具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

1、茶树孤儿基因CsOG3的克隆与序列结构分析

使用茶树国家级良种舒茶早(种植于安徽农业大学国家高新技术农业园，北纬31°56′，东经117°12′)的幼嫩叶片作为材料进行序列克隆。总RNA的抽提采用天根的离心柱型植物总RNA快速提取试剂盒，按照试剂盒说明书的操作步骤进行。使用核酸蛋白定量仪和凝胶电泳检测总RNA含量和质量。

反转录合成cDNA：取2μg总RNA作为模板，根据TaKaRa的PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录反应，具体如下：分别加入Oligo dTPrimer(50μM)0.6μg、Random 6mers(50μM)0.4μl、dNTP Mixture(10mM each)1.0μl，并用RNase Free dH₂O定容至10μL，65℃变性5min，立即放置冰上冷却；然后分别加入5×PrimeScript II Buffer 4.0μl、RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl、PrimeScript II RTase(200U/μl)1.0μl(200U)，并用RNase Free dH₂O补至20μl；30℃预处理10min，42℃反转录45min，95℃5min灭活反转录酶，反应结束立即置于冰上，并使用核酸蛋白定量仪检测cDNA含量和质量。

以cDNA作为PCR模板，进行茶树孤儿基因CsOG3的序列克隆。PCR所用的引物序列如下：上游引物(5'-ggccgctcgagtcgacccgggCTATTCCGCCGGTCTCTTCTT-3')，下游引物(5'-ggccgctcgagtcgacccgggCTATTCCGCCGGTCTCTTCTT-3')。PCR反应体系为：2×phanta MaxBuffer 50μL，dNTP mix 2μl，cDNA(100ng/μl)4μl，上、下游引物各4μl，Phanta max Super-Fidelity DNA Polymerase 2μl，ddH₂O 34μl。反应程序如下为①95℃3min②95℃15sec，54℃15sec，72℃35sec，30个循环③72℃5min。PCR产物CsOG3基因，连接到双酶切(酶切位点：5'BamHI，3'SmaI)且纯化回收后pGEX-4T-1载体上得到pGEX-4T-1-CsOG3质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，送通用生物系统(安徽)有限公司测序，

得到的茶树孤儿基因CsOG3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGGCTTCGTCTTCCCGTGGTCTGCTCACTCTCTTTCCAGACCTTAACGAGTCAACAAGAGAGATAACTGGTGCGGGGGCCAGTGAACCTCAACCAAGCGCCCCGGGGTTTGCTCCGTTGAACTTTCCTATGCGGTCTGTGGAGCAAAAAATGGCAGTGCAAACTGACATTGAAGCCAATCAGTATACTTTGAAGTCCTGTGTGGAGACGATGACGGCAGTCACAAACTTGTCGCACCGGCTGCAGAGTAGGACAAATGAGGTGCAACAGTTAAACTCCCAGCTGGCTCTGCTCCAACGCATGTATAAGGATGCGCGAGTAGAGATAAGTGTGCTAAAGACAGAAAACAAGGAGCTGAAGCGGAAGGCCACCGTGATGTTCCGATTTGGAGGTCCACCATATGCTGTAGTGGAGGAGCAGGGAGGAGGAAACTTGCTTGGTGGTCTAGGAAGCACGGAGGCAACACCGGCAAGGGCCGCCCAGGACAGGGGCAAAAAGAAGAGACCGGCGGAATAG

茶树孤儿基因CsOG3编码的蛋白质序列，如序列表SEQ ID NO.2所示具体如下：

MASSSRGLLTLFPDLNESTREITGAGASEPQPSAPGFAPLNFPMRSVEQKMAVQTDIEANQYTLKSCVETMTAVTNLSHRLQSRTNEVQQLNSQLALLQRMYKDARVEISVLKTENKELKRKATVMFRFGGPPYAVVEEQGGGNLLGGLGSTEATPARAAQDRGKKKRPAE。

2、低温处理下茶树孤儿基因CsOG3的表达模式

低温处理所用茶树为国家级良种舒茶早品种，种植于安徽农业大学农萃园(北纬31°52′，东经117°15′)。将盆栽茶树置于4℃下进行低温处理，分别于0h、2h、6h、12h、1d、2d、3d、7d进行样品采集和总RNA的提取以及定量PCR(qRT-PCR)。

qRT-PCR使用反转录产物稀释20倍作为模板，使用qPCRGreenMaster Mix(No Rox)，配制20μl反应体系：2μl稀释20倍的逆转录产物，上下游引物各0.4μl(10μM)，10μlqPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen,Shanghai,China)，7.2μl无菌ddH₂O，每个反应配3个重复。然后在Bio-rad CFX-96上以程序：①95℃3min②95℃10s，60℃15s，72℃30s运行40个循环③从65℃到95℃，以0.1℃/s绘制熔解曲线。上游引物：(5'-GCGAGTAGAGATAAGTGTGCTAA-3')，下游引物：(5'-GTTGCCTCCGTGCTTCCTA-3')，以茶树ACTIN基因为内参，上游引物：(5'-GCCATCTTTGATTGGAATGG-3')，下游引物：(5'-GGTGCCACAACCTTGATCTT-3')采用2^-△△CT方法进行茶树孤儿基因的相对表达量计算和分析。

图1为茶树孤儿基因CsOG3的克隆结果以及在不同组织和低温胁迫下的表达模式图。其中A：CsOG3 PCR结果的电泳图；B：CsOG3连接转化后菌液PCR验证的电泳图；C：CsOG3序列特征信息；D：CsOG3在代表性茶树组织中的表达模式；E：CsOG3在低温胁迫下的表达模式。

如图1所示，成功克隆的茶树孤儿基因CsOG3的CDS序列长度为516bp，蛋白质长度为171aa，GC含量为53.10％，蛋白质分子量为18.64kDa，等电点为9.54。通过qRT-PCR技术分析，获得了茶树孤儿基因CsOG3在低温处理0h、2h、6h、12h、1d、2d、3d、7d后的相对表达量，结果显示，CsOG3在低温处理1d后即受到诱导上调表达。CsOG3在茶树中呈组成性表达，且在芽和嫩叶中的表达量较高。

3、CsOG3基因在烟草体内的瞬时表达。

(1)CsOG3-pCambia1305.1载体构建

以pGEX-4T-1-CsOG3质粒为模板，利用引物：上游引物(5'-gtctcgaggaccggtcccgggATGGCTTCGTCTTCCCGTG-3')，下游引物(5’-gtctcgaggaccggtcccgggATGGCTTCGTCTTCCCGTG-3')，进行PCR扩增。扩增产物连接到双酶切(酶切位点：5'SmaI，3'BamHI)且纯化回收后的过表达载体pCambia1305.1-GFP上得到CsOG3-pCambia1305.1-GFP质粒。室温转化到Mach1-T1菌株中，过夜培养，筛选阳性菌落，送通用生物系统(安徽)有限公司测序验证。

(2)烟草瞬时表达转化

取适量的本氏烟草种子加去离子水，置于4℃冰箱春化，春化处理三天之后播种。播种完覆盖保鲜膜，置于温室调整合适条件(湿度60％；温度25℃；光周期16h光/8h暗)，种子出芽之后，选取大小一致的苗子进行移栽，正常温室培养。通过冷激法将CsOG3-pCambia1305.1-GFP质粒转化到GV3101农杆菌，常规PCR方法鉴定阳性克隆。挑取含有目的基因的阳性菌落，在5ml含有Kan和Rif抗生素的LB液体培养基中，28℃，200r/min过夜培养；吸取培养的菌液1ml，加入到100mL含有Kan和Rif抗生素的LB液体培养基，28℃，200r/min振荡过夜培养至OD600约为0.8，5000g 15min离心收集菌体，用重悬液(10mM MgCL2；10mMMES)重悬菌体，最终OD600为0.4，加入100uM乙酰丁香酮(AS)，室温28度放置2～3h后注射烟草。注射后暗培养12h，正常培养3天后置于0℃的低温处理0h、6h和12h，用液氮进行固样，并迅速磨样，测定烟草中茶树孤儿基因CsOG3的表达水平、烟草的叶绿素荧光图、Fv/Fm值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性。

图2为烟草瞬时表达CsOG3及低温胁迫处理结果图。其中A：CsOG3对照组(CK)和瞬时表达烟草(CsOG3-pCambia1305.1-GFP)在低温胁迫下的表达水平；B：CK和CsOG3-pCambia1305.1-GFP在低温处理(0℃1h，常温恢复30min)后叶绿素荧光仪照射的结果；C：CK和CsOG3-pCambia1305.1-GFP低温处理后的Fv/Fm值；D：瞬时表达CsOG3烟草和CK在低温处理后烟草叶片中丙二醛的含量；E：瞬时表达CsOG3烟草和CK在低温处理后烟草叶片中总超氧化物歧化酶的活性；F：瞬时表达CsOG3烟草和CK在低温处理后烟草叶片中过氧化氢酶的活性。

如图2所示，在低温处理表达6h和12h后，看到相比对照组，瞬时表达CsOG3的烟草材料，在低温处理6h后超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性显著升高，丙二醛增量降低，并且具有更高的Fv/Fm值，其叶片受损程度明显减缓。

4、CsOG3基因在茶树中的功能验证

(1)体外反义寡聚核苷酸抑制实验

根据CsOG3测序获得的序列设计并合成反义寡聚核苷酸引物，反义寡聚核苷酸引物的设计在网站http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl上完成，并通过BioEdit软件与茶树(舒茶早)基因组数据库比对确定特异性，引物序列如所示：

P1，(5'-GCAGACCACGGGAAGACGAAGCCAT-3')；

P2，(5'-CCCGCACCAGTTATCTCTCTTGTTG-3')；

P3，(5'-CAAGTTTGTGACTGCCGTCATCGTC-3')；

用灭菌水溶解，配制并获得体外反义寡聚核苷酸抑制缓冲液，以灭菌水为空白对照；用剪刀剪下大小基本一致，色泽健康，无病虫害的一芽二叶，插入装有1ml 10μM引物溶液(或灭菌水)的1.5ml离心管，确保一芽二叶尾部没入溶液中，用透气性封口膜密封管口来进行防止溶液挥发而引起实验误差。将离心管放入光照培养箱中按光照16h/黑暗8h进行光照培养，培养箱温度设置为25℃。处理1d后对引物处理样和空白样分别取样进行基因表达分析。

(2)体外反义寡聚核苷酸抑制样品低温处理

对抑制茶树孤儿基因CsOG3成功的茶树一芽二叶进行0℃1h的低温处理，室温25℃黑暗恢复30min，恢复结束后使用叶绿素荧光仪测定光系统II(Fv/Fm)的净光合速率和最大光化学效率，使用南京建成生物工程研究所相关试剂盒，测定丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性，以未经过沉默处理的芽叶为对照，每个实验不低于3个生物学重复。

(3)体外反义寡聚核苷酸抑制茶树CsOG3的表达分析

对处理样品和对照样品分别提取总RNA，然后进行反转录，合成cDNA，用qRT-PCR检测相关基因表达。首先对对照和处理样品中CsOG3的基因表达水平进行了检测，结果显示体外反义寡聚核苷酸抑制能显著降低CsOG3的表达水平，下降幅度约为4倍。与对照组相比，沉默茶树孤儿基因CsOG3的茶树叶片颜色偏绿甚至发黄，表明叶片受损更加严重。对照组的Fv/Fm值显著高于CsOG3处理组(p<0.01)，表明对照组的最大光合作用速率大于处理组。抑制CsOG3表达的茶树叶片中丙二醛含量显著高于对照组(p<0.01)。抑制CsOG3表达的茶树芽叶中总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性均显著低于对照组(p<0.01)。

图3为沉默茶树孤儿基因CsOG3对茶树抗寒性的影响。其中A：处理1d后CsOG3在对照(SODN)和沉默(ASODN)茶树芽叶的表达水平；B：ASODN在低温处理(0℃1h，常温恢复30min)后叶绿素含量；SODN和ASODN在低温处理后的Fv/Fm值(C)，丙二醛含量(D)，总超氧化物歧化酶的活性(E)和过氧化氢酶的活性(F)。

如图3所示，通过体外反义寡聚核苷酸实验和低温处理1d后CsOG3基因的表达水平、茶树叶片受损程度和相关酶活的测定结果，可以看到相比对照组，抑制茶树孤儿基因CsOG3的表达显著增加了茶树叶片在低温条件下的受损程度和丙二醛的含量，降低了超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。

综上所述，茶树孤儿基因CsOG3及其编码的蛋白质能显著提高茶树对低温的耐受性。茶树孤儿基因CsOG3的克隆及其在茶树低温应答过程的作用，将有利于增加对孤儿基因参与茶树逆境响应的认识，为茶树抗性育种提供了重要靶标基因，具有很大的应用价值。

本发明中，首次克隆并验证了孤儿基因CsOG3参与茶树低温胁迫响应的分子机理，本发明还提供了含有CsOG3基因的重组质粒、转基因工程菌和转基因植株。本发明提升了对茶树孤儿基因及其功能的认识，丰富了茶树低温胁迫下的调控机制理论，为茶树抗性育种提供重要的靶标基因和理论参考基础。

上述是对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 茶树孤儿基因 CsOG3及其在提高茶树耐寒性上的应用

<130> NO

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> 茶树(Camellia sinensis L. O. Kuntze)

<400> 1

atggcttcgt cttcccgtgg tctgctcact ctctttccag accttaacga gtcaacaaga 60

gagataactg gtgcgggggc cagtgaacct caaccaagcg ccccggggtt tgctccgttg 120

aactttccta tgcggtctgt ggagcaaaaa atggcagtgc aaactgacat tgaagccaat 180

cagtatactt tgaagtcctg tgtggagacg atgacggcag tcacaaactt gtcgcaccgg 240

ctgcagagta ggacaaatga ggtgcaacag ttaaactccc agctggctct gctccaacgc 300

atgtataagg atgcgcgagt agagataagt gtgctaaaga cagaaaacaa ggagctgaag 360

cggaaggcca ccgtgatgtt ccgatttgga ggtccaccat atgctgtagt ggaggagcag 420

ggaggaggaa acttgcttgg tggtctagga agcacggagg caacaccggc aagggccgcc 480

caggacaggg gcaaaaagaa gagaccggcg gaatag 516

<210> 2

<211> 171

<212> PRT

<213> 茶树(Camellia sinensis L. O. Kuntze)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Ser Arg Gly Leu Leu Thr Leu Phe Pro Asp Leu Asn

1 5 10 15

Glu Ser Thr Arg Glu Ile Thr Gly Ala Gly Ala Ser Glu Pro Gln Pro

20 25 30

Ser Ala Pro Gly Phe Ala Pro Leu Asn Phe Pro Met Arg Ser Val Glu

35 40 45

Gln Lys Met Ala Val Gln Thr Asp Ile Glu Ala Asn Gln Tyr Thr Leu

50 55 60

Lys Ser Cys Val Glu Thr Met Thr Ala Val Thr Asn Leu Ser His Arg

65 70 75 80

Leu Gln Ser Arg Thr Asn Glu Val Gln Gln Leu Asn Ser Gln Leu Ala

85 90 95

Leu Leu Gln Arg Met Tyr Lys Asp Ala Arg Val Glu Ile Ser Val Leu

100 105 110

Lys Thr Glu Asn Lys Glu Leu Lys Arg Lys Ala Thr Val Met Phe Arg

115 120 125

Phe Gly Gly Pro Pro Tyr Ala Val Val Glu Glu Gln Gly Gly Gly Asn

130 135 140

Leu Leu Gly Gly Leu Gly Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ala Arg Ala Ala

145 150 155 160

Gln Asp Arg Gly Lys Lys Lys Arg Pro Ala Glu

165 170