具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

实施例1

1.实验材料

牛II型胶原蛋白(Chondrex，Inc)，不完全弗式佐剂(Chondrex，Inc)，甲氨蝶呤购自多伦多研究化学公司，川陈皮素购自上海源叶责任有限公司(纯度＞99％)。一抗： Anti-P-gp(ab170904)，AKT(4691T)，p-AKT(4060T)，PI3K(4257T)，p-PI3K(17366S)， PKM2(4053T)，HK2(2867T)，LDHA(3582T)，HIF-1α(36169T)，β-actin(3077T)购自美国Abcam公司和美国Cell Signaling Technology公司。二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ATP检测试剂盒(H245)、GLUCOSE检测试剂盒(A012-1)、Lacate检测试剂盒(H093) 均购自南京建成生物工程研究所。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡测试试剂盒(559763)购自美国BD公司。10×SDS-PAGE电泳缓冲液(B1005-500ML)，10×蛋白电转移缓冲液 (B1006-500ml)，超敏发光液(P1010-100ML)购于北京普利莱基因技术有限公司。 SDS-PAGE电泳液(P0014B-10L)，Western及IP细胞裂解液(P0013-100ML)，蛋白酶抑制剂PMSF(100m M)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (P0012A)，Quickblock^TM封闭液(TBSTx)购于碧云天生物技术研究所。Blue Plus IV Protein Marker(10-180kDa)购自于北京全式金生物技术有限公司。

2.动物实验

2.1动物实验模型的建立

牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎小鼠模型：用0.05mol/L醋酸溶液溶解牛Ⅱ型胶原蛋白，取适量牛Ⅱ型胶原溶液(浓度为2mg/ml)逐滴加入至等容积的不完全弗氏佐剂中，用匀浆机进行充分乳化，操作过程完全在冰上进行，以保持低温，以滴入水中不扩散为成功标准。造模的小鼠尾根部用75％酒精消毒后，于尾根部皮下注射上述乳化后的混合液 0.2ml/只，7天后，在相同部位按0.1ml/只加强免疫一次。接下来，在初次免疫后第21 天，向小鼠进行了不完全弗氏的100μg牛II型胶原蛋白的强化皮内注射。

1.2动物分组及给药

雄性DBA/1J小鼠28只，适应性喂养一周后，随机选5只作为正常组(Normal组) 剩余23只建立CIA模型，只有20只造模成功(关节炎指数≥2)。将造模成功的大鼠采用随机数字法分成4组，每组5只，分别为模型组(Model组)，NOB组，MTX组，联合组(NOB+MTX组)。每5只动物被放置在一个独立的笼子里，房间内自动控制照明(12 小时光/暗循环，灯光从8:00到20:00)，控制温度(22-25℃)和相对湿度(45-50％)，自由给予食物和水。二次免疫后3天开始给药，连续给药9周。MTX组每只老鼠一周三次灌胃给药1mg/kg，TPE-CA组每天一周三次灌胃给药20mg/kg。NOB+MTX组每只老鼠灌胃给药MTX和NOB，剂量次数同MTX和NOB单独给药组。

1.3关节炎指数(AI)评估

二次免疫后开始评分，每三天评一次，按照0-4级评分法进行评价。根据关节红肿程度进行评分。评分标准如下：(1)关节无红肿，0分；(2)小趾关节轻度发红或肿胀， 1分；(3)小趾关节和足趾肿胀、发红，2分；(3)踝关节下的整个脚爪全部肿胀、发红，3分；(4)踝关节严重肿胀和发红，4分。

1.4 Micro-CT分析

小鼠整只爪子放在10％多聚甲醛固定，一周后选择小鼠前爪和踝关节的样品进行微型CT(SkyScan 1176，SkyScan，比利时阿尔特斯拉尔)扫描。Micro-CT的扫描参数为电压50Kvp，鼠标功率40W和叠加的6帧。扫描和重建后，将执行三维图像屏幕截图和骨骼参数分析。

2.5滑膜组织病理学评估

滑膜组织被固定在10％中性福尔马林至少24小时后，70％、80％、95％(I、II)、100％ (I、II)酒精进行逐级脱水，二甲苯I、II透明，之后石蜡包埋切片，HE染色，苏木素染液染细胞核，伊红染细胞浆，最后光学显微镜观察病理变化。染色具体过程如下：

(1)取石蜡切片进行水化：二甲苯I、II各15min，100％(I、II)、95％、80％、70％酒精各5min，蒸馏水洗两次，每次1min。

(2)加入苏木素10min，自来水冲洗2min。

(3)1％盐酸酒精分化5-10s。

(4)自来水蓝化30min。

(5)0.5％伊红酒精液复染2min。

(6)80％酒精5-10s，95％(I、II)酒精各2min，100％(I、II)酒精各5min，二甲苯I5min，二甲苯II 10min。

(7)中性树胶封片。

2.6 Western blot

关节在加有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解30min提取总蛋白。蛋白浓度使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)测定，提取的蛋白放在-80℃条件下保存。50 微克蛋白电转移到PVDF膜上，用10％SDS聚丙烯酰胺凝胶分离，PVDF膜用5％脱脂奶粉封闭两个小时，用对应的一抗4度孵育过夜，第二天回收一抗，用TBST洗涤5次，每次5min，加入二抗(1:5000)，室温摇床孵育2小时，回收二抗，用TBST洗5次，每次5min，显影。

2.7免疫组化分析

免疫组化，又称免疫组织化学技术，是应用抗原抗体反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究。为了检测滑膜组织中P-gp的表达，我们采用了免疫组化方式，具体步骤如下：

1、4％多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20％蔗糖溶液(4℃)中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；

2、加入配好的0.3％的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml+30％过氧化氢)30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；

3、加入配好的0.3％Triton X100(30％Triton X100+0.01MKPBS 100ml)30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；

4、加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g)稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；

5、加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；

6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；

7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；

8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

2.8耐药细胞的培养

(1)含药培养液的配制：根据每个给药周期目标所需要的含药浓度取出相应体积的甲氨蝶呤母液，加入含有10％的FBS和GMEM培养基中，充分混匀成目标浓度的给药培养基。

(2)采用逐步递增甲氨蝶呤浓度的方法诱导处理RA-FLS细胞，以10μg/ml为初始浓度，为避免凋亡细胞、细胞碎片以及代谢产物对活细胞造成伤害，24h后去除去旧的培养基，换含有相同浓度甲氨蝶呤的新鲜培养基。待细胞耐受并稳定生长后，对细胞进行1:2的传代。下一培养周期增加药物浓度，如此细胞最终能够耐受250μg/ml，并在终浓度下维持培养1个月，后更换为无药培养转继续培养。共历时7个月成功建立 MTX获得性耐药细胞系

2.9 CCK-8检测耐药细胞IC50及耐药指数

(1)取对数生长的RA-FLS，RA-FLS/MTX细胞，用适量含10％EDTA的胰酶消化后，制成单细胞悬液。以每孔4000个细胞接种至96孔板(注意边接种边混匀细胞)。为防止边缘效应的发生，在周围孔中每孔加入100uL PBS溶液。

(2在37℃5％CO；条件下的培养箱中培养24小时，细胞贴壁后，轻轻吸出旧的培养基。每孔加入200L含不同浓度甲氨蝶呤的培养基，RA-FLS细胞的初始浓度10μg/ml， RA-FLS/MTX细胞的初始浓度100μg/ml.共6个浓度梯度。同时设定不含药物对照组。每个浓度组设置5个复孔。

(3)继续培养72h后，小心吸去上清。避光条件下，在每孔中加入110μL预先配置的CCK-8工作液(CCK-8试剂:不含FBS的GMEM培养基＝1:10)，另外设置5个空白对照孔。继续在恒温培养箱避光孵育2h。

(4)用酶标仪测定450nm波长处各孔吸光度(OD)值，并通过Graphpad Prism 6.0软件分别计算各浓度的抑制率和半数抑制浓度(IC50)。耐药指数(RF)＝IC50 (RA-FLS/MTX细胞)/IC50(RA-FLS细胞)

2.10流式细胞术检测细胞凋亡

(1)收集细胞：取10⁴的对数生长期细胞接种于6孔板中，放入培养箱中过夜，第二天，MTX和NOB分别单独和联合作用于细胞24h后，收集细胞，注意要合并上清和消化下来的细胞；

(2)清洗细胞：用预冷的PBS洗2遍细胞；

(3)分组：每一次实验分为不染组、单染Annexin V组、单染PI组以及PI和AnnexinV双染组，处理组按从低到高进行双染；

(4)染色：用PBS把4×binding buffer稀释到1×缓冲液，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL的1×的binding buffer，用移液枪吹打细胞使细胞充分重悬，避光条件下加入染料。不染组不加，单染组加Annexin V或PI 5μL，Annexin V和PI双染组加入Annexin V和PI各5μL，并用移液枪轻轻混匀；

(5)上机检测：室温避光孵育15分钟后，加入1×的binding buffer 300μL并混匀后避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，1h内在流式细胞仪上机检测。

2.11数据统计分析

结果以平均值±标准差(SD)表示。使用Graphpad Prism 6.0单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较。同时使用Tukey’s多重比较来比较各组之间的差异性。p<0.05 的值被认为具有统计学意义。(*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001)

3实验结果

3.1 NOB联合MTX对CIA小鼠类风湿关节炎指数(Arthritis Index)的影响

由于正常组的小鼠后足表现正常，关节炎评分为0分，故图中未标明正常组的关节炎指数。关节炎评分显示，CIA小鼠的临床表现和爪肿明显高于正常组。同时，治疗组的爪肿胀得到改善。如图1所示，与CIA组的小鼠相比，NOB组的关节炎评分降低。且具有统计学差异(p<0.05)。重要的是，与MTX和NOB组的关节炎评分相比，NOB 和MTX的组合从第46天起显着降低了关节炎评分。且具有统计学差异(p<0.05)。

3.2 NOB对RA小鼠中II型胶原引起的关节损伤的影响

为了进一步研究NOB对CIA小鼠的影响，H&E进行了小鼠踝关节的组织学评估。如图所示，正常组的组织结构未见明显异常，软骨表面光滑，无浸润，脂肪细胞层与胶原纤维界限清晰，胶原纤维排列整齐。然而，在CIA小鼠中，我们观察到组织结构重度异常，脂肪细胞层与胶原纤维界限不清，胶原纤维排列紊乱，有明显的滑膜增生，血管翳形成，炎性细胞浸润和软骨变性。MTX的治疗改善了这些病理变化，NOB单独给药略微降低了病理表现。MTX+NOB组治疗的组织学评分明显低于CIA组(图)，并且略微优于MTX组(p<0.05)。

3.3 NOB对P-gp表达的影响

Western blot和免疫组化用来检测滑膜组织中P-gp的表达。在图3C中，CIA组的P-gp 表达明显高于正常组。与CIA组相比，NOB组中P-gp的表达明显下调。同样的，MTX 组中p-gp的表达在治疗后高于正常组，并且MTX和NOB组合后P-gp的表达下调。这些结果提示NOB可以逆转滑膜组织中CIA小鼠的MTX抗性。此时，NOB处理可以降低 P-gp的表达，而P-gp与耐药性密切相关，因此有必要探讨NOB在耐药性中的潜在机制。 3.4甲氨蝶呤耐药株的成功建立

通过逐步递增甲氨蝶呤浓度法诱导RA-FLS细胞，从10μg/ml的初始浓度开始诱导，待细胞耐受后倍增药物浓度，终浓度为250μg/ml，共历时7个月成功在体外构建甲氨蝶呤获得性耐药细胞株RA-FLS/MTX。进行细胞毒性实验，比较甲氨蝶呤对RA-FLS、 RA-FLS/MTX细胞增殖的抑制作用。

细胞毒性实验结果提示，随着甲氨蝶呤浓度的增加，亲本细胞RA-FLS和耐药细胞RA-FLS/MTX的存活率都逐渐降低，甲氨蝶呤对RA-FLS细胞增殖的抑制作用明显强于 RA-FLS/MTX细胞，P<0.05。甲氨蝶呤对亲本细胞的IC 50值为(46.99±2.47)μg/ml，对耐药细胞RA-FLS/MTX的IC 50值为(354.30±11.30)μg/ml，计算得RF为7.54。表明经过长时间的诱导，RA-FLS/MTX细胞对甲氨蝶呤的敏感性逐渐降低，产生了显著的耐药，成功构建了甲氨蝶呤获得性耐药细胞株。

3.5 NOB对亲本和耐药细胞的细胞毒性作用

为了评估NOB和MTX的组合是否可以协同杀伤RA-FLS/MTX细胞，我们单独或联合使用浓度升高的NOB和MTX处理RA-FLS/MTX细胞48小时。如图所示，NOB的添加使MTX使得RA-FLS/MTX细胞的IC50明显下降。使用NOB和MTX联合处理在甲氨蝶呤的RA-FLS/MTX耐药株细胞里显示出协同抑制作用(表1)。这些结果表明，NOB 和MTX的组合对耐药细胞具有抑制作用。

表1.甲氨蝶呤和川陈皮素在RA细胞中的IC 50值

3.6 NOB对耐药细胞RA-FLS/MTX的凋亡的影响

为了检查NOB对RA-FLS/MTX耐药细胞中MTX诱导的凋亡的影响，我们使用了流式细胞仪来检测这一结果。通过单独或联合使用NOB和MTX处理RA-FLS/MTX细胞24 小时，并使用Annexin V/PI分析检测凋亡结果。结果表明，NOB+MTX组的凋亡率明显高于RA-FLS/MTX组和MTX组。(p<0.05)这些发现提示了NOB可以增加耐MTX的RA-FLS /MTX细胞的凋亡，同时恢复耐药细胞的敏感性。

3.7 NOB在细胞中对P-gp功能和表达的影响

研究表明，NOB及其衍生化的药物耐药性细胞对不同的途径敏感。考虑到NOB可以增加RA-FLS/MTX的凋亡，我们提出NOB是否可以通过下调P-gp的表达来抑制RA 的耐药性。为了证实该假设，使用蛋白质印迹和定量RT-PCR来测量P-gp的水平。P-gp 在RA-FLS/MTX细胞中比在RA-FLS细胞中表达更多。NOB是否影响P-gp的表达和功能是我们首先要关注的问题。结果表明，单独使用NOB或MTX或其组合会显着影响P-gp 的表达，并显着降低RA-FLS/MTX细胞中P-gp的mRNA水平。Rh123是P-gp的已知底物，用于监测P-gp的功能。结果表明，Rh123在RA-FLS细胞中积累，但在RA-FLS/MTX 细胞中不积累。值得注意的是，NOB尤其能促进Rh123进入RA-FLS/MTX细胞。结果表明，NOB通过部分抑制P-gp的活性和功能，为MTX进入RA-FLS/MTX细胞铺平了道路。

4讨论

一方面，从实验结果可以看出NOB与MTX联用可以减少CIA小鼠体内的软骨和骨骼损伤，并改善爪肿胀和关节炎损伤。另一方面，CIA组中P-gp的表达明显高于正常组，而NOB可以逆转该P-gp的表达。另一方面，并且发现MTX组中的P-gp表达与CIA组相似。这些结果表明，NOB可能下调RA中P-gp的表达，从而减少MTX的流出并维持MTX 的功效。为了进一步证明这一现象，我们以耐MTX的RA-FLS/MTX细胞为体外研究对象，以进一步探索NOB是否可以使MTX对RA-FLS细胞中的MDR敏感。在RA-FLS/MTX 细胞中观察到NOB和MTX之间有明显的协同作用。值得注意的是，在NOB的非细胞毒性浓度下，NOB+MTX共同处理可恢复RA-FLS/MTX细胞的生长抑制和细胞凋亡。因此，结果提示NOB可以作为潜在化学增敏剂克服RA中的耐药性。