玉米侧器官边界蛋白基因ZmLBD24及应用
阅读说明：本技术 玉米侧器官边界蛋白基因ZmLBD24及应用 (Corn side organ boundary protein gene ZmLBD24 and application ) 是由 原亚萍 单晓辉 石月红 刘宏魁 苏胜忠 李世鹏 李贺 于 2021-06-09 设计创作，主要内容包括：玉米侧器官边界蛋白24基因ZmLBD24及应用属分子生物学和生物技术领域,ZmLBD24的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；一种高体胚发生率玉米自交系Y423侧器官边界蛋白24,由ZmLBD24基因编码,其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；一种植物表达载体,含有玉米自交系Y423玉米侧器官边界蛋白24基因ZmLBD24；构建了植物表达载体并转化拟南芥,通过诱导观测转基因拟南芥、野生型拟南芥以及突变体拟南芥的愈伤发生情况,结果显示玉米自交系Y423侧器官边界蛋白24基因ZmLBD24可提高拟南芥的愈伤形成能力。(The corn side organ boundary protein 24 gene ZmLBD24 and the application belong to the field of molecular biology and biotechnology, the nucleotide sequence of ZmLBD24 is shown as SEQ ID NO: 1; a high somatic embryogenesis rate maize inbred line Y423 side organ boundary protein 24 is coded by ZmLBD24 gene, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO. 2; a plant expression vector, which contains a maize inbred line Y423 maize side organ boundary protein 24 gene ZmLBD 24; a plant expression vector is constructed and arabidopsis thaliana is transformed, and callus occurrence conditions of transgenic arabidopsis thaliana, wild type arabidopsis thaliana and mutant arabidopsis thaliana are observed through induction, and the result shows that the maize inbred line Y423 side organ boundary protein 24 gene ZmLBD24 can improve the callus formation capability of arabidopsis thaliana.)
技术领域
本发明属于分子生物学和生物
技术领域
，具体涉及一种玉米侧器官边界蛋 白基因ZmLBD24及应用。背景技术
玉米是世界上最重要的粮食作物之一，可以作为粮食、饲料及工业原料使 用。但是随着世界人口的增长和生态环境的恶劣，可用耕地面积越来越少。因 此，提高玉米产量显得尤为重要。但是，传统的育种方法对玉米品种的改良已 经无法满足生活需要。转基因技术的迅猛发展，为玉米的遗传改良贡献了巨大 力量，它能利用优良基因改良玉米农艺性状并大大缩短育种年限。理想的受体 系统是提高转基因效率的关键之一，玉米体细胞胚胎是理想的受体材料。因此， 深入研究体细胞胚胎发生的分子机理，并探究体细胞胚胎发生相关基因的功能， 对良好受体系统的建立具有重要意义。
侧器官边界蛋白LBD(lateral organboundaries domain)转录因子家族，又名ASL(asymmetric leaves2-like)基因家族，是一类植物所特有的转录因子。LBD 基因家族在植物生长发育和代谢调控多个过程中发挥关键作用，前期科学研究 多关注于该基因家族在侧生器官发育时期，如对植物器官花、茎、叶、根形成 时的重要影响。而近期研究大大拓展了LBD基因家族的生物学功能，发现该基 因家族还与植物再生、植物二次生长、病原菌反应、非生物胁迫信号响应等植 物生理过程密切相关，并参与植物愈伤组织形成的分子调控网络。
实际上，LBD在双子叶模式植物拟南芥基因组内有42个LBD基因中，在双 子叶林木植物毛果杨基因组内发现57个LBD基因，在单子叶经济作物水稻基 因组内有35个LBD基因，在玉米中有44个LBD基因。
LBD该家族因包含由100多个氨基酸残基组成的保守区段即LOB(lateral organboundaries)结构域而被命名。保守的LOB结构域由三部分组成，高度保 守的C基序(C-block)、Gly-Ala Ser基序(GAS-block)和类亮氨酸拉链模体 (leucine zipper-likeblock)。其中，C基序由22个氨基酸组成，4个保守的Cys 残基被不保守的X残基隔开，形成CX2CX6CX3C的结构模式，是结合DNA所 必需的序列结构；GAS基序由49个氨基酸组成，包含1个保守的脯氨酸残基， 是影响其生物活性的结构域；类亮氨酸拉链模体由19个氨基酸组成，4个保守 的亮氨酸残基被不保守的X残基隔开，形成LX6LX3LX6L的结构模式，与蛋白 质的二聚化相关；可变C末端紧接在保守的LOB结构域的类亮氨酸拉链模体之 后，各基因在此区域的氨基酸序列具有特异性。
目前已有文献表明LBD转录因子能够促进愈伤的形成。拟南芥中AtLBD16、AtLBD17、AtLBD18和AtLBD29的异位表达可以促进拟南芥在无外源激素的培 养基上自发形成愈伤，并与AtbZIP59相互作用，调控AtFAD-BD的表达来促进 愈伤的形成。同时，WOX11-LBD16这个通路也是愈伤组织获得多能性所必须 的，破坏这个通路会导致愈伤组织不能进一步分化成芽，但目前为止未见有关 玉米ZmLBD24基因改变植物愈伤发生能力的报道。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较 佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化 或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省 略不能用于限制本发明的范围。
因此，本发明的目的是(1)提供了一种DNA序列，其是在高体胚发生率 自交系Y423中克隆得到的编码含有LOB结构域的转录因子24基因，命名为ZmLBD24；(2)提供玉米含有LOB结构域的转录因子24基因ZmLBD24在拟南 芥愈伤形成基因工程方面的应用。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方 案：
玉米侧器官边界蛋白ZmLBD24，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1 所示
SEQ ID NO.1的序列
(i)序列特征：(A)长度：657bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
提取课题组自行培育的玉米自交系Y423 T3代的愈伤组织的RNA，反转录成 cDNA为模板，以ZmLBD24-FP/RP为特异引物，采用RT-PCR技术对ZmLBD24 基因进行克隆。将扩增产物进行电泳检测，在657bp左右处有扩增条带，与预 期目的基因大小相一致。将扩增产物的凝胶回收片段连接到pMD18-T载体上， 转化Top10大肠杆菌感受态，将阳性的单克隆菌液进行Sanger测序，获得玉米 自交系Y423侧器官边界蛋白ZmLBD24基因预期完整的开放阅读框(ORF)全 序列。
玉米自交系Y423侧器官边界蛋白基因ZmLBD24 ORF全长为657bp，起始 密码子为ATG，终止密码子为TAG，如SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述的玉米侧器官边界蛋白ZmLBD24及应用的一种优选方案， 其中：所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1编码，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示
SEQ ID NO.2的序列
(i)序列特征：(A)长度：218a.a.；(B)类型：氨基酸；(C)链性：单链。
(ii)分子类型：氨基酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
MANGGAAAAAAAAAAAAATGAGSPCGACKFLRRRCVPECVFAPYFSSDQGAARFAAIHKVFGASNASKLLSHLPVA DRCEAVVTITYEAQARLRDPVYGCVAQIFALQQQVAILQAQLMQAKAQLACGVQGAAAHSPASHHHHQWPDSASISALLR QDAACSARRPGGPLDDFFTPELVAGFRDDVAAAAGQHCAGKVDAGELQYLAQAMMRSPNYSL。
玉米自交系Y423侧器官边界蛋白24由218个氨基酸组成，此蛋白属于侧 器官边界蛋白LBD(lateral organboundaries domain)转录因子家族，通过对玉 米、水稻、拟南芥等不同物种中的LBD蛋白进行系统进化分析，发现它们存在 数个分支，表明了它们的功能可能各不相同。而ZmLBD24与AtLBD16(拟南 芥)以及LOC Os02g57490.1(水稻)的亲缘关系最近。
作为本发明所述的玉米侧器官边界蛋白ZmLBD24及应用的一种优选方案， 其中：一种重组植物表达载体，含有如权利要求1所述的玉米含有LOB结构域 的转录因子24基因ZmLBD24。
根据ZmLBD24基因的ORF序列及中间载体pMD18-T多克隆位点的相关信 息，设计引物时加入相应酶切位点以扩增ZmLBD24基因。将经测序验证的、准 确的ZmLBD24基因用相应的限制性内切酶酶切，回收小片段(基因)。同时将 表达载体pCAMBIA3301以相同限制性内切酶酶切，回收大片段(载体)。用 DNA连接酶将回收的大、小片段连接，重组为ZmLBD24基因的植物表达载体。 之后将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。
作为本发明所述的玉米侧器官边界蛋白ZmLBD24及应用的一种优选方案， 其中：玉米含有LOB结构域的转录因子24基因ZmLBD24在拟南芥愈伤形成基 因工程方面的应用。
利用蘸花法将含有ZmLBD24基因的植物表达载体导入拟南芥，经Basta筛 选及分子鉴定，获得T2代拟南芥转基因植株。对T2代转基因拟南芥植株进行 愈伤诱导实验分析，结果表明，过表达植株愈伤发生显著优于野生型。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种高体胚发生率玉米自 交系Y423的核苷酸序列及氨基酸序列，构建了植物表达载体并转化拟南芥，通 过以拟南芥根、叶及整株幼苗为外植体在B5+0.5mg/L2,4-D+0.05mg/L KT培养 基上诱导转基因、野生型及突变体拟南芥的愈伤组织，观测转基因拟南芥、野 生型及突变体形成愈伤的状态，综合以上实验结果显示玉米侧器官边界蛋白24 基因ZmLBD24可提高拟南芥的愈伤形成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实 施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前 提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为玉米ZmLBD24蛋白与其他植物LBD蛋白氨基酸的多重序列比较图 (其中：OsAS2为水稻；AtLOB为拟南芥)。
图2为玉米ZmLBD24基因的系统进化树分析示意图。
图3为以拟南芥种子为外植体的愈伤诱导及统计示意图(其中：A：野生 型、突变体及过表达OE1种子诱导愈伤的情况；B：突变体诱导愈伤的情况；C： 野生型诱导愈伤的情况；D：过表达OE1诱导愈伤的情况；)。
图4为以拟南芥叶片为外植体的愈伤诱导及统计示意图(其中A：接种时 叶片状态；B：叶片愈伤诱导50天的状态；C：拟南芥叶片诱导愈伤统计(Bar： 1cm)(值代表三次生物学重复的平均值±标准差，*P＜0.05，**P＜0.01))。
图5为以拟南芥整株幼苗为外植体的愈伤诱导及统计示意图(其中：A：拟 南芥整株幼苗诱导愈伤50天的状态；B：拟南芥整株幼苗诱导50d时愈伤的数 量(值代表三次生物学重复的平均值±标准差，*P＜0.05，**P＜0.01)(Bar：1cm))。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对 本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明 还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不 违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方 式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
玉米侧器官边界蛋白24基因ZmLBD24的克隆
1.RNA的提取
培养玉米自交系Y423 T3代愈伤组织，使用康为世纪的超纯RNA提取试剂 盒(CW0581)对叶片的Total RNA进行提取。
(1)取新鲜愈伤组织在液氮中充分研磨，每30-50mg组织加入1ml TRIzonReagent，混匀。
(2)样品中加入TRIzon Reagent后温和上下颠倒几次，使样本充分裂解。 室温放置5min，
使蛋白核酸复合物完全分离。
(3)加入200μl氯仿，盖好离心管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min。
(4)4℃12000rpm离心10min，吸取上层水相550μl，将上层水相移到一 个新的RNase-Free离心管中。
(5)在水相溶液中加入550μl的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。
(6)将上一步得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心20s，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(7)向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12000rpm离心20s，倒掉收集管 中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(9)重复步骤(8)。
(10)12000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分 钟，彻底晾干。
(11)将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加 入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集RNA 溶液，-80℃保存RNA，防止降解。
2.反转录
使用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A) 对提取的RNA进行反转录。
去gDNA反应体系如下表1：
表1.去gDNA反应体系
试剂
体积
5×gDNAEraserBuffer
2μl
gDNAEraser
1μl
TotalRNA
1μg
RNaseFreeWater
upto10μl
将预混液混匀后放入42℃孵育2min，随后4℃，5min。
反转录反应SYBR Green qPCR法，具体反转录反应体系如下表2：
表2.反转录反应体系
试剂
体积
步骤1反应液
10μl
PrimeSoriptRTEnzymeMixⅠ
1μl
RTPrimerMix
1μl
5×PrimeSoriptBuffer2
4μl
RNaseFreeWater
4μl
整个体系放入PCR仪中，程序设置37℃，15min；85℃，5s。
3.ZmLBD24基因ORF全长的扩增
根据MaizeGDB公布的玉米ZmLBD24基因的ORF基因序列，运用生物信 息学软件Primer 5.0遵循引物设计原则，设计该基因的特异性克隆引物，如下所 示：
ZmLBD24-FP：5’-CGGGATCCTCGGAGACGATCTATCGACTAG-3’
ZmLBD24-RP：5’-TCCCCCGGGAAAACGCATGGTGTCTGATT-3’
以反转录得到的cDNA为模板，使用高保真耐热DNA聚合酶PrimeSTAR GXLDNApolymerase克隆ZmLBD24，反应体系和程序如表3。注：若cDNA浓 度太低，可适当增加cDNA的用量。若第一次PCR的目的条带过浅，可用其回 收产物继续进行同样步骤的PCR，PCR反应体系如表3：
表3.PCR反应体系
组分
体积
5×PrimeSTARGXLBuffer
10μl
dNTPMixture
4μl
ZmLBD24-FP
1μl
ZmLBD24-RP
1μl
cDNA
2μl
PrimeSTARGXLDNAPolymerase
1μl
灭菌蒸馏水
31μl
PCR反应程序如表4：
表4.PCR反应程序
4.ZmLBD24的DNA片段回收
使用生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对ZmLBD24目的片段进行回 收。
(1)电泳后切取含有ZmLBD24目的片段的胶块，称重，置于1.5ml离心 管中。根据胶块的重量，每100mg左右的凝胶对应加入300μl Buffer B2。
(2)将离心管放入50℃金属浴10min，在此期间可数次颠倒离心管使融化 的液体和未融化的胶块混匀，加速溶化。
(3)将所得溶液置于吸附柱中并以8000rpm离心30s。如果溶液的总体积 大于750μl，每次加入750μl，多次重复操作。
(4)向吸附柱中加入300μl BufferB2，转速设定为9000rpm，离心30s，然 后倒出废液。
(5)向吸附柱中加入500μl BufferB2，设置转速为9000rpm，离心时间30s。 倒掉废液。再重复一次。
(6)把空的吸附柱和收集管一起放入离心机中，在9000rpm条件下离心60s。 取一个新的1.5mL的离心管，将吸附柱放入其中，晾置10min。
(7)在吸附膜中央加入30μl TE buffer或ddH2O，室温静置2min，在9000rpm 条件下离心60s。将该步骤中所得到的DNA溶液放在-20℃的冰箱中保存或用于 后续试验。
5.ZmLBD24连接pMD18-T Vector
使用TaKaRa的DNAA-Tailing Kit以及pMDTM18-T Vector Cloning Kit将目 的片段与pMD18-T载体进行连接，获得重组载体用于基因测序。
(1)对ZmLBD24胶回收DNA片段的3’末端进行加“A”反应。
①在200μl离心管中配制如下连接反应体系如下表5：
表5.连接反应体系
组分
体积
10×A-TailingBuffer
5μl
dNTPMixture
4μl
A-TailingEnzyme
0.5μl
ZmLBD24回收段
25μl
ddH<sub>2</sub>O
15.5μl
②72℃反应20min。
③冰中静置2min。
(2)对上述A-Tailing化的DNA片段与pMD18-T载体进行连接。pMD18-T 连接反应体系如下表6：
表6.连接反应体系
组分
体积
pMD18-TVector
1μl
A-TailingZmLBD24DNA
4μl
SolutionI
5μl
反应程序：16℃反应1h。
6.Top10大肠杆菌感受态转化及PCR检测
(1)将50μl TOP10大肠杆菌感受态置于冰上融化。
(2)用移液枪吸取连接产物或重组质粒5μl，加到50μl的TOP10大肠杆菌 感受态中。
(3)冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴5min。随后加入800μl LB液体 培养基。
(4)37℃震荡培养1h，8000rpm离心5min。弃掉上清液，在离心管中留 有大约50μl培养基。用移液枪吹打混匀后，将其涂布于含有相应抗生素的LB 固体培养基上，37℃恒温，倒置培养12-16h。
(5)挑取单菌落于800μl含有相应抗生素的LB液体培养基中，将离心管 放入摇床，37℃180rpm，振荡培养10h左右。
(6)使用Ex Taq酶对菌液进行PCR分子检测。对PCR结果为阳性的菌液 进行扩摇，并在菌液中加15％甘油，送华大基因公司进行测序，原菌液于-80冰 箱保存。
实施例2
玉米基因的生物信息学分析
ZmLBD24基因编码一种玉米侧器官边界蛋白24，其开放阅读框有657bp的 核苷酸，编码218个氨基酸，相对分子量为22564.63Da，等电点为8.10。
利用TMHMM Serverv.2.0在线网站，对该蛋白的跨膜区域进行预测，结果 如图4所示。
利用prosite.expasy在线网站对基因结构域预测发现ZmLBD24属于LOB((lateral organ boundaries domain))基因家族，具有LOB保守结构域，如图2 所示，通过对玉米、水稻、拟南芥等不同物种中的LBD蛋白进行系统进化分析， 发现它们存在数个分支，表明了它们的功能可能各不相同。而ZmLBD24与LOC Os02g57490.1(水稻)以及AtLBD16(拟南芥)的亲缘关系最近。目前已有文 献表明LBD转录因子能够促进愈伤的形成，但目前为止未见利用玉米ZmLBD24 基因提高植物愈伤发生的报道。
实施例3
ZmLBD24植物表达载体的构建
1.根据中间载体pMD18-T多克隆位点处相应序列，引物设计时加入相应酶 切位点。
2.把经过高保真酶扩增出的基因，通过回收、加A、连接T载体、转化、 PCR酶切鉴定、测序等一系列步骤，确定表达基因的正确性，有完整的开放阅 读框、无错配、无移码。
3.把测序正确的基因利用其设计的酶切位点酶切，回收小片段(基因)。
选限制性核酸内切酶SmaⅠ和BamHⅠ，将测序正确的ZmLBD24从pMD18-T 重组载体上切下，酶切体系如表7所示。
表7.酶切体系
组分
体积
SmaⅠ
2.5μl
BamHⅠ
2.5μl
10×TBuffer
5μl
0.1％BSA
5μl
DNAorvector
20μl
灭菌水
15μl
30℃水浴3h。
4.把表达载体pCAMBIA3301以上述两种相同限制性内切酶切，回收大片 段(载体)。
5.把回收的大片段与小片段连接，
6.转化大肠杆菌感受态、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。将从pMD18-T 载体上酶切的ZmLBD24片段和pCAMBIA-3301载体片段于16℃连接3h。连接 体系如表9所示。
表8.连接体系
组分
体积
目的片段
5.5μl
载体大片段
2.5μl
10×T4ligasebuffer
1μl
T4DNAligase
1μl
实施例4
转ZmLBD24基因拟南芥的获得及分子检测
利用蘸花法对基因进行拟南芥转化，具体如下：
1.将开花的拟南芥倒置使花蕾朝下，侵入农杆菌菌液中1.5min。
2.将转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光强度下生长24h后置于 正常光照条件下培养生长，一周后同上再侵染一次。
3.转化后植株可正常地开花生长，待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获 种子。
4.收获的部分T0代种子经Basta筛选，PCR鉴定，获得T1代转基因植株， 经过1次加代，获得T2代拟南芥植株，可用于后续的表型筛选。
实施例5
T2代转ZmLBD24基因拟南芥的诱导愈伤组织实验
以拟南芥种子为外植体诱导愈伤组织：分别随机播种拟南芥中LBD16基因 的同源突变体、野生型与本发明的转基因拟南芥种子于1/2MS+2mg/L的诱导培 养基上诱导愈伤组织形成，观察转基因拟南芥、野生型及突变体诱导40天后形 成愈伤的状态。
以拟南芥叶片为外植体诱导愈伤组织：分别随机播种拟南芥中LBD16基因 的同源突变体、野生型与本发明的转基因拟南芥种子于1/2MS培养基上培养7d， 然后将其转移至B5+0.5mg/L2,4-D+0.05mg/L KT培养基上诱导，观察转基因拟 南芥、野生型及突变体诱导45天后形成愈伤的状态。
以拟南芥整株幼苗为外植体诱导愈伤组织：分别随机播种拟南芥中LBD16 基因的同源突变体、野生型与本发明的转基因拟南芥种子于1/2MS培养基上培 养7d，然后将其转移至B5+0.5mg/L2,4-D+0.05mg/L KT培养基上诱导，观察转 基因拟南芥、野生型及突变体诱导50天后形成愈伤的状态。
总之，以拟南芥种子为外植体诱导愈伤组织形成，突变体拟南芥种子形成 的愈伤面积极显著小于野生型，过表达拟南芥种子形成的愈伤面积极显著大于 野生型；对每8粒野生型、过表达及突变体拟南芥种子形成的愈伤组织进行称 重并进行统计学分析，突变体拟南芥种子形成的愈伤组织的质量极显著低于野 生型，过表达拟南芥种子形成的愈伤组织的质量极显著高于野生型。上述结果 表明，ZmLBD24基因可提高野生型拟南芥种子形成愈伤组织的能力，促进愈伤 组织的正常生长发育。
以拟南芥叶片为外植体诱导愈伤组织形成，过表达拟南芥的叶片形成的愈 伤组织生长状态良好，呈鲜黄色，小米粒状。面积、体积均较大，已将接种时 的叶片全部覆盖。野生型拟南芥叶片形成愈伤的量明显少于过表达株系，初始 接种的叶片边缘仍清晰可见。突变体拟南芥的叶片仅有少数能在切口处处形成 少量愈伤，且表现为褐化的状态。使用imageJ软件，对每个叶片形成的愈伤面 积进行统计分析，表明过表达株系每个叶片形成的愈伤面积极显著高于野生型， 突变体则极显著低于野生型。暗示着ZmLBD24提高了野生型拟南芥叶片形成愈 伤组织的能力，对于拟南芥的愈伤形成有促进作用。
以拟南芥整株幼苗为外植体诱导愈伤组织形成，过表达株系植株整株已被 致密的愈伤组织所覆盖，愈伤组织生长状态良好。野生型植株根部较叶片而言， 有相对多的愈伤形成，但明显少于过表达株系形成愈伤的量。突变体不论叶片 还是根部，均有极少量的愈伤产生。统计分析单位长度的愈伤面积，突变体拟 南芥植株每毫米形成的愈伤面积极显著低于野生型，过表达拟南芥植株每毫米 形成的愈伤面积极显著高于野生型。并且，过表达拟南芥形成愈伤的面积与 ZmLBD24基因的表达量呈正相关。综上表明，玉米ZmLBD24基因转入野生型 拟南芥后，极显著提高了其形成愈伤的能力，进一步表明了该基因对愈伤组织形成的促进作用。
根据上述技术，本发明从玉米自交系Y423中得到一个Y423侧器官边界蛋 白24基因ZmLBD24。通过农杆菌介导的转化方法，将ZmLBD24植物表达载体 成功转化拟南芥，获得了T2代转基因拟南芥植株。以拟南芥的叶片、种子及整 株幼苗为外植体诱导愈伤组织形成，转基因拟南芥与野生型及突变体相比，转 基因植株形成的愈伤状态更好，且生物量更多，综合以上实验结果显示玉米侧 器官边界蛋白24基因ZmLBD24可提高拟南芥的愈伤形成，表明本发明的转基 因拟南芥植株的愈伤形成能力相对较强。
上述结果均说明玉米自交系Y423侧器官边界蛋白24基因ZmLBD24能提 高拟南芥的愈伤形成能力。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发 明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。 尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通 过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性 的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中 公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。