发明内容

本发明的第一目的是提供一种牛乳中细菌总数的快速定量检测方法，尤其是要满足以下要求：1、必须能够区分细菌和杂质；2、能够定量测量细菌总数；3、必须能够区分死菌和活菌；4、快速得到检测结果。

本发明的第二目的是提供能达到上述目的的检测试剂盒。

本方法具有一个技术关键点：如何特异性区分所有细菌与牛乳中的体细胞和其它杂质。

众所周知，细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。因此，本发明特制备出针对革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖特征结构抗原类脂A抗体和针对革兰氏阳性细菌菌体表面特征结构抗原磷壁酸抗体，并将绿色荧光探针分别偶联在所述类脂A抗体和所述磷壁酸抗体上，制备成细菌特异性荧光探针。

同时，本发明还筛出膜阻隔性红色荧光核酸探针区分死菌与活菌。通过荧光标记牛乳中的细菌，然后采用流式分析技术对细菌进行多参数检测，从而实现了牛乳中活的细菌总数的快速、定量分析。

针对上述问题，本发明人进行了如下工作：

1、制备能识别所有革兰氏阴性细菌的抗体

采用了偶联有绿色荧光探针的革兰氏阴性细菌的抗体，对革兰氏阴性细菌进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对革兰氏阴性细菌的荧光进行分析。

2、制备能识别所有革兰氏阳性细菌的抗体

采用了偶联有绿色荧光探针的革兰氏阳性细菌的抗体，对革兰氏阳性细菌进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对革兰氏阳性细菌的荧光进行分析。

适用于流式分析仪的革兰氏阴性细菌抗体和革兰氏阳性细菌抗体筛选十分困难：第一，革兰氏阴性细菌种类繁多。适用的抗体需能够特异性识别所有革兰氏阴性细菌菌株。然而目前，尚未有人筛选得到这样的抗体。第二，革兰氏阳性细菌种类繁多。适用的抗体需能够特异性识别所有革兰氏阳性细菌菌株。然而目前，尚未有人筛选得到这样的抗体。第三，市面上常见的抗体主要用于ELISA，IHC-Fr，WB等实验。这些实验中，抗原抗体主要在固定相上进行反应，比如反应板。而流式分析技术中，抗原抗体的反应都在流动相中进行。因此流式分析技术需要亲和性好的抗体。

本发明前期经过大量的文献调研和实验，选定了革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖特征结构——类脂A作为革兰氏阴性细菌的特异性标志物；选定了革兰氏阳性细菌菌体表面特征结构——磷壁酸作为革兰氏阳性细菌的特异性标志物。

针对类脂A制备了多个批次的抗体，才最终筛选出亲和性高，特异性好，适用于流式分析仪的革兰氏阴性细菌抗体，命名为Ab-G(-)，现保存于中国计量科学研究院(实施例1)。针对磷壁酸制备了多个批次的抗体，才最终筛选出亲和性高，特异性好，适用于流式分析仪的革兰氏阳性细菌抗体，命名为Ab-G(+)，现保存于中国计量科学研究院(实施例2)。

所述抗体的筛选经过两个步骤：

一、对类脂A抗体和类脂A的亲和力进行分析，筛选亲和性高的革兰氏阴性细菌抗体(实施例1)。对磷壁酸抗体和磷壁酸的亲和力进行分析，筛选亲和性高的革兰氏阳性细菌抗体(实施例2)。

二、判断革兰氏阴性细菌抗体能否在流动相内与革兰氏阴性细菌反应(实施例3)。判断革兰氏阳性细菌抗体能否在流动相内与革兰氏阳性细菌反应(实施例4)。

本发明确定适用于本发明目的革兰氏阴性菌抗体的技术指标是：a)制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖中的类脂A；b)所述抗体可以在流动相内与革兰氏阴性细菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阴性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与类脂A的亲和力KD应小于2×10-10；e)所述抗体能够识别所有的革兰氏阴性细菌。

本发明确定适用于本发明目的革兰氏阳性菌抗体的技术指标是：a)制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阳性细菌菌体表面的磷壁酸；b)所述抗体可以在流动相内与革兰氏阳性细菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阳性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与磷壁酸的亲和力KD应小于2×10-10；e)所述抗体能够识别所有的革兰氏阳性细菌。

达到上述要求的革兰氏阴性菌抗体和革兰氏阳性菌抗体均可用于本发明方法。

3、筛选出适宜的膜阻隔性红色荧光核酸探针

采用膜阻隔性红色荧光核酸探针对死菌进行标记，并使用流式分析仪进行荧光分析，从而区分死菌和活菌。

经实验验证筛选，适于本发明目的的膜阻隔性红色荧光核酸探针，应具有两个特点：第一，其无法穿透细胞膜；第二，其能够标记细菌核酸，发红色荧光。活菌细胞膜完整，该探针无法进入细菌；死菌细胞膜破损，该探针可以进入细菌标记核酸。而且，该探针发红色荧光，其发射光谱和绿色免疫荧光抗体的发射光谱没有重叠。因此，膜阻隔性红色荧光核酸探针结合流式分析技术可以区分死菌和活菌。

据此，本发明首次建立了一种采用流式分析技术快速灵敏定量检测牛乳中细菌总数的方法，其特征是：1)识别样品中的革兰氏阴性细菌：使用绿色荧光探针通过化学基团交联的革兰氏阴性菌的抗体，标记样品中的革兰氏阴性细菌；2)识别样品中的革兰氏阳性细菌：使用绿色荧光探针通过化学基团交联的革兰氏阳性菌的抗体，标记样品中的革兰氏阳性细菌；3)区分样品中的死菌和活菌：使用可以膜阻隔性红色荧光核酸探针对死菌总数进行标记；4)通过流式分析仪同时计数1)、2)和3)产生的红色和绿色荧光信号，实现细菌总数的快速定量检测。

所述革兰氏阴性菌抗体的技术指标是：a)制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖中的类脂A；b)所述抗体可以在流动相内与革兰氏阴性细菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阴性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与类脂A的亲和力KD应小于2×10-10；e)所述抗体能够识别所有的革兰氏阴性细菌。

所述革兰氏阳性菌抗体的技术指标是：a)制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阳性细菌菌体表面的磷壁酸；b)所述抗体可以在流动相内与革兰氏阳性细菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阳性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与磷壁酸的亲和力KD应小于2×10-10；e)所述抗体能够识别所有的革兰氏阳性细菌。

所述方法的细菌总数的判定方法如下：对于一个颗粒产生的事件，如果仅检测到绿色荧光，则判定为活菌；如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定死菌；如果未检测到荧光，则判定为杂质颗粒。

所述通过流式分析仪计数，是通过流式分析仪的散射光通道进行圈门，并通过双荧光通道检测所述红色和绿色荧光信号，从而检测细菌总数；其中，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。所述圈门，其方法为：使用流式分析仪测量500nm标准微球和2500nm标准微球，在前向角散射光通道的直方图上，根据微球的信号位置进行圈门，下限在500nm，上限在2500nm。

所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。

所述流式分析仪的技术指标和检测参数是：荧光灵敏度<10MESF，散射光灵敏度<50nm，荧光分辨率RSD<3％，散射光分辨率<3％；分析速度为1～30μL/min，检测时间为15～300s。

所述的检测方法，待检样品进行检测之前需要进行纯化处理；所述纯化，方法是将牛乳中加入蛋白酶和表面活性剂，去除滤液中的蛋白质和脂肪，得到纯化的样品菌悬液。

本发明用大量实验清楚公开了本发明的方法，详见实施例。其中：

实施例1为革兰氏阴性菌抗体和类脂A的亲和力分析。

实施例2为革兰氏阴性菌抗体和类脂A的亲和力分析。

实施例3为革兰氏阴性菌的检测。

实施例4为革兰氏阳性菌的检测。

实施例5为死菌和活菌的定量检测。

实施例6为人工污染的牛乳样本中细菌总数的检测。

实施例7为牛乳中细菌总数快速检测试剂盒成分。

以下是本发明一次实际检测的具体操作：

1、牛乳样品中细菌的纯化：将1mL的牛乳样品加入蛋白酶(1～3mg)和非离子表面活性剂(500μL，1％)，37℃消化30min。以8000×g～12000×g的速度离心5～10min，弃掉上层脂肪和中层液体，底部菌泥用1mL PBS重悬沉淀，重复2～5次进行洗涤。

2、纯化的菌液加入绿色荧光探针交联的革兰氏阴性细菌抗体(Gr-Ab-G(-)，终浓度为1μg/mL)和革兰氏阳性细菌抗体(Gr-Ab-G(+)，终浓度为1μg/mL)，以及膜阻隔性红色荧光核酸探针(Rd)(终浓度为1μg/mL)，混匀后避光孵育10～20min。

3、流式分析仪检测：分析速度为1～30μL/min，检测时间为15～300s，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。通过对圈门内的事件在双荧光通道进行分析，计算牛乳中活的细菌总数。

本发明人验证了本检测方法的效果：

选择九个不同属的革兰氏阴性细菌标准菌株和九个不同属的革兰氏阳性细菌标准菌株，对方法检测G+菌和G-菌的能力进行评价。结果显示G+菌抗体可以特异性识别所有革兰氏阳性菌，G-菌抗体可以特异性识别所有革兰氏阴性菌。

制备了11个常见食源性致病菌的死活菌菌悬液，使用本发明的方法进行测量，结果显示所有菌株测得的死活比例均接近5:5，由此推测本方法可以用于检测所有细菌的死活菌数量。

采用本方法和平板计数法同时对10倍系列稀释的三个代表性菌株菌液进行检测，并对二者结果进行比较。结果发现：本方法与平板计数方法所得结果有良好的线性关系，说明本方法具有良好的准确性。

根据上述本发明建立的检测方法，本发明还提供了一种牛乳中细菌总数快速定量检测试剂盒，除一般试剂盒常用的试剂及用具外，还有以下成分：1、绿色荧光探针交联的革兰氏阴性菌的抗体，可以识别样品中的革兰氏阴性细菌；2、绿色荧光探针交联的革兰氏阳性菌的抗体，可以识别样品中的革兰氏阳性细菌；3、膜阻隔性红色荧光核酸探针；4、校准微球(500nm和2500nm)。

所述革兰氏阴性菌抗体的技术指标是：a)制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖中的类脂A；b)所述抗体可以在流动相内与革兰氏阴性细菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阴性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与类脂A的亲和力KD应小于2×10-10；e)所述抗体能够识别所有的革兰氏阴性细菌。

所述革兰氏阳性菌抗体的技术指标是：a)制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阳性细菌菌体表面的磷壁酸；b)所述抗体可以在流动相内与革兰氏阳性细菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阳性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与磷壁酸的亲和力KD应小于2×10-10；e)所述抗体能够识别所有的革兰氏阳性细菌。

所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。

在本发明的一个实例中，所述试剂盒包括以下成分：

1、绿色荧光探针交联的革兰氏阴性菌的抗体，可以识别样品中的革兰氏阴性细菌；其中，绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。

2、绿色荧光探针交联的革兰氏阳性菌的抗体，可以识别样品中的革兰氏阳性细菌；其中，绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。

3、膜阻隔性红色荧光核酸探针，荧光发射光谱在601nm～640nm；

4、校准微球(500nm和2500nm)。

用本发明的试剂盒进行牛乳中细菌总数检测的操作方法，其特征为：

1、牛乳样品中细菌的纯化：将1mL的牛乳样品加入蛋白酶(1～3mg)和非离子表面活性剂(500μL，1％)，37℃消化30min。以8000×g～12000×g的速度离心5～10min，弃掉上层脂肪和中层液体，底部菌泥用1mL PBS重悬沉淀，重复2～5次进行洗涤。

2、纯化的菌液加入绿色荧光探针交联的革兰氏阴性细菌抗体(Gr-Ab-G(-)，终浓度为1μg/mL)和革兰氏阳性细菌抗体(Gr-Ab-G(+)，终浓度为1μg/mL)，以及膜阻隔性红色荧光核酸探针(Rd)(终浓度为1μg/mL)，混匀后避光孵育10～20min。

3、流式分析仪检测：分析速度为1～30μL/min，检测时间为15～300s，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。通过对圈门内的事件在双荧光通道进行分析，计算牛乳中活的细菌总数。

本发明具有以下创新和优点：

1、能够特异性识别所有种类的细菌

本发明选定了革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖特征结构——类脂A作为革兰氏阴性细菌的特异性标志物；选定了革兰氏阳性细菌菌体表面特征结构——磷壁酸作为革兰氏阳性细菌的特异性标志物。据此制备的革兰氏阴性细菌抗体和革兰氏阴性细菌抗体能够识别所有种类的细菌。

2、能够精确识别活菌

对所有细菌进行荧光标记，可以区分牛乳中细菌与体细胞和杂质颗粒，并检测活的细菌总数。

3、操作简单便捷，消耗时间短，可在0.5h内完成检测。

4、试剂盒中附带有流式分析仪校准微球，可以最大程度上保证检测结果的精确性和准确性。