具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

本发明提供一种化疗相关基因表达特征在预测胰腺癌化疗反应应答及免疫细胞浸润中的应用，化疗相关基因表达特征包括BCHE，ADH1A和TNS4基因组织表达情况。基因组织表达情况包括基因表达值，基因表达值计算方法为目标基因实时荧光定量PCR结果数值，以内参基因GAPDH结果数值行标准化后，再作log2转化。基因组织表达情况包括化疗相关基因表达特征评分计算，特征评分计算公式为|[(-0.60912)×BCHE表达值]+[(-1.61995)×ADH1A表达值]+[0.01775×TNS4表达值]|；根据特征评分高低，分为高评分组和低评分组。

本发明提供一种基于化疗相关基因表达特征的预测模型在预测胰腺癌患者术后化疗反应应答的应用，预测模型包括因素输入模块和预测结果输出模块；因素输入模块包括上述的特征评分；预测结果输出模块包括胰腺癌患者术后化疗无复发生存的概率。预测模型的构建方法是通过多因素比例风险回归分析分别得到无复发生存时间独立的预测因子作为模型的输入因素，通过Cox回归计算变量偏回归系数并将预测模型图形化为Nomogram模型。

本发明提供一种化疗相关基因表达特征在制备预测胰腺癌化疗反应应答检测试剂盒中的应用，化疗相关基因表达特征包括BCHE，ADH1A和TNS4基因组织表达情况。

本发明提供一种化疗相关基因表达特征在制备预测胰腺癌免疫细胞浸润检测试剂盒中的应用，化疗相关基因表达特征包括BCHE，ADH1A和TNS4基因组织表达情况。

本发明提供一种化疗相关基因表达特征在制备预测胰腺癌术后辅助化疗无复发生存概率检测试剂盒中的应用，化疗相关基因表达特征包括BCHE，ADH1A和TNS4基因组织表达情况。

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的在于提供化疗相关基因表达特征在预测胰腺癌化疗反应应答及免疫细胞浸润中的应用，确定了一种能在肿瘤组织中检测，可以反映胰腺癌术后化疗反应敏感性、免疫亚群浸润和判断预后不良风险的分子特征，因此可用于筛选对化疗或免疫治疗有效的患者，提高治疗效果，从而促进个体化精准治疗。

本发明第二个目的是提供了一种基于化疗相关基因表达特征的预测模型，能够定量准确预测胰腺癌患者术后辅助化疗后的无复发生存概率的Nomogram预测模型，可用于鉴定高风险患者进行重点监测和及时更换治疗方案，从而改善患者预后。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：提供一种化疗相关基因表达特征在预测胰腺癌化疗反应应答及免疫细胞浸润中的应用。化疗相关基因表达特征建立包括如下步骤：

(1)、筛选TCGA数据库中胰腺癌测序数据，纳入符合条件的术后辅助化疗病例，并分为化疗敏感组和化疗耐药组。

(2)、利用R语言Limma包，设置条件为|Log2fold change|>1and p<0.05，确定化疗敏感组和耐药组间差异基因(differentially expressed genes,DEGs)。

(3)、利用CIBERSORT算法

(https://cibersort.stanford.edu/index.php)，分析肿瘤浸润免疫细胞组成。

(4)、利用上述得到的DEGs，行单因素Cox生存分析，设置p<0.05,确定生存相关DEGs；再利用Lasso-penalized Cox分析和多因素Cox生存分析，最终确定与化疗反应、生存预后独立性相关的DEGs。

在上述步骤(4)中，通过研究发现，最终得到的DEGs为Butyrylcholinesterase(BCHE)、alcohol dehydrogenase1A(ADH1A)和tensin4(TNS4)，利用三个基因名称的首字母组成该基因特征最终名称，即命名为“BAT”-“蝙蝠”特征。根据多因素Cox生存分析的回归系数，确定“蝙蝠”特征评分计算公式为：|[(-0.60912)×BCHE表达值]+[(-1.61995)×ADH1A表达值]+[0.01775×TNS4表达值]|。

“蝙蝠”特征验证包括如下步骤：

(1)、收集胰腺癌患者的手术切除标本，一部分提取RNA，一部分采用低聚甲醛固定，并用石蜡包埋构建组织微阵列芯片。

(2)、样本RNA行实时荧光定量PCR分析BCHE、ADH1A和TNS4的表达；组织微阵列芯片切片脱石蜡后，采用抗CD4、CD8、CD11C、MPO、CD68抗体孵育过夜，再用辣根过氧化物酶连接的第二抗体孵育，之后进行免疫组化染色，即使用哈里斯氏苏木精进行细胞核染色。

(3)、根据免疫组化染色结果将胰腺癌患者最终的组织各免疫细胞亚群浸润水平划分为高浸润和低浸润，根据患者的临床随访信息，对高浸润和低浸润的患者预后进行分析和统计学比较。

(4)、通过实时荧光定量PCR测得的BCHE、ADH1A和TNS4的表达以内参基因GAPDH结果数值行标准化后，再作log2转化，计算出“蝙蝠”特征评分，进而分为高分组和低分组，根据患者的临床随访信息，对高分组和低分组的患者无复发生存时间进行分析和统计学比较，反映对术后辅助化疗反应应答情况；同时利用独立样本t检验或秩和检验，评估“蝙蝠”特征评分与肿瘤免疫亚群细胞浸润的关联。

在上述步骤(3)中，组织免疫细胞浸润水平的评估方法为阳性细胞计数法；

通过计算出组织切片上的间质面积(mm²)以及该区域内不同阳性免疫细胞个数，使用以下公式进行计算：免疫细胞总个数/间质面积(mm²)；

根据ROC曲线的约登指数，计算出每个免疫亚群的最佳截断值，将高于截断值的定义为高浸润，将低于截断值的定义为低浸润。

在上述步骤(4)中，通过研究发现，测定并计算胰腺癌“蝙蝠”特征评分大小将患者划分为高评分组和低评分组，可有效判断患者术后辅助化疗后的早期复发风险，同时证实高“蝙蝠”特征评分的肿瘤具有较低的CD4+和CD8+T细胞浸润。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种基于“蝙蝠”特征的预测模型在预测胰腺癌术后辅助化疗无复发生存时间中的应用；实际上，“蝙蝠”特征为上述的“蝙蝠”特征。预测模型由因素输入模块和预测结果输出模块构成。其中，因素输入模块包括：“蝙蝠”特征评分；预测结果输出模块包括：胰腺癌患者术后化疗无复发生存的概率。

其中，术后6个月，12个月和18个月无复发生存的概率的计算方法分别为：相应预测模型中“蝙蝠”特征评分所在位置所对应的概率尺度轴数值。

预测模型的构建方法如下：

通过多因素Cox回归分析分别得到无复发生存独立的预测因子作为模型的输入因素，通过Cox回归计算每个变量偏回归系数并将预测模型图形化为Nomogram模型。

实施例：

1.研究对象：

本实施例的研究对象为29例胰腺癌患者术后肿瘤组织，纳入及排除标准为：

(1)无其他恶性肿瘤病史；

(2)术前未曾接受过癌症治疗，术前未发现转移；

(3)术前没有感染或其他炎症的迹象；

(4)根治性切除；

(5)术后病理明确诊断为胰腺导管腺癌。

2.研究方法：

(1)收集胰腺癌患者的手术切除肿瘤组织标本，一部分组织利用四氯化碳、异丙醇、无水乙醇溶液提取组织mRNA；一部分组织进行低聚甲醛固定，石蜡包埋以构建组织微阵列芯片。

(2)收集胰腺癌患者的临床病理信息和术后随访数据

常规的临床病理信息包括年龄、性别、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原50(CA50)水平。术后病理报告包括肿瘤大小、部位、分化、神经侵犯、血管侵犯和淋巴转移等内容。术后辅助治疗情况包括化疗方案、是否放疗等。

随访第1年每3个月进行1次，随后第2年每3-6个月进行1次，然后每年1次。随访内容包括血常规、肝功能检查、血清肿瘤标志物检测、腹部超声和胸片。对怀疑复发的患者实施了增强CT或磁共振成像。无复发生存期(RFS)定义为从手术日期到复发日期(或最后一次随访)的时间间隔。

(3)建立与胰腺癌术后辅助化疗应答及生存预后相关的“蝙蝠”特征

通过从TCGA公共数据库中获得182例胰腺癌病人组织测序数据，经与临床术后化疗及随访数据匹配后，最终确认26例胰腺癌组织纳入化疗耐药组，24例纳入化疗敏感组。利用R语言Limma包，设置条件为|Log2 fold change|>1and p<0.05，确定组间差异基因(differentially expressed genes,DEGs)。利用上述得到的DEGs，行单因素Cox生存分析，设置p<0.05,确定生存相关DEGs；再利用Lasso-penalized Cox分析和多因素Cox生存分析，最终确定与化疗反应、生存预后独立性相关的DEGs，并根据多因素Cox生存分析回归系数，确定“蝙蝠”特征评分计算公式。

(4)肿瘤组织实时荧光定量PCR分析“蝙蝠”特征与化疗应答反应相关性

将提取得到的mRNA利用逆转录试剂盒将其转为cDNA，并设计引物序列BCHE，ADH1A和TNS4基因引物分别为：F-BCHE：TCCATAGTGAAACGGTGGGC，R-BCHE：AGGCCAGCTTGTGCTATTGT；F-ADH1A：AAGTATCCGTACCATTCTGATGTTT，R-ADH1A：TCTTTGGAAAGCCCCCAAATG；F-TNS4：CTGCAAACTCACCATCCCACA，R-TNS4：AAGGTGGTGGAGATGGCTTTC，行实时荧光定量PCR分析。PCR测得的BCHE、ADH1A和TNS4的表达以内参基因GAPDH结果数值行标准化后，再作log2转化，计算出“蝙蝠”特征评分，进而分为高分组和低分组，根据患者的临床随访信息，对高分组和低分组的患者无复发生存时间进行分析和统计学比较，行Kaplan–Meier生存分析绘制生存曲线，并采用Log-rank检验差异有无统计学意义，以反映对术后辅助化疗反应应答情况；

(5)、肿瘤组织免疫浸润细胞亚群免疫组化染色

将脱石蜡的胰腺癌组织切片浸入3％的H₂O₂中以淬灭内源性过氧化物酶活性，然后与抗CD4、CD8、CD11C、MPO、CD68抗体孵育过夜(抗体稀释比例为1：100)在4℃下孵育过夜。第二天将切片与辣根过氧化物酶第二抗体和二氨基联苯胺溶液一起孵育。用哈里斯氏苏木精染剂进行细胞核染色。随后，计数免疫细胞浸润水平为单位面积内的阳性细胞数，其通过计算出组织切片上的间质面积(mm²)以及该区域内不同阳性免疫细胞个数，使用以下公式进行计算：免疫细胞总个数/间质面积(mm²)；根据ROC曲线的约登指数，计算出每个免疫亚群的最佳截断值，将高于截断值的定义为高浸润，将低于截断值的定义为低浸润。

(6)、“蝙蝠”特征评分与胰腺癌浸润免疫亚群的关系

利用CIBERSORT算法(https://cibersort.stanford.edu/index.php)，初步分析TCGA病例化疗敏感组和耐药组的肿瘤浸润免疫细胞亚群差异(幼稚B细胞，记忆B细胞，浆细胞，CD8+T细胞，幼稚CD4+T细胞，静息记忆T细胞，活化记忆T细胞，滤泡辅助T细胞，调节性T细胞，γδ+T细胞，静息NK T细胞，活化NK T细胞，单核细胞，M0巨噬细胞，M1巨噬细胞，M2巨噬细胞，静息树突状细胞，活化树突状细胞，静息肥大细胞，活化肥大细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞)。进而将上述“蝙蝠”特征评分高评分和低评分组，分别再结合免疫组化结果，利用独立样本t检验或秩和检验，分析与肿瘤浸润CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的相关性，进一步评估“蝙蝠”特征评分与肿瘤免疫亚群细胞浸润的关联。

(7)胰腺癌术后化疗复发相关预测Nomogram模型的构建和评价

通过多因素Cox比例风险回归分析鉴定出胰腺癌患者术后RFS独立的预测因子，并纳入预测模型中进行Cox回归以计算变量的偏回归系数，使用R语言软件中的rms包建立图形化的Nomogram。相应的生存概率＝相应Nomogram模型中“蝙蝠”特征评分所在位置所对应的概率尺度轴数值。

3.实验结果：

(1)通过从TCGA公共数据库中获取满足纳入条件的胰腺癌病例，化疗耐药组26例，化疗敏感组24例。火山图分析显示，在化疗敏感组和耐药组中，共鉴定出569个DEG，其中490个上调基因和79个下调基因(如图1A)；分级聚类分析图展示出化疗敏感组和耐药组的前50个DEG表达模式，以区分对术后辅助化疗的反应程度(图1B)。利用上述得到的DEGs，行单因素Cox生存分析，结果显示共有25个DEGs被鉴定与OS具有显著相关性(P<0.05,表1)。接着，利用Lasso-penalized Cox分析，结果显示丁酰胆碱酯酶(BCHE)、WAP4-二硫基核心结构域3(WFDC3)、磺基转移酶家族1B成员1(SULT1B1)、印度刺猬信号分子(IHH)、醇脱氢酶1A(ADH1A)、张力蛋白4(TNS4)和荷电多泡体蛋白4B假基因1(CHMP4BP1)具有较好的鉴别效能(图2A-2B)。最后多因素Cox生存分析结果显示，BCHE、ADH1A和TNS4是与术后化疗应答反应相关的独立性预后预测基因，BCHE和ADH1A在化疗敏感组中表达水平显著高于化疗耐药组，而TNS4则低于化疗耐药组(P<0.05，图2D-2F)。进而，利用这三个基因(BCHE，ADH1A和TNS4)组成一个新的特征评分，取其首字母组成英文单词“BAT”，故命名为“蝙蝠”特征评分。根据多因素Cox生存分析的回归系数，最终确定“蝙蝠”特征评分计算公式为：|[(-0.60912)×BCHE表达值]+[(-1.61995)×ADH1A表达值]+[0.01775×TNS4表达值]|，结果显示在化疗耐药组中，“蝙蝠”特征评分显著高于化疗敏感组(P<0.05，图2C)

表1.单因素Cox生存分析与总体生存相关的差异基因

(2)根据TCGA数据计算得到“蝙蝠”特征评分，将病例分成两组，低评分组和高评分组，Kaplan-Meier生存分析结果显示低评分组患者的中位OS为38.4个月(95％可信区间：17.3-52.3)，显著高于高评分组的17.5个月(95％可信区间：8.6-26.3，P＝0.003，图3A)，低评分组1年、2年和3年OS率分别为86.6％、72.7％和36.4％，而高评分组为67.4％、27.6％和10.4％。受试者工作曲线分析结果显示，“蝙蝠”特征评分预测术后辅助化疗应答水平及总体生存的曲线下面积分别为0.734和0.780(图3B-3C)。结合TCGA临床数据，单因素Cox生存分析中，年龄越大(P＝0.137)、BAT评分越高(P＝0.005)、ACT反应越好(P＝0.037)是重要的潜在危险因素；而在多因素Cox生存分析中，仅有“蝙蝠”特征评分(P＝0.040,风险比＝3.299；95％可信区间：1.058-10.289)仍然是OS的独立预测因子(表2)。

表2.单、多因素Cox生存分析影响总体生存的独立性风险因素

(3)纳入的29例胰腺癌组织标本实时荧光定量PCR结果显示，BCHE、ADH1A、TNS4的中位△CT值分别为9.1[四分位数的间距(IQR)：7.1-10.5)]、8.8(IQR：7.7-10.4)、6.4(IQR：4.3-8.3)。根据所建立的公式，将患者按“蝙蝠”特征评分大小分为两个单独的队列，单因素和多因素Cox生存分析结果进一步表明，“蝙蝠”特征评分是影响术后接受辅助化疗的胰腺癌患者RFS的独立危险因素(P＝0.014,风险比＝5.172，95％置信区间：1.403--19.063，表3)。高“蝙蝠”特征评分患者的中位RFS为9个月(95％可信区间：6.0-12.0)，明显短于低“蝙蝠”特征评分患者(未达到，图3D)，两组间的生存差异显著具有统计学意义，该结果提示“蝙蝠”特征评分能够有效反映胰腺癌术后辅助化疗效果。

表3.单、多因素Cox生存分析影响胰腺癌术后辅助化疗复发的相关独立性风险因素

(4)TCGA数据库数据CIBERSORT分析结果显示，活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、静止树突状细胞、M0巨噬细胞具有明显的上升趋势(图4)。为了进一步验证，图5分别是两个胰腺癌病例组织芯片免疫组化染色结果，分别表示了CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD11C+树突状细胞、CD68+巨噬细胞和MPO+中性粒细胞在癌组织中的浸润情况。病例1代表了CD4+T细胞高度浸润、CD8+T细胞高度浸润、CD11C+树突状细胞中度浸润、CD68+巨噬细胞高度浸润和MPO+中性粒细胞低度浸润；而病例2代表了CD4+T细胞低度浸润、CD8+T细胞低度浸润、CD11C+树突状细胞中度浸润、CD68+巨噬细胞中度浸润和MPO+中性粒细胞高度浸润，其中病例1的RFS显著长于病例2。统计分析发现，肿瘤浸润CD4+和CD8+T细胞在“蝙蝠”特征评分较高的组织中明显减少(P值分别为0.015和0.021，图6A-6B)；然而，巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞浸润并没有显著差异(图6C-6E)。此外，还发现“蝙蝠”特征评分高的病人更倾向于接受基于吉西他滨方案的术后化疗(P＝0.022)，以及更高的“蝙蝠”特征评分通常预示着早期复发，这可能表明高“蝙蝠”特征评分患者更容易吉西他滨耐药(表4)。

表4.“蝙蝠”特征评分与胰腺癌临床特征及免疫浸润细胞亚群间的相关性分析

(5)将“蝙蝠”特征评分纳入相应的Cox回归中构建出预测术后辅助化疗后6月、12月和18月RFS的Nomogram模型，即将无复发生存时间多因素Cox比例风险回归分析中具有统计学意义的指标纳入相应的Cox回归中构建Nomogram模型。6月、12月和18月RFS生存概率＝“蝙蝠”特征评分所处的位置所对应6月、12月和18月生存概率刻度轴数值(如图7)

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。