一种利用gc-ms/ms高效检测并鉴别植物挥发物的方法
阅读说明：本技术 一种利用gc-ms/ms高效检测并鉴别植物挥发物的方法 (Method for efficiently detecting and identifying plant volatile matters by using GC-MS/MS (gas chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry) ) 是由 罗杰 袁弘伦 曹光平 刘贤青 候晓东 黄梦兰 杜鹏萌 于 2021-01-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用GC-MS/MS高效检测并鉴别植物挥发物的方法,其步骤是：首先利用全扫描模式对多物种植物挥发物进行检测,所得的数据解卷积后,对物质进行定性；其次是选取各物质的前体离子,利用产物离子模式检测各前体离子的产物离子,并优化碰撞电压；第三是将所得离子对整合至单个MRM(多反应监测模式)方法中；最后是建立适用于挥发物检测的校正模型。使用本方法,可以有效提高挥发物检测时的灵敏度、检测通量、可定性物质数量、定量准确性及方法重现性。本方法应用性强,显著提高了挥发物检测效果,对植物挥发物的研究有重大意义。(The invention discloses a method for efficiently detecting and identifying plant volatile matters by using GC-MS/MS, which comprises the following steps: firstly, detecting multi-species plant volatile matters by using a full scanning mode, and performing qualitative determination on substances after deconvolution of obtained data; secondly, selecting precursor ions of all substances, detecting the product ions of all the precursor ions by using a product ion mode, and optimizing collision voltage; third, the resulting ion pairs are integrated into a single MRM (multiple reaction monitoring mode) process; finally, a correction model suitable for volatile detection is established. By using the method, the sensitivity, the detection flux, the quantity of the qualitative substances, the quantitative accuracy and the method reproducibility in the volatile matter detection can be effectively improved. The method has strong applicability, remarkably improves the detection effect of the volatile matters, and has great significance for the research of plant volatile matters.)
技术领域
本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种利用GC-MS/MS高效检测和鉴别植物挥发物的方法，可显著提升植物挥发物的检测效果。
背景技术
植物挥发物是一类具有高饱和蒸气压的亲脂性液体。目前已鉴定出超过1700种植物挥发物(Natalia Dudareva et al.,Biosynthesis,function and metabolicengineering ofplant volatile organic compounds。New Phytologist，2013)。植物挥发物对植物本身及人类都具有重要作用：在植物中，挥发物起与环境互作的作用(AinoKalske et al.,Insect herbivory selects for volatile-mediated plant-plantcommunication。Current Biology,2019)；对人类而言，植物挥发物提供了食品香味，也可作为香料、调味品、药品等(Eran Pichersky et al.,Biosynthesis ofplant volatiles:nature’s diversity and ingenuity。Science，2006)。因此，植物挥发物具有重要的研究意义。
现阶段研究植物挥发物的方法主要是基于固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)的非靶向代谢组学方法(Barbara Bojko et al.,Solid-phasemicroextraction in metabolomics。Trends inAnalytical Chemistry，2014)。但非靶方法存在灵敏度低、数据卷积、定量不准等问题(Tomas Cajka et al.,Toward merginguntargeted and targeted methods in mass spectrometry-based metabolomics andlipidomics。Analytical Chemistry，2014)。基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)的广泛靶向代谢组学方法可有效提升方法灵敏度、避免数据卷积、提升定量能力(Chen wei et al.,Anovel integrated method for large-scale detection,identification,andquantification of widely targeted metabolites:application in the study ofrice metabolomics。Molecular Plant，2013)。因此，可将广靶思路应用于GC-MS中，提升挥发物检测效率。
然而，广靶方法中的检测通量及可定性物质数量仍受限于非靶方法，直接迁移广靶方法思路无法有效提升挥发物组的检测和定性通量；此外，基于SPME-GC-MS的挥发组方法存在结果重现性较差的问题。针对上述问题，本发明根据挥发物合成通路有限，及挥发物合成酶有趋同进化趋势的研究背景(Eran Pichersky et al.,Biosynthesis ofplantvolatiles:nature’s diversity and ingenuity。Science，2006)，通过整合多物种挥发物数据库，提升方法检测通量及可定性物质数量，并利用回归模型，建立适用于SPME-GC-MS数据的校正方法，显著提高了方法的稳定性。本发明建立了一种可高效检测植物挥发物的广泛靶向代谢组方法，对植物挥发物研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用GC-MS/MS高效检测并鉴别植物挥发物的方法，其最大的特点是与现阶段应用的非靶方法相比，显著提升了方法的灵敏度、检测通量、可定性物质数量、定量准确性及方法重现性。利用本方法，可促进植物挥发物的研究。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种利用GC-MS/MS高效检测并鉴别植物挥发物的方法，其步骤是：
1、样品制备：
(1)颗粒状样品：取适量样品(大于2g)脱壳后常温保存；粉末状样品：取适量新鲜样品(大于2g)在研钵中加液氮研磨成粉末状后，-80℃保存；液体样品：取适量新鲜样品(大于4g)，榨汁机榨取果汁，果汁于4℃保存，12小时内检测；
(2)溶液配制：内标液为V水：VTMP＝6×106：1；粉末状样品提取液为V水：VEDTA：VTMP＝1000:1：0.001，V代表体积，TMP为2,4,6-三甲基吡啶，EDTA为乙二胺四乙酸，水为去离子水，TMP与EDTA为分析级试剂(国药集团化学试剂有限公司)；
(3)称取适量样品(大于1g)，置于顶空进样瓶，颗粒状样品按W样品：W内标液＝3:1的比例加入水；粉末状样品按W样品：W二水氯化钙：W提取液＝2:1:2的比例，依次加入二水氯化钙和提取液；液体样品按W样品：W内标液：W氯化钠＝1:0.1:0.1的比例，依次加入内标液和氯化钠，待测；V代表体积，W代表质量，二水氯化钙及氯化钠为分析级试剂(国药集团化学试剂有限公司)；
2、仪器条件：
(1)、进样器条件：安捷伦PAL RSI 120自动进样系统；固相微萃取探头：色谱科DVB/CAR/PDMS固相微萃取探头，DVB为二乙烯苯，CAR为碳分子筛，PDMS为聚二甲基硅氧烷；根据样品性质的不同，分别将振摇器温度设置为40～80℃，将振摇时间设置为10～30分钟，将吸附时间设置为20分钟，解吸附时间：2分钟，老化温度：270℃，老化时间：5分钟；
(2)色谱条件：安捷伦7890B色谱仪；色谱柱：安捷伦HP-5MS色谱柱，30m×250μm×0.25μm；升温程序：初始温度40℃，保持3分钟；以2℃/分钟的速度升温至160℃；随后以50℃/分钟的速度升温至300℃，保持3分钟；载气为氦气，流速为1mL/分钟；
(3)质谱条件：安捷伦7000D三重四级杆串联质谱仪，传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；电离模式：EI；
(4)全扫描模式参数：扫描范围：40-500m/Z；
(5)产物离子模式参数：碰撞电压梯度：5～20eV；
(6)MRM模式参数：碰撞电压梯度：5～20eV，不同物质根据产物离子模式检测结果选择对应的碰撞电压；
3、利用全扫描模式检测不同作物挥发物，所得数据利用MSDIAL软件进行解卷积，比对NIST17数据库进行定性；
4、将所检测物质进行整合，手动去掉重复物质，在不同电压下，利用产物离子模式检测去重后各物质前体离子的产物离子，根据结果选择合适的碰撞电压；
5、利用所得物质离子对建立标签代谢数据库；
6、取同一物种均一样品重复进样，进样包含多批次。取每个物质多个重复的均值作为该物质的响应度，取均值后的数据集作为训练集，使用算法分别建立每个批次各物质含量与进样次数之间的回归模型，并计算模型之间的比例关系，利用模型分别校正该物质批次内与批次间的误差。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)高通量。通过整合多物种挥发物库，结合MRM技术，检测植物挥发物时可显著提高检测通量。如图1所示，检测水稻种子挥发物的通量由非靶方法的69种提升至174种，检测百香果挥发物的通量由非靶方法的115种提升至196种。
(2)高灵敏度。利用MRM技术通过两级离子选择，排除了大量干扰离子，使质谱的背景干扰大大降低，待测物的信噪比显著提高。如图2所示，检测水稻种子时，愈创木酚的灵敏度提高了4.59倍。
(3)良好重现性。利用回归模型对数据进行校正，使得方法具有良好的重现性。如图3所示，校正69次进样的水稻种子挥发物数据后，己醛的变异系数由0.51下降至0.08。
(4)可定性物质数量较高。多物种挥发物库涵盖了挥发物合成通路中的主要产物，因此检测结果中可定性物质数量较高。如图4所示，水稻中原为无信号或为未知物的信号，经挥发物库鉴定后分别注释为2-乙酰基-1-吡咯啉、2-戊基呋喃、吲哚等。
(5)定量准确、数据易整合。利用MRM技术，避免了数据中的卷积问题，提高了方法的定量准确性；此外，方法无需复杂的峰对齐步骤，使得不同批次数据易整合。
附图说明
图1A为一种利用非靶向方法检测并鉴别水稻种子挥发物的结果图。
其峰强度在2.5×106-8.7×107cps之间，展示出挥发物69种。
图1B为一种利用本发明高通量检测并鉴别水稻种子挥发物的结果图。
其峰强度在1.5×104-8.8×105cps之间，展示出挥发物174种。
图1C为一种利用非靶向方法检测并鉴别百香果挥发物的结果图。
其峰强度在6.3×106-8.9×108cps之间，展示出挥发物115种。
图1D为一种利用本发明高通量检测并鉴别百香果挥发物的结果图。
其峰强度在2.1×104-2.6×107cps之间，展示出挥发物196种。
图2为非靶向方法与本发明方法检测水稻种子中愈创木酚的结果比较。
其灵敏度提高了4.59倍。
图3为一种利用本发明校正水稻种子数据中69次进样己醛的丰度。
其变异系数由0.51下降至0.08。
图4为非靶向方法与本发明方法检测水稻种子部分定性结果比较
本发明方法定性了非靶向方法中无信号的物质及未知物。
具体实施方式
实施例1：
一种利用GC-MS/MS高效检测并鉴别植物挥发物的方法，其步骤是：
1、样品制备：
(1)取样。颗粒状样品：分别取2.0g日本晴水稻种子、2.0g邯麦19小麦种子脱壳后常温保存，取2.0g郑单958玉米脱粒后常温保存；粉末状样品：取2.0g榴莲果肉、热引1号胡椒果实在研钵中加液氮研磨成粉末状后，液氮保存，榴莲采购于当地超市；液体样品：榨汁机榨取4mL番茄、柑橘、苹果、梨、百香果的果汁，果汁于4℃保存，12小时内检测，番茄、柑橘、苹果、梨、百香果采购于当地超市；
(2)溶液配制：内标液为V水：VTMP＝6×106：1；粉末状样品提取液为V水：VEDTA：VTMP＝1000:1：0.001，V代表体积，TMP为2,4,6-三甲基吡啶，EDTA为乙二胺四乙酸，水为去离子水，TMP与EDTA为分析级试剂(国药集团化学试剂有限公司)；
(3)颗粒状及粉末状样品：称取1.0g样品，置于顶空进样瓶，颗粒状样品加入0.3mL内标液；粉末状样品加入0.5g二水氯化钙和1mL提取液；液体样品：取4mL果汁，加入0.4g氯化钠和0.4mL内标液，待测；
2、仪器条件：
(1)、进样器条件：安捷伦PAL RSI 120自动进样系统；固相微萃取探头：色谱科DVB/CAR/PDMS固相微萃取探头，DVB为二乙烯苯，CAR为碳分子筛，PDMS为聚二甲基硅氧烷；根据样品性质的不同，分别将振摇器温度设置为40～80℃，将振摇时间设置为10～30分钟，将吸附时间设置为20分钟，解吸附时间：2分钟，老化温度：270℃，老化时间：5分钟；
(2)色谱条件：安捷伦7890B色谱仪；色谱柱：安捷伦HP-5MS色谱柱，30m×250μm×0.25μm；升温程序：初始温度40℃，保持3分钟；以2℃/分钟的速度升温至160℃；随后以50℃/分钟的速度升温至300℃，保持3分钟；载气为氦气，流速为1mL/分钟；
(3)质谱条件：安捷伦7000D三重四级杆串联质谱仪，传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；电离模式：EI；
(4)全扫描模式参数：扫描范围：40-500m/Z；
(5)产物离子模式参数：碰撞电压梯度：5～20eV；
(6)MRM模式参数：碰撞电压梯度：5～20eV，不同物质根据产物离子模式检测结果选择对应的碰撞电压；
3、利用全扫描模式检测不同植物挥发物，所得数据利用MSDIAL软件进行解卷积，比对NIST17数据库进行定性。(请见表一)
表一全扫描模式部分结果
物质名
保留时间(min)
cis-3-Hexenal
5.6
1-Hexanol
8.58
Styrene
9.38
2-Acetyl-1-pyrroline
11.33
Camphene
12.46
4、将所检测物质进行整合，手动去掉重复物质，在不同电压下，利用产物离子模式检测去重后物质的产物离子，根据结果选择合适的碰撞电压(请见表二)；
表二产物离子模式部分结果
5、基于优化后的离子对和碰撞电压，建立标签代谢数据库(请见表三)；
表三挥发物标签数据库部分结果
6、取同一品种水稻种子，分3批次，每批次23个样品，共进样69次。取每个物质3个重复的均值作为该物质的响应度，取均值后的数据集作为训练集，使用算法对训练集建立回归模型，优化模型中的惩罚因子参数C和核函数参数g，利用回归模型校正批次内的误差；随后，确定每个批次之间的比例关系m，再根据比例关系对其他批次该物质的丰度进行标准化，校正批次间的误差(请见表四)。
表四部分物质校正模型参数