具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：

细胞培养及hERG转运障碍模型的构建：采用瞬时转染，将pcDNA3-Mock、pcDNA3-HERG、pcDNA3-HERG/pcDNA3-HERG-A561V、pcDNA3-HERG-A561V质粒转染产生对照、野生、杂合和突变的hERG的HEK293细胞系。将上述细胞在含有10％胎牛血清的DMEM(高葡萄糖)中培养，并维持在含5％二氧化碳的37℃培养箱环境中。从培养皿中收集细胞，重新悬浮成单细胞后培养在新鲜MEM的小皿中至少4小时以备使用。

定量RT-PCR：药物处理前后的细胞使用TransZol Up(全式金)裂解并提取总RNA，反转录成cDNA后使用1μg作为模板，按照2×T5 Fast qPCR Mix(擎科生物)方案配置成20μl的反应体系检测目的基因表达，以SYBR Green I作为表达信号，检测过程中GAPDH为看家基因，相关引物如表1所示。

RNA提取条件：

1.收集1×10⁶细胞，加入1mlTransZol Up试剂裂解细胞；

2.加入200ul氯仿溶液，剧烈震荡，静置10min；

3.离心12000rpm 20min，取上层水相层转移至新离心管中,加入500ul异丙醇，颠倒混匀，静置10min；

4.离心12000rpm 10min，弃上层，加入1.5ml 75％乙醇，吹悬沉淀；

5.离心12000rpm 5min，弃上清，干燥10min；

6.加入50ul DEPC水，冰上溶解10min，使用Nanodrop仪器测定RNA浓度，并把所有样本RNA浓度稀释成500ng/ul。

逆转录反应条件：

体系制备：RNA 2ul,Oligo(dt)Primer(0.5ug/ul)1ul,2XES reaction mix 10ul，easyScript RT/RI enzyme MIX 1ul,gDNA remover 1ul,RNase free water 5ul。

反应条件：在PCR仪(品牌：eppendorf；型号：mastercycle)中，设置程序：42℃15min；85℃5s；取出样本，加入180ul DEPC水混匀，存放-20℃冰箱待用。

表1：荧光定量PCR反应条件及体系配置：

反应条件：95℃，2min；95℃，10s；60℃，15s(采集信号)(35个循环)；熔解曲线：60℃-95℃2℃/s采集信号。

表2：HSF1、Hsp70、Hsp90、GAPDH引物

药物和试剂准备：鲁玛卡托(品牌：Selleck货号：S1565)及HSF1A(品牌：Selleck货号：S0294)以10mmol的浓度储存于二甲基亚砜中，使用二甲基亚砜稀释为终浓度分别为12.5μmol和10μmol，等量的二甲基亚砜加入到未加药组中以作对照。分成五组分别为：

野生型：hERG-WT；杂合组：hERG-WT+hERG-A561V；杂合加鲁马卡托处理组：hERG-WT+hERG-A561V+LUM；杂合加HSF1A处理组：hERG-WT+hERG-A561V+HSF1A；杂合加鲁玛卡托和HSF1A处理组：hERG-WT+hERG-A561V+LUM+HSF1A。

蛋白免疫印迹：药物孵育24小时后，用RIPA裂解液提取不同组别的蛋白。将等量蛋白质(20μg)在7.5％的SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶上分离不同的目的蛋白。经转膜，封闭后选用特异性目的蛋白的一抗孵育条带过夜。其中hERG抗体(品牌：Alomone/Alomone Labs，货号：APC-062)、Hsp70抗体(品牌：Abcam，货号：ab2787)、Hsp90抗体(品牌：Abcam，货号：ab282108)、β-tubulin抗体(品牌：transgene，货号:HC101-01)稀释依次为1:400、1:1000、1：10000、1:3000)。使用相应的二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRPConjugate和Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate(品牌：transgene货号：HS101-01和HS201-01)(1:3000)孵育1小时后使用ImageQuant LAS 500可视化条带，β-tubulin作为归一化内参蛋白。

膜片钳电生理分析：在处理不同细胞模型24小时后被重新消化并分离成单细胞铺种在35mm培养皿中，5小时后进行电生理分析。全细胞膜片钳系统用于引出hERG通道的Ikr电流，具体为：在-80mV的静息状态下去极化到-60mV，然后以每10mV的阶跃电流继续去极化至+60mV，持续3s，随后以3s的复极化到-40mV引出hERG尾电流。

其中电极外液为：4mM KCl、137mM NaCl、1.8mM CaCl₂、10mM葡萄糖、1mM MgSO₄、10mM HEPES，用NaOH调节pH至7.4；

电极内液为：30mM KCl、5mM EGTA、5mM Mg-ATP、1mM MgCl₂、10mM HEPES，用KOH调pH至7.2。

PCR及免疫印迹至少进行3次生物学重复实验，电生理分析每个分组至少标测6个不同的细胞电流。数据使用均值M±标准差SD表示。分子生物学实验使用双侧配对t检验，电生理实验使用Wilcoxon Mann–Whitney U检验来检测组别的统计学差异，P<0.05代表差异显著。

表3：各个细胞系半激活电压及斜率因子测试结果

图1为热休克蛋白Hsp70、Hsp90以及HSF1的表达结果图。从图中可知鲁玛卡托在hERG转运障碍的HEK-293细胞中显著上调了热休克因子Hsp70和Hsp90，而下调了它们的上游因子HSF1，提示鲁玛卡托对于hERG突变蛋白转运的促进作用可能通过其关键的转运分子伴侣Hsp70和Hsp90来实现，而它们的上调反馈抑制了HSF1表达。

图2为hERG、Hsp70、Hsp90、β-tubulin的SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶结果图。从图中可知，鲁玛卡托和HSF1激活剂HSF1A单独或联合作用均可不同程度促进hERG成熟蛋白(155KDa)的表达，二者联合作用使这种促进作用更加明显(图2-A)；这种促进蛋白转运的作用不仅在hERG突变蛋白的模型中起作用，野生型hERG的细胞中这种作用依旧存在；并且相应地，Hsp70和Hsp90的蛋白表达水平在鲁玛卡托及HSF1A作用后上调(图2-B)。

图3为鲁玛卡托(LUM)和/或HSF1A增强了hERG通道电流坐标图。图3-A显示了在不同细胞模型中(野生型：hERG-WT；杂合组：hERG-WT+hERG-A561V；杂合加鲁玛卡托处理组：hERG-WT+hERG-A561V+LUM；杂合加HSF1A处理组：hERG-WT+hERG-A561V+HSF1A；杂合加鲁玛卡托和HSF1A处理组：hERG-WT+hERG-A561V+LUM+HSF1A)的电流记录示踪，纵坐标代表电流I(pA)，横坐标代表时间T(ms)；图3-B显示了引出hERG通道电流使用的刺激脉冲方案；图3-C表明鲁玛卡托(LUM)和HSF1A增加了通道的激活电流，联合处理后电流(pA/pF)增加更加明显；图3-D和图3-E分别表明两种药物单独或联合作用时通道的尾电流明显增加，联合作用时效应更加突出，并且标化后的峰值尾电流(I/I_max)使用Boltzmann方程拟合后显示了药物处理后通道的激活门控动力学呈现野生型，尤其在两种药物联合时。

综上所述，鲁玛卡托和HSF1A单独或联合作用虽然均可不同程度地增加hERG激活电流及尾电流，尤其是二者联合作用电流幅度增加更加显著，细胞表型纠正更加明显。标化后的峰值尾电流使用Boltzmann拟合方程获得各组对应的半激活电压(V_1/2)以及激活曲线斜率k值，表明在鲁玛卡托和HSF1A单独作用时(尤其是HSF1A)能够使hERG通道激活曲线参数更加接近野生型通道，这种作用在二者联合作用时更加明显，表明鲁玛卡托联合HSF1A不仅增加了hERG突变通道的电流，还纠正了其突变后的负性激活门控变化。

本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。