木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用
阅读说明：本技术 木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用 (Cassava disease-resistant related gene MeAHL17 and application thereof ) 是由 丁泽红 胡伟 铁韦韦 颜彦 于 2021-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用；所述MeAHL17的CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明准确鉴定了MeAHL17在抵抗木薯细菌性枯萎病中的功能,为木薯细菌性枯萎病改良提供了理论依据和关键基因,具有重要的应用价值。(The invention discloses a cassava disease-resistant related gene MeAHL17 and application thereof; the CDS nucleotide sequence of MeAHL17 is shown in SEQ ID No. 1. The invention accurately identifies the function of MeAHL17 in resisting the bacterial wilt disease of cassava, provides theoretical basis and key genes for improving the bacterial wilt disease of cassava, and has important application value.)
技术领域
本发明涉及生物育种领域，具体涉及一种木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用。
背景技术
木薯(Manihot esculenta Crantz)是热带、亚热带地区重要的经济作物和粮食作物，在我国农业和工业生产中占有举足轻重的地位。木薯细菌性枯萎病(cassavabacterial blight，CBB)是当前木薯生产中非常严重的病害之一，可导致木薯产量大幅度减少，严重威胁了农民增收和木薯产业的可持续发展。
因此，如何有效的挖掘木薯细菌性枯萎病抗性候选基因，并对其进行详细的功能研究，以期为木薯细菌性枯萎病改良提供重要基因资源，是当前木薯生物育种领域亟待解决的难题。
木薯细菌性枯萎病是一个重要的农艺性状。由于木薯基因组高杂合度，在很大程度上限制了通过亲本杂交构建分离群体、采用传统图位克隆的方法定位木薯细菌性枯萎病抗病基因；同时木薯科研基础较差、转基因体系也不成熟性，极大的限制了木薯细菌性枯萎病抗病基因的挖掘，使得尚没有可用的基因应用于木薯抗病遗传改良。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用，其可为木薯细菌性枯萎病改良提供基因资源和重要参考依据，为基因改良和生物育种提供依据。
为实现上述目的，本发明所提供一种木薯抗病相关基因MeAHL17，所述MeAHL17的CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述木薯抗病相关基因MeAHL17编码的MeAHL17蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供了一种木薯抗病相关基因MeAHL17的启动子，其核苷酸序列如SEQID No.3所示。
本发明还提供了一种上述木薯抗病相关基因MeAHL17或MeAHL17的启动子在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。
本发明还提供了一种上述木薯抗病相关基因MeAHL17或MeAHL17的启动子在培育植物新品种中的应用，优选地，所述植物为木薯。
本发明的有益效果：
(1)本发明准确鉴定了MeAHL17在抵抗木薯细菌性枯萎病中的功能，为木薯细菌性枯萎病改良提供了理论依据和关键基因，具有重要的应用价值；
(2)本发明表明MeAHL17启动子区的A/G等位变异与木薯细菌性枯萎病的抗感性有关。通过检测该基因型，有利于木薯细菌性枯萎病抗性的早期预测和快速筛选，加快木薯抗病育种进程。
附图说明
图1为MeAHL17基因定位及功能SNP分析图；
图中，图1A为木薯细菌性枯萎病GWAS分析图，将候选基因定位于第2染色体11.65-11.70Mb区间；
图1B为候选基因转录组比较分析图；
图1C为MeAHL17基因模型，红色虚线表示功能SNP在MeAHL17的启动子区域中的位置；
图1D为双荧光素酶测定比较含A和含G的MeAHL17启动子区域(转录起始位点上游300bp和600bp)的活性图，每个样品包含8个生物学重复样品；
图1E为基于AA和AG的MeAHL17等位基因的木薯细菌性枯萎病抗性比较图；
图2为MeAHL17抗病性功能分析图；
图中，图2A为在Xam侵染0和2天后，带有AG等位基因(Yunnan8和ZM9781)和AA等位基因(ZM95308和RuishiX3)的木薯中MeAHL17表达量差异图，表达量通过qRT-PCR检测，每个样品测定3个生物学重复，数据表示为平均值±标准差，**表示P<0.01；
图2B为在上述四个品种(其中ZM95308和RuishiX3均携带AA等位基因；Yunnan8和ZM9781均携带AG等位基因)中分别用pCAMBIA1304(载体对照，VC1)，pCAMBIA1304::MeAHL17(超表达，OE)，pTRV(载体对照，VC2)或pTRV::MeAHL17(RNA沉默，RNAi)转化的木薯叶片中MeAHL17的表达量差异图；表达量通过qRT-PCR检测，每个样品测定3个生物学重复，数据表示为平均值±标准差，*表示P<0.05，**表示P<0.01；
图2C为在Xam侵染0和6天后，用pCAMBIA1304(载体对照，VC1)，pCAMBIA1304::MeAHL17(超表达，OE)，pTRV(载体对照，VC2)或pTRV::MeAHL17(RNA沉默，RNAi)转化的木薯叶片中的细菌数量图；数据表示为平均值±标准差，*表示P<0.05，**表示P<0.01，每个样品测定4个生物学重复。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1木薯抗病相关基因MeAHL17筛选
1.基于木薯种质自然群体开展全基因组关联分析，快速锁定与木薯细菌性枯萎病相关的基因区间
木薯种质自然群体来自于农业农村部儋州木薯种质资源圃。任意选择其中299份木薯材料，取新鲜的嫩叶在液氮中冷冻，采用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，北京)提取基因组DNA。每个样品均用5μg基因组DNA构建插入片段大小为500bp的pair-end文库。使用Illumina X-Ten平台对每个样品的150bp配对末端读数进行测序。使用BWA mem v0.7.17程序将每个样品的测序读数比对到木薯SC205参考基因组。使用Samtools v1.9和Picardv1.94对比对结果进行排序和重复标记处理。
删除低质量的reads后，单端和双端比对上的reads均采用GATK toolkit v3.5流程检测SNP。HaplotypeCaller模块用于建立包含SNP和Indel的原始基因型文件，并使用以下参数对其进一步过滤：“QUAL<2.0||QD<2.0||MQ<40.0||FS>60.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0-clusterSize 2-clusterWindowSize 5”和“QD<2.0||FS>200.0||ReadPosRankSum<-20.0”。使用SnpEff v3.6c软件对已识别的SNP和Indel进行注释。使用“主等位基因频率(MAF)>0.05和缺失数据<20％”过滤低质量SNP，共获得了1,313,775个高质量SNP。
根据中国木薯细菌性枯萎病的技术规范(NY/T 3005-2016)评估木薯种质的细菌性枯萎病。使用三个生物学重复的平均值来确定抗性水平。随后以木薯细菌性枯萎病为表型性状，开展全基因组关联分析(GWAS)。由ADMIXTURE v1.3.0生成的AQ矩阵被看作是固定效应，使用SPAGeDi v1.3a构建亲属(K)矩阵。相应的P值阈值0.000001被设置为控制全基因组I型错误率。
结果表明：第2染色体11.65-11.70Mb区间与木薯细菌性枯萎病显著关联(图1A)。
2.基于转录组比较分析，进一步筛选候选基因
转录组数据来自于NCBI-SRA数据库，登录号为SRP045199。去除接头序列和低质量reads后，通过HISAT2 v2.0.4将干净读数比对到SC205参考基因组。基因表达水平由StringTie v1.3.4d使用默认参数计算。基因表达水平采用FPKM进行归一化处理。使用DEseq2软件鉴定差异表达基因。差异表达基因被定义为FDR<0.01且倍数变化>2。
基于木薯基因组注释，在第2染色体11.65-11.70Mb区间共有6个候选基因。有趣地是，在木薯细菌性枯萎病处理条件下，仅Sc02g014000的表达受病菌显著诱导(图1B)。
因此，推断Sc02g014000是调控木薯细菌性枯萎病的重要候选基因，该基因编码一个含有AT-hook结构域的核定位蛋白，根据基因同源性将其命名为MeAHL17，MeAHL17的CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；MeAHL17的启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
实施例2
1.基于基因组比较分析，挖掘与基因表达显著关联的SNP位点
基于基因组重测序数据，在MeAHL17启动子区域(起始密码子上游-53bp处，即MeAHL17的启动子的核苷酸序列的948位点)发现了一个SNP变异(A/G，图1C)。
为了探索A/G等位基因变异对MeAHL17启动子活性的影响，我们在木薯原生质体中进行了双重荧光素酶测定。克隆带有A或G的MeAHL17启动子序列(-1至-300bp和-1至-600bp)，并将其插入pGreenII0800-LUC载体，并转化木薯原生质体。使用双重荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027，Beyotime，上海)测定相对荧光素酶活性。结果显示：含G的MeAHL17启动子比含A的MeAHL17启动子具有更高的活性(图1D)，表明A/G等位变异影响MeAHL17的表达。
2.大量木薯种质分析发现A/G变异与木薯细菌性枯萎病抗性显著关联
通过筛选大量木薯种质，我们发现MeAHL17携带AA等位基因的种质比携带AG等位基因的种质对木薯细菌性枯萎病更加敏感(图1E)。由此推论，启动子区的A/G等位变异调控MeAHL17的表达，进而影响木薯细菌性枯萎病的抗性。
实施例3超表达和RNAi功能验证表明MeAHL17在抵抗木薯细菌性枯萎病中发挥重要作用
为了检测MeAHL17响应细菌性枯萎病(Xam)的表达谱，我们在Xam侵染0和2天后收集了4个代表性木薯品种(其中ZM95308和RuishiX3携带AA等位基因；Yunnan8和ZM9781携带AG等位基因)的叶片。使用cDNA合成试剂盒(K1622，USA)分离总RNA并反转录。然后，以MeEF1a为内参，使用2-ΔΔCt方法通过定量实时PCR(qRT-PCR)鉴定MeAHL17的相对表达水平。
结果显示：与AG等位基因相比，携带AA等位基因的MeAHL17在Xam处理后其表达量诱导较少(图2A)。
随后，在上述4个木薯品种中同时开展超表达和RNAi功能验证。为了过表达MeAHL17，先扩增MeAHL17的编码序列并将其插入pCAMBIA1304载体，随后将带有重组载体或pCAMBIA1304(对照)的农杆菌菌株(GV3101)注射到木薯叶片中。为了沉默MeAHL17，扩增MeAHL17特异性区域并将其克隆到pTRV2载体中，随后将带有重组载体或pTRV2(对照)的农杆菌菌株(GV3101)与pTRV1一起注射到木薯叶片中。待pCAMBIA1304::MeAHL17和pCAMBIA1304转化的植物培养两天，或者pTRV::MeAHL17和pTRV转化的植物培养两周后，将Xam接种到木薯叶片中，6d后检查细菌数量和基因表达水平。
结果显示：Xam处理6天后，MeAHL17过表达后不同品种中细菌种群数量比对照显著减小，而MeAHL17沉默的品种(Yunnan8和ZM9781)中细菌种群数量比对照显著增加(图2B-C)。这些结果表明，MeAHL17在抵抗木薯细菌性枯萎病中发挥重要作用，且其启动子区的A/G等位变异与细菌性枯萎病的抗感性有关。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
中国热带农业科学院三亚研究院
<120> 木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> 木薯(Manihot esculenta)
<400> 1
atgaaaggtg aatatgtaga ggcacaccat ccaccaaagc atgaaaacgt cacccctatg 60
aacatgttct ctaaacttca tccccatccc catcaccagc tccctttctc tcagcacttc 120
caactctctc gtgaatctga agatgatgaa actagaagca ccggcgctgc cgccgtaacc 180
accccttccc ctaacaccaa tcccgccacc accacaacac caagccagaa gcagaaaccc 240
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aggggtagac cgcctggttc caagaataga cctaaaccac ctgtggtcat tacacgagac 360
cctgaaccag ctatgagtcc ttacattctc gaagtccctg gtggaagcga cgtcgttgaa 420
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<211> 312
<212> PRT
<213> 木薯(Manihot esculenta)
<400> 2
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Asp Glu Thr Arg Ser Thr Gly Ala Ala Ala Val Thr Thr Pro Ser Pro
50 55 60
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85 90 95
Val Arg Arg Pro Arg Gly Arg Pro Pro Gly Ser Lys Asn Arg Pro Lys
100 105 110
Pro Pro Val Val Ile Thr Arg Asp Pro Glu Pro Ala Met Ser Pro Tyr
115 120 125
Ile Leu Glu Val Pro Gly Gly Ser Asp Val Val Glu Ser Ile Ser Arg
130 135 140
Phe Cys Arg Arg Lys Asn Ile Gly Ile Cys Val Leu Thr Gly Ser Gly
145 150 155 160
Ala Val Thr Asn Val Thr Leu Arg Gln Pro Ser Thr Thr Pro Gly Ser
165 170 175
Thr Ile Thr Phe His Gly Ser Phe Asp Ile Leu Ser Leu Ser Ala Thr
180 185 190
Phe Met Pro Gln Pro Val Ser His Pro Val Pro Asn Thr Phe Thr Ile
195 200 205
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225 230 235 240
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<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> 木薯(Manihot esculenta)
<400> 3
tatctcttat attaattctt ttgatataaa tttatatgtt tattttaatt ttattaattt 60
tcttgatata aatttgtatg tttattttaa ttttaacttt ttatcgtaca tccaaagctt 120
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