高良姜素在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的用途
阅读说明：本技术 高良姜素在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的用途 (Application of galangin in preparation of medicine for treating necrotic enteritis of chicken ) 是由 吕强华 陈停停 邓旭明 王建锋 宋泽宇 邱家章 周永林 徐蕾 王琳 邓彦宏 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及高良姜素在治疗鸡坏死性肠炎中的医用用途,并通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、产气荚膜梭菌生长曲线、生物被膜形成抑制试验、产气荚膜梭菌粘附至Caco-2细胞试验和雏鸡坏死性肠炎模型免疫器官指数和回肠菌落定植试验验证高良姜素对产气荚膜梭菌感染所致的鸡坏死性肠炎具有良好的保护作用。由于传统抗生素的滥用和细菌耐药性的不断加强,高良姜素具有成本低廉,无耐药性、药物残留和治愈率高的特点。因此,高良姜素用于治疗鸡坏死性肠炎可以增加使用药物的选择性,具有广阔的应用前景,对新药开发具有重要意义。(The invention relates to medical application of galangin in treating necrotizing enterocolitis of chickens, and the galangin is proved to have good protection effect on necrotizing enterocolitis of chickens caused by clostridium perfringens infection through a clostridium perfringens sliding motion inhibition test, a clostridium perfringens growth curve, a biofilm formation inhibition test, a clostridium perfringens adhesion to Caco-2 cell test, a chicken necrotizing enterocolitis model immune organ index and ileum colony colonization test. Due to abuse of traditional antibiotics and continuous reinforcement of bacterial drug resistance, galangin has the characteristics of low cost, no drug resistance, no drug residue and high cure rate. Therefore, the galangin used for treating the necrotic enteritis of the chickens can increase the selectivity of the used medicine, has wide application prospect and has important significance for the development of new medicines.)
技术领域
本发明涉及高良姜素在治疗鸡坏死性肠炎中的用途，涉及高良姜素在制备治疗鸡坏死性肠炎药物中的应用，属于医学制药技术领域。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种革兰氏阳性、产生芽胞、严格厌氧及形成特殊荚膜的梭状杆菌，是梭状芽胞菌属中的主要成员之一，广泛存在于人和动物的肠道中，是近年来导致我国家禽“猝死症”的主要病原。该菌感染可引起人类和动物的多种疾病，主要引起人类的气性坏疽和食物中毒。在家禽中，产气荚膜梭菌是引起坏死性肠炎的关键病原体，严重危害家禽养殖业的发展。该菌群属典型的条件致病菌,正常情况下产气荚膜梭菌栖息于鸡的盲肠，不会引起发病，但当机体产生应激或有疾病发生的条件下，小肠的内环境会发生改变(缺氧)或者肠道受损(球虫、霉菌毒素)的情况下产气荚膜梭菌会大量繁殖，并产生大量毒素。产气荚膜梭菌可产生多种毒素，根据最为主要的4种外毒素(α，β，ε和ι)可将产气荚膜梭菌分为A-E五个毒素型，家禽主要感染A型。家禽感染后，主要引起坏死性肠炎，病变主要集中在小肠部位，表现为小肠显著肿大至正常的2～3倍，肠管变短，肠道表面呈污灰黑色，肠壁变薄，肠腔内充盈着灰白色或黄白色服样渗出物，膜呈严重纤维素性坏死。据统计，在全球范围内，因坏死性肠炎爆发造成的经济损失高达20亿美元，严重危害家禽养殖业的发展。
IV型菌毛(TFP)是一种存在于细菌细胞膜上的一种运动器官，它在宿主细胞的定植和入侵、生物膜形成和滑动运动中起关键作用，这对于产气荚膜梭菌感染至关重要。通过靶向TFP功能能够干扰细菌在肠道的粘附定植，从而达到治疗产气荚膜梭菌感染的目的。目前，治疗产气荚膜梭菌引起的仔鸡坏死性肠炎首选方法是在饲料中加入抗生素，但由于抗生素的长期使用和滥用常常导致细菌耐药性的产生。因此，亟需开发安全有效的抗生素替代物解决这一技术难题，天然化合物具有来源广泛、毒副作用小、成本低、药残低、安全范围广和不易诱导耐药等诸多优势，是筛选抗生素替代物的重要资源。
高良姜素(Patchouli alcohol)，化学名为3，5，7-三羟基黄酮，是从姜科植物高良姜的干燥根茎中提取分离得到的黄酮类化合物。现代医学研究表明，高良姜素具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化和抗炎等作用。近年来，大量的文献对高良姜素的药理活性进行了报道。但是，截止到目前国内外尚无高良姜素用于治疗产气荚膜梭菌所致鸡坏死性肠炎的相关研究。
发明内容
本发明提供了高良姜素在治疗鸡坏死性肠炎中的医用用途，对产气荚膜梭菌所致的鸡坏死性肠炎具有良好的治疗效果。
本发明通过产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验、生物被膜形成抑制试验、生长曲线试验和产气荚膜梭菌粘附至Caco-2细胞试验，证明高良姜素显著抑制产气荚膜梭菌Ⅳ型菌毛系统(TFP)的活性和功能，且对产气荚膜梭菌无杀菌或抗菌活性。雏鸡产气荚膜梭菌坏死性肠炎模型表明高良姜素对产气荚膜梭菌坏死性肠炎具有良好的保护作用。
本发明所述高良姜素分子式为C15H10O5，分子量为270.23。高良姜素的化学结构式如下：
附图说明
图1：高良姜素抑制产气荚膜梭菌在半固体BHI平板上的滑动运动；
图2：高良姜素在有效浓度范围内不抑制产气荚膜梭菌的生长；
图3：高良姜素抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成；
图4：高良姜素抑制产气荚膜梭菌对Caco-2细胞的黏附；
图5：高良姜素提高感染肉鸡免疫器官指数；
图6：高良姜素降低感染肉鸡回肠菌落定植。
具体实施方式
实施例1
高良姜素在治疗鸡坏死性肠炎中的医用用途，以高良姜素为活性成分制成药学上可接受任何剂型。
实施例2
高良姜素所述的治疗鸡坏死性肠炎指由细菌引起的坏死性肠炎。
实施例3
高良姜素所述的治疗鸡坏死性肠炎是指由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎。
1.产气荚膜梭菌滑动运动抑制试验
产气荚膜梭菌标准株ATCC13124于2ml液体BHI培养基37℃厌氧培养12h。取300μl该培养物接种于2ml液体BHI中，37℃继续厌氧培养5h。培养完毕，取1ml培养物，12000rpm离心5min弃上清，菌体重悬于500μl BHI液体培养基中制备菌悬液。
将5μl上述菌悬液分别滴加于含不同终浓度(4～32μg/ml)高良姜素的0.7％琼脂BHI平板，37℃厌氧培养72h，统计细菌滑动运动结果。
结果表明：在浓度为16μg/ml时，高良姜素显著抑制产气荚膜梭菌ATCC13124的滑动运动(见图1)。
2.产气荚膜梭菌生长曲线
产气荚膜梭菌于2ml液体BHI培养基中37℃厌氧培养12h。次日，接种于200ml新鲜BHI培养基继续培养至OD600nm＝0.3时，等量分装至6个锥形瓶内，每瓶20ml。各瓶分别加入高良姜素使其终浓度分别为4、8、16、32和64μg/ml，同时设DMSO对照组，37℃静置厌氧培养，每间隔1h测定细菌培养物OD600nm值并记录，直至细菌生长至平台期，绘制生长曲线。结果表明：在有效浓度范围内(4～64μg/ml)，高良姜素均不影响产气荚膜梭菌的生长(见图2)。
3.产气荚膜梭菌生物被膜形成抑制试验
产气荚膜梭菌于2ml液体BHI培养基中37℃厌氧培养12h，12000rpm离心5min弃上清，用灭菌PBS洗涤一次，然后用TSB液体培养基重悬并调整菌悬液OD600nm＝0.1，取400μl菌悬液置于24孔板，加入高良姜素并使其终浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml及16μg/ml，另设DMSO对照组和TSB培养基对照组，每组3个重复，将24孔板置于30℃厌氧培养120h。培养结束，弃上清，灭菌PBS洗两次，37℃干燥1h，加入400μl 1％结晶紫染液，室温静置孵育45min，弃去结晶紫染液，灭菌PBS洗两次。每孔加入33％乙酸，吹打混匀后每孔取100μl分别加入96孔板，使用酶标仪测定570nm处吸光值，将未加高良姜素组设为100％，根据结晶紫吸光值计算生物被膜形成率。
结果表明：在浓度为16μg/ml时，高良姜素显著抑制产气荚膜梭菌生物被膜的形成(见图3)。
4.高良姜素对产气荚膜梭菌粘附至Caco-2细胞的抑制作用
用不含血清及抗生素的DMEM培养基调整浓度为3×105cells/ml，将Caco-2细胞接种于24孔板，每孔加入1ml细胞悬液，置于37℃和5％CO2培养箱过夜培养。产气荚膜梭菌于2ml液体BHI培养基中37℃厌氧培养12h，分别与不同浓度高良姜素(0、2、4、8和16μg/ml)共孵育4h，然后用不含血清及抗生素的DMEM培养基调整菌悬液浓度至6×107CFUs，以MOI＝200感染细胞1h。用灭菌PBS洗去未粘附至细胞的细菌，每孔洗3次，加入1ml含0.2％的TritonX-100，反复吹打50次，并置于水平摇床震荡10min，倍比稀释法涂布于BHI平板，37℃过夜厌氧培养，计数菌落。
结果表明：高良姜素在有效浓度范围内显著抑制产气荚膜梭菌黏附至Caco-2细胞(见图4)。
5高良姜素对肉鸡产气荚膜梭菌坏死性肠炎的治疗作用
5.1肉鸡产气荚膜梭菌坏死性肠炎模型的建立
23日龄的雄性爱拔益加(Arbor Acre)肉仔鸡，连续四天灌胃0.5ml产气荚膜梭菌ATCC13124菌悬液(浓度为1×109CFUs)，建立雏鸡坏死性肠炎模型。5.2高良姜素对肉鸡产气荚膜梭菌坏死性肠炎的治疗作用
根据上述方法，建立肉仔产气荚膜梭菌坏死性肠炎模型，治疗组给予50mg/kg高良姜素，每天一次，连用五天，同时设置空白对照组和感染对照组。
5.3免疫器官指数
给药结束后30日龄肉鸡称重后全部剖检，取每组各只肉鸡的脾脏、胸腺和法氏囊进行称重，统计和分析各组肉鸡的免疫器官指数。免疫器官指数＝免疫器官重量(g)/肉鸡体重(g)。
5.4回肠菌落定植计数
无菌取上述各组肉鸡回肠制备1％PBS组织研磨匀浆液，倍比稀释涂布于BHI血平板，37℃厌氧培养过夜，计数各组回肠菌落定植数(见图5)。
结果表明：与感染对照组相比，高良姜素治疗显著降低产气荚膜梭菌感染肉鸡回肠的菌落定植数，并且显著提高感染肉鸡免疫器官指数。综上所述，高良姜素对肉鸡产气荚膜梭菌感染引发的坏死性肠炎具有良好的保护作用。
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