本发明可以筛选重要的代谢小分子或药物小分子在人体内或细胞内的直接结合蛋白，为解释这些小分子生物学活性和发挥作用的分子机制提供靶点和理论依据。图3为本发明的代谢小分子GGPP靶点蛋白筛选技术路线；图4为本发明的代谢小分子GGPP靶点蛋白的亲和纯化图。

本发明首先分离了8周龄C57BL/6J雄性小鼠原代肝实质细胞，将其分成三份分别培养。在添加小分子药物进行实验分组时，设置了两个阴性对照：分别为添加(Biotin&GGPP)组和(BGPP&8倍GGPP)竞争组，和添加BGPP组一起，分别处理分离培养的小鼠原代肝实质细胞。药物添加4小时后，裂解三组小鼠原代肝实质细胞提取总蛋白(Input)，通过加入链霉亲和素磁珠进行亲和纯化，获得了成年小鼠原代肝实质细胞中可能的GGPP作用蛋白(AP)。对Biotin-GGPP亲和纯化得到的结合蛋白进行银染后发现，Biotin-GGPP组较Biotin组有多个明显的差异条带(图4)，表明GGPP可能确实存在特异性的结合蛋白。因此，本发明对这些蛋白进行了进一步的LC-MS/MS质谱分析。图5为本发明的GGPP潜在直接结合蛋白的生物信息学分析图；A-C.GGPP结合蛋白的Gene Ontology分析:包括生物学过程、分子功能以及细胞成分分析；D.GGPP结合蛋白的KEGG通路分析；E.GGPP结合蛋白的功能分类；F.GGPP结合蛋白中调控糖代谢和脂代谢的关键酶类的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。

将质谱原始数据进行数据库搜索后，Biotin对照组与Biotin-GGPP处理组分别检测到259与479个蛋白。将两组的数据整合进行Label Free相对定量比较，以相对丰度在Biotin-GGPP组比Biotin对照组上调1.5倍以上、且检测到的肽段数大于1为标准，得到潜在的GGPP结合蛋白共211个。对这211个蛋白进行生物信息学分析，包括Gene Ontology分析(图5A-C)、KEGG Pathway分析(图5D)、蛋白质功能分类分析(图5E)和蛋白－蛋白相互作用网络分析(图5F)，结果显示：这些蛋白大量参与各种代谢过程，尤其显著参与脂肪酸代谢和糖酵解/糖异生途径。这些糖脂代谢相关的蛋白如CPT1α和FBP1可作为后续探讨GGPP调控肝脏代谢性疾病和肝细胞癌发生机制的候选蛋白(表1)。本发明的GGPP直接结合蛋白中调控肝脏糖脂代谢的关键酶类如表1所示：

试验例1

肝脏特异性Ggpps1敲除小鼠构建及表型分析

为了研究GGPP缺失对于肝脏脂质代谢的影响，本发明成功构建了Ggpps1^-/-Mx1-Cre肝脏特异性诱导敲除小鼠，并进行了相关的表型分析。在肝脏特异性敲除Ggpps1的小鼠肝原代细胞中，代谢组学质谱检测表明FPP/GGPP及FOH/GGOH的比值均表现显著上升(图6A)，而GGPP含量的降低和FPP含量的升高显著抑制了肝脏特异性Ggpps1敲除小鼠甘油三脂(TG)的堆积，使得敲除小鼠对于高脂饮食诱导不敏感，不会出现明显的脂肪肝表型(图6B-D)。图6为本发明的肝脏特异性Ggpps1敲除小鼠FPP/GGPP比值与表型；A.肝脏特异性Ggpps1敲除小鼠原代肝实质细胞FPP/GGPP及FOH/GGOH的比值变化；B.野生型及肝脏特异性Ggpps1敲除正常饮食及高脂诱导下肝脏形态；C.野生型及肝脏特异性Ggpps1敲除的肝脏切片HE染色，WT的HFD组显示的空泡即脂滴；D.野生型及肝脏特异性Ggpps1敲除的肝脏切片油红染色，红点显示肝脏内脂滴。

试验例2

GGPP通过结合FBP1调控肝脏糖脂代谢参与肝细胞癌的发生发展

FBP1是糖异生过程中的关键限速酶，同时也被证实是一种重要的抑癌蛋白。已有多个研究报道FBP1缺失、突变和表达降低会导致肝细胞癌、肾透明细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等多种癌症的发生、发展。在干细胞癌HCC中，FBP1的缺失或减少可能通过影响Warburg效应，导致糖脂代谢紊乱和脂质异常积累，为癌细胞提供大量物质和能量，加速HCC的发生、发展。而统计学数据也表明在HCC中FBP1表达水平高的病人预后明显好，这使得FBP1成为潜在的HCC预后的预测标志物。

而临床上，对HCC病人样本检测发现，GGPP的合成酶GGPPS1表达水平与HCC的恶性程度呈正相关，且GGPPS1表达高的HCC病人预后较好，提示GGPPS1和GGPP可能在HCC恶化进程中通过代偿性的上调以保护肝脏。由此推测GGPP可能通过结合FBP1并上调其活性影响糖脂代谢平衡，参与HCC的发生、发展。因此，本发明从分子水平、细胞水平、动物模型和临床病例等多个层面，阐明了GGPP通过与其靶点蛋白FBP1特异性直接结合调控糖脂代谢平衡，进而调控HCC的发生、发展的分子机制，并为HCC的治疗提供新的潜在靶点、药物和治疗方法。

1 GGPP结合蛋白FBP1肽段的二级谱图

在两次以BGPP为探针的亲和纯化重复实验中，本发明都鉴定到了人源FBP1蛋白，蛋白质谱鉴定到的肽段数分别为7和5，人源FBP1蛋白的整体覆盖率分别为28.7％和26％(图7A)。FBP1肽段DFDPAINEYLQR²⁺(m/z＝740.85)二级谱图的b系列和y系列子离子峰完美覆盖了整个肽段(图7B)，不容置疑的表明本发明确实在BGPP结合蛋白中鉴定到了FBP1。图7为本发明的亲和纯化质谱鉴定到的GGPP结合蛋白FBP1肽段和二级谱图；A.两次亲和纯化质谱鉴定到的GGPP结合蛋白FBP1肽段情况；B.FBP1肽段DFDPAINEYLQR²⁺(m/z＝740.85)二级谱图。

2 GGPP结合蛋白FBP1的Western blot和MST验证

通过Western blot，本发明验证了BGPP结合蛋白中的FBP1、ACADL和ACSL1：与Biotin&GPPP的阴性对照组相比，BGPP组的AP样品中含有明显富集的FBP1、ACADL和ACSL1蛋白(图8A)。同时，为了进一步验证FBP1、ACADL和ACSL1等糖脂代谢相关蛋白与GGPP的直接结合，本发明利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化了带有EGFP标签的融合蛋白进行了微量热泳动分析(MST)，进一步证实了FBP1、ACADL和ACSL1蛋白可以与GGPP特异性直接结合，而FBP1和GGPP结合的解离常数KD值为250nM(图8B-C)。图8为本发明的多个GGPP结合蛋白的Western blot和MST验证图；A.FBP1、ACADL和ACSL1等GGPP结合蛋白的Western blot验证；B.FBP1、ACADL和ACSL1与GGPP结合的验证；C.FBP1、ACADL和ACSL1与BGPP结合的验证。

3 GGPP结合FBP1的竞争结合实验、SPR和BLI

FBP1作为后续生物学功能研究的候选分子，被进一步采用多种方式进行GGPP的结合验证。GGPP竞争结合实验表明，当有高剂量的游离的GGPP分子存在时，BGPP和人源FBP1蛋白的结合呈剂量依赖性的下降。当游离GGPP的浓度达到40μM(8倍于BGPP探针)时，BGPP和FBP1的结合几乎被完全破坏，证明BGPP特异性的和人源FBP1蛋白直接结合(图9A)。表面等离子共振(SPR)(图9B)和分子互作(BLI)(图9C)等实验也表明，从大肠杆菌纯化获得的FBP1重组蛋白可以在体外和GGPP特异结合。SPR检测到FBP1和GGPP结合的解离常数K_D值为262nM(图9B)。图9为本发明的GGPP结合蛋白FBP1的竞争性结合实验以及SPR和BLI验证图；A.GGPP结合蛋白FBP1的竞争性结合实验；B.GGPP和FBP1结合的SPR验证；C.GGPP和FBP1结合的BLI验证。

4 GGPP结合上调FBP1酶活；图10.GGPP结合FBP1后显著上调FBP1酶活；A.GGPP结合FBP1不影响FBP1同源四聚体的形成；B.GGPP和FBP1结合显著上调FBP1酶活，而FPP没有激活效应。

FBP1是糖异生过程中的一个关键限速酶。因此，研究GGPP结合FBP1是否影响其酶活具有重要意义。为了阐明GGPP与FBP1直接结合的生物学功能，本发明进一步检测了GGPP对于FBP1活性的影响。体外试验证实GGPP不影响FBP1同源四聚体的形成(图10A)，但是可以剂量依赖性的显著上调FBP1的活性(图10B)，而与GGPP结构类似的FPP并无这一作用，这表明GGPP结合FBP1并调控其活性具有特异性。而文献已报道的FBP1活性抑制剂AMP则剂量依赖性的降低FBP1的活性，证明了该检测体系的有效性。

5 GGPP和FBP1结合模式的表征；图11为本发明的负染电镜揭示GGPP结合FBP1后FBP1四聚体结构变化；A-B.FBP1和GGPP添加后的FBP1四聚体的负染电镜整体结果；C-D.倍数放大后的FBP1和GGPP-FBP1颗粒不同构象的负染电镜采集；E-F.负染电镜FBP1和GGPP-FBP1颗粒构象的3D重构；G-J.3D重构揭示GGPP结合后FBP1四聚体的构象和转角改变。

为了阐明GGPP激活FBP1活性的分子机制，本发明通过冷冻电镜解析了GGPP加入后FBP1同源蛋白四聚体的构象变化。结果表明，GGPP的结合缩小了FBP1四聚体中上下两个FBP1二聚体之间的夹角，引起了一个6度左右的偏转(图11)。GGPP加入后，可以更好的稳定FBP1四聚体中两个二聚体的相对位置，降低它们之间的相对角度。进一步的X射线晶体衍射结果表明，GGPP分子特异性的结合在FBP1四聚体的中间空腔位置，与其直接相互作用的FBP1氨基酸残基包括R50，S46，P189和A190等(图12)。GGPP的这一结合像一根“门栓”，阻碍了FBP1四聚体中上下两个二聚体的转动转变为非活性状态的R态，从而将FBP1四聚体较大程度的停留在活性状态的T态，上调了FBP1的活性。图12为本发明的X射线晶体衍射揭示GGPP结合位于FBP1四聚体的中间空腔图。

根据上述结构实验的结果，本发明构建了FBP1的突变体并观察了它们形成FBP1四聚体的能力以及酶活的变化。结果表明，人源FBP1蛋白GGPP结合位点的突变几乎不影响FBP1四聚体的形成(图14A)，但是明显抑制了FBP1酶活对于GGPP刺激的响应(图14B)，证实了这些位点对于FBP1和GGPP的结合至关重要。图14为本发明的人源FBP1蛋白GGPP结合位点的突变抑制了FBP1酶活对于GGPP刺激的响应图；A.GGPP结合位点突变不影响FBP1同源四聚体的形成；B.GGPP结合位点突变抑制了FBP1酶活对于GGPP刺激的响应。

6 GGPP和FBP1结合调控肝细胞癌发生发展

鉴于GGPP对于FBP1活性的重要调控作用以及FBP1自身作为一个肿瘤抑制蛋白的重要功能，本发明研究了GGPP和FBP1结合在抑制小鼠肝细胞癌发生发展进程中的作用。结果表明，在利用高脂食物和化学诱变制造小鼠原发性肝细胞癌模型时，野生型小鼠会形成肝癌(图15A-B)；而给肝癌造模小鼠回补GGOH，可以显著抑制小鼠肝癌的发生发展(图15C-E)。图15为本发明的GGOH可以逆转小鼠肝细胞癌的发生发展图；A.高脂食物和化学诱变制造小鼠原发性肝细胞癌模型的时间线；B.正常对照组、高脂食物和化学诱变小鼠原发性肝细胞癌组以及GGOH回补后的逆转情况；C-E.B中三组小鼠肝细胞癌的恶性程度比较和肿瘤数量以及体积大小的统计分析。

同样，在肝癌细胞系Huh7和HepG2中，GGPP处理也可以显著抑制肝癌细胞的活力和增殖(图16)。在Huh7或HepG2中转入FBP1-WT和FBP1-R50N时，这两种细胞的活力没有明显变化；而转入FBP1-WT和FBP1-R50N同时加入GGPP处理，则FBP1-WT/GGPP组较FBP1-R50N/GGPP显著降低，表明FBP1-R50位点对于其响应GGPP刺激至关重要(图13)。图16为本发明的GGPP处理显著抑制肝癌细胞的活力和增殖图；A.GGPP处理显著抑制了肝癌细胞Huh7的活力和增殖；B.GGPP处理显著抑制了肝癌细胞HepG2的活力和增殖。图13.FBP1-R50位点突变抑制了FBP1响应GGPP刺激抑制肝癌细胞的活力图；A-B.R50的突变降低了FBP1响应GGPP刺激抑制肝癌细胞Huh7的活力和增殖的能力；C-D.R50的突变降低了FBP1响应GGPP刺激抑制肝癌细胞HepG2的活力和增殖的能力。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。