具体实施方式

Ⅰ.定义

肺泡上皮：肺泡表面有一层完整的上皮。上皮细胞包括Ⅰ型肺泡细胞和Ⅱ型肺泡细胞。

(1)Ⅰ型肺泡细胞(typeⅠalveolar cell)：Ⅰ型肺泡细胞扁平，覆盖肺泡的大部分表面，细胞含核部分较厚并向肺泡腔内突出，无核部分胞质菲薄，厚约0.2μm，是进行气体交换的部位。电镜下，Ⅰ型肺泡细胞细胞器少，胞质内有较多的吞饮小泡，小泡内含有表面活性物质和微小的尘粒，细胞可将这些物质转运到肺泡外的间质内，以便清除。Ⅰ型肺泡细胞无分裂增殖能力。

(2)Ⅱ型肺泡细胞(typeⅡalveolar cell)：Ⅱ型肺泡细胞位于Ⅰ型肺泡细胞之间，数量较Ⅰ型肺泡细胞多，但覆盖面积比Ⅰ型肺泡细胞小。细胞立方形或圆形，顶端突入肺泡腔。细胞核圆形，胞质着色浅、呈泡沫状。电镜下，细胞游离而有少量微绒毛，胞质内富含线粒体和溶酶体，有较发达的粗面内质网和高尔基复合体。核上方有较多的分泌颗粒，电子密度高、大小不等，直径约0.1～1.0μm颗粒内含有平行排列的板层状结构，称为嗜饿性板层小体(osmilphilic multilamellar body)。小体内的主要成分为磷脂，以二棕榈酰卵磷脂为主，此外还有糖胺多糖及蛋白质等。颗粒内物质释放出来后，在肺泡表面形成一层粘液层，称为表面活性物质(surfactant)。表面活性物质有降低肺泡表面张力、稳定肺泡大小的作用。呼气时肺泡缩小，表面活性物质密度增加，表面张力降低，防止肺泡过度塌陷；吸气时肺泡扩张，表面活性物质密度减小，肺泡回缩力加大，可防止肺泡过度膨胀。表面活性物质的缺乏或变性均可引起肺不张，过度通气可造成表面活性物质缺乏；吸入毒气可直接破坏表面活性物质。新生儿透明膜病是因为Ⅱ型肺泡细胞发育不良，表面活性物质合成和分泌障碍，致使肺泡表面张力增大，婴儿出生后肺泡不能扩张，出现新生儿呼吸窘迫症。Ⅱ型肺泡细胞有分裂、增殖并分化为Ⅰ型肺泡细胞的潜能，故具有修复受损伤上皮的作用。

药物:

所述“药物”被设计用于在动物和人中的用途并可以经所有给药途径施用。优选的给药途径是注射途径、口服途径、肺途径、鼻途径、直肠途径、肠胃外途径。此种药物组合物及其单位剂型可以常规或特别的比例包含常规的或新的成分，具有或不具有另外的活性化合物或成分，并且此种单位剂型可包含与目的日剂量范围相称的待采用的任何适宜有效量的活性成分。应用于本公开的药物组合物的术语“载体”涉及与活性化合物一起施用的稀释剂、辅料或赋形剂。本公开的如式(I)所示的化合物，与一种或多种辅料如佐剂、载体或稀释剂一起，可以置入药物组合物、单位剂量(unit dosages)或剂型(dosage forms)的形式中。所述药物可以固体剂型(如粉剂、颗粒剂、丸粒剂、包衣或未包衣的片剂或经填充的胶囊)或液体的剂型(如溶液、混悬液、乳液或填充其的胶囊)或半固体剂型(如凝胶、霜剂和软膏)采用。药物剂型的一种或多种活性成分的溶解和释放特性可以在数秒至数月的范围内变化。

治疗方法和药物配制剂

无论通过口服、注射、直肠或肠胃外(包括静脉内的和皮下)或在某些情况下甚至局部途径，可以将本公开的化合物式(I)或与一种或多种药物-可接受的辅料、载体或稀释剂，特别是和优选地以它们的药物组合物的形式，以有效量施用给需要其的对象，例如活动物(包括人)体，用于治疗、减轻或改善、缓解或消除对其敏感的适应症或病症或者阐述于本申请其它处的适应症或病症。

本文中使用的术语“保护”、“治疗”意味减轻或缓解对象中的疾病的至少一种症状，在本公开的含义范围内，术语“保护”、“治疗”还指抑制、延迟发作(即，疾病临床表现的前期)和/或减小发展或恶化疾病的风险。

本文中使用的术语“恢复”意味在某些内源或外源性刺激物质，如缺血缺氧，再灌注损伤的作用下，脉络丛的功能和/或结构会发生改变，出现结构和/或功能异常，“恢复”指将该异常状态回复到正常状态。“保护”意味着减少或避免所述内源或外源性刺激物质对脉络丛结构和/或功能的进一步改变或损伤。

本公开的药物可以经口地、局部地(侧脑室)、肠胃外地或粘膜地(例如，含服地、通过吸入或直肠地)以包含常规的非-毒性药学可接受的载体的剂量单位配制剂施用。通常希望使用注射途径。所述活性试剂可以经口地以胶囊、片剂等形式(参见Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，20th Edition)施用。

对于以片剂或胶囊形式的口服给药，活性药物组分可以与非-毒性的、药学可接受的辅料如粘结剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和其它还原性和非-还原性糖类、微晶纤维素、硫酸钙或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或硅土、硬脂酸、硬脂基富马酸酯钠、甘油二十二烷酸酯、硬脂酸钙等)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)、着色剂和调味剂、明胶、甜味剂、天然和合成的胶(如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻朊酸盐)、缓冲盐、羧甲纤维素、聚乙二醇、蜡、等。对于以液体形式的口服给药，所述药物组分可以与非-毒性、药学可接受的惰性载体(例如，乙醇、甘油、水)、防沉降剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)、非-水性载体(例如，扁桃油、油酯类、乙醇或经分馏的植物油)、保藏剂(例如，p-羟基苯甲酸甲酯或p-羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)等组合。还可以加入稳定剂如抗氧化剂(BHA、BHT、桔酸丙酯、抗坏血酸钠、柠檬酸)以稳定所述剂型。

包含作为活性化合物的片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。包含作为活性化合物的本发明化合物式(I)还可以引入小珠、微球或微胶囊，例如由聚乙醇酸/乳酸(PGLA)构建的。用于口服给药的液体的制剂可以采取例如溶液，糖浆剂，乳液或混悬液的形式或者它们可以呈现为在使用前用水或其它适宜的辅料重构的干产品。用于口服给药的制剂可以适宜地配制以使活性化合物受控或延迟地释放。

本公开的药物可以经肠胃外递送，即，通过静脉内(i.v.)、脑室内(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.d.)或皮内(i.d.)施用，通过直接注射，经例如快速浓注或连续输液。用于注射的配制剂可以单位剂型呈现，例如在具有添加的保藏剂的安瓿瓶或多-剂量容器中。所述组合物可以采用赋形剂(excipient)的形状，在油或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，并可以包含配制试剂如防沉降剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所述活性成分可以以粉末形式在使用前用适宜的载体(例如无菌无热原水)重构。

本公开的药物还可以配制用于直肠给药，例如呈栓剂或保留灌肠(例如，包含常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯)。

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本公开的一个方面，涉及一种化合物用于制备具有改善肺纤维化作用的药物的用途，其特征在于，所述化合物如式(I)所示,

其中：

R₁选自C₁-C₆的烷基、C₁-C₆的杂烷基和C₃-C₆环烷基中的一种；

R₂选自羟基、甲基、乙基和氢原子中的一种；

R₃选自氢原子、C₁-C₆的烷基和C₁-C₆的杂烷基中的一种。

根据本发明的用途，本发明的化合物还可以如下式(II)所示：

本发明的化合物式(I)和式(II)均可以通过化学合成手段得到，也可以从植物的花、果、叶、茎、根中提取得到，如从天仙子中提取得到，提取的方法采用已知的方法。

可选的，所述具有改善肺纤维化作用是指能够清除氧自由基，优选地，能够调节氧自由基代谢。

可选的，所述能够清除氧自由基是指提高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的含量。

可选的，所述调节氧自由基代谢是指维持促纤维化因子和抗纤维化因子之间平衡；优选地，所述调节氧自由基代谢是指调节肺泡上皮细胞的增殖；优选地，所述肺泡上皮细胞来源于人，更优选地，所述肺泡上皮细胞为II型肺泡细胞。

可选的，所述化合物可以促进肺泡上皮细胞的增殖。

可选的，所述化合物可以抑制肺泡上皮细胞的增殖。

可选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。

可选的，所述药学上可接受的辅料或辅助性成分为注射液水、淀粉、糊精、蔗糖、硬脂酸镁和蒸馏酒精中的至少一种。

可选的，所述R₁选自甲基，所述R₂选自羟基，所述R₃选自氢原子。

取化合物式(I)，且R₁为甲基，所述R₂为羟基，所述R₃为氢原子，得到实验化合物1。所述实验化合物1来自中国大陆地区成都第一制药有限公司。

实施例1、实验化合物1对博来霉素诱导II型肺泡细胞增殖的影响。

1.1细胞培养与处理

II型肺泡细胞来自湖南丰晖生物科技有限公司，将II型肺泡细胞于DMEM培养基中成悬细胞，接种于六孔板中，放入37℃，5％CO₂孵箱中培养得到II型肺泡细胞。

将实验化合物1(来自中国大陆地区成都第一制药有限公司)，溶解于20mg/mL蒸馏水中，并通过0.22μm滤膜过滤，接着使用DMEM培养基将其制备为最终浓度分别为0、10、30、60和70μg/mL的实验化合物1。

1.2细胞增殖检测

细胞增殖检测采用CCK-8法(C0042，Beyotime，China)。将3000个细胞接种在96孔板中24小时，然后依次用上述1.1中的博来霉素和实验化合物1对细胞进行处理。在实验结束前，加入CCK8检测液孵育至少1h,接着利用酶标板检测仪测量450nm处的吸光值。

二、实验过程

在60μg/mL的博来霉素的条件下，分别添加10、20、30、40、70和80μg/mL的实验化合物1，接着对II型肺泡细胞进行24h处理，得到如图1所示的结果。

三、实验结果

如图1所示，30μg/mL的实验化合物1能够显著增加II型肺泡细胞的增殖，70g/mL的实验化合物1能够显著抑制II型肺泡细胞的增殖。说明本发明的化合物能够双向调节II肺泡细胞的增殖。30μg/mL的化合物作用24h可以保护II肺泡细胞的增殖。

实施例2、

1、材料

1.1药物与试剂

实验化合物1(来自成都第一制药)、试剂谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；

肿瘤坏死因子(TNF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF-β1)ELISA试剂盒，均由武汉博士德生物技术有限公司生产。

1.2动物

清洁级健康Wistar大鼠144只，雌雄各半，体重(200±20)g，由山西省中医院实验动物中心提供。

1.3仪器

主要有自动酶标仪：Bio-Tek ELX8000(上海安泰分析仪器有限公司制造)，UV-260紫外可见分光光度仪(上海精密仪器厂制造)等。

1.4方法

所有的144只大鼠以20％的乌拉坦麻醉后固定，常规消毒，随机平均分为6个组，每个组雌雄大鼠各半，其中一个组为空白对照组。其余的5个模型组全部注射博莱霉素溶液5ml.kg^-1复制模型，术后分为模型对照组、阳性对照组、实验化合物1的高、中、低剂量组。

空白对照组手术操作同模型对照组，气管内注射等容量生理盐水。次日各治疗组开始灌胃给药，实验化合物1的高、中、低剂量组。实验化合物1高剂量组浓度为3.2mg.kg^-1，实验化合物1中剂量组浓度为1.6mg.kg^-1，实验化合物1低剂量组浓度为0.8mg.kg^-1。阳性对照组醋酸泼尼松混悬液浓度为6mg.kg^-1(相当于人临床日用剂量48mg体重比例的7.5倍)，空白组与模型组给予等容量的生理盐水。连续21天。每天观察记录动物一般体征，分别在7，14，21天取材，前后期各10只，中期4只，腹主动脉取血检测细胞因子；夹闭右肺主支气管，灌洗左肺行支气管肺泡，收集支气管肺泡灌洗液分析；解剖肺脏，右肺称重计算脏器指数后匀浆、离心、取上清液检测抗氧化酶系，左肺灌洗、固定、HE染色、定性及半定量观察。得到的图示如图2至图7所示。

1.5统计学处理

实验数据计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析，组间数据比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，等级资料结果采用Radit分析，检验水准α＝0.05。

2结果

2.1对大鼠一般状态的影响

2.1.1对大鼠外观形态的影响

空白组大鼠活泼好动，饮食饮水正常，皮毛光泽，体重逐渐增加，呼吸平稳；模型组造模一周内精神萎靡，饮食饮水少，行动迟缓，皮毛无光泽、呼吸急促，体重增加不明显。两周后，饮食饮水渐增，体重开始缓慢上升；实验化合物1高剂量组皮毛尚可，饮食饮水较好，体重增加明显，呼吸匀称。阳性对照组早期效果较好，后期出现皮毛坚竖，懒动，状态不如早期，但好于模型组。

2.1.2对PF大鼠体重的影响

与空白组相比，模型组大鼠的体重下降最显著(P<0.01)；其余各组大鼠体重也有不同程度的下降。与模型组相比，实验化合物1的高、中剂量组大鼠体重上升趋势明显，具有显著统计学差异(P<0.05)，具体的结果如下表1所示。

表1各组大鼠体重变化情况表(g)

注：与空白组比较，1)P<0.05,2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05,4)P<0.01

2.1.3对大鼠肺系数的影响

空白组各期肺系数无明显变化，模型组大鼠各期肺系数均明显高于同期空白组(P<0.01或0.05)，阳性组、实验化合物1各组各期肺系数均高于同期空白组大鼠，但明显低于同期模型组大鼠(P<0.01或0.05)，具体的如下表2：

表2各组大鼠肺系数比较(n＝10,)

注：与空白对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01。

2.2对大鼠肺组织中SOD、GSH-Px及NO的影响

2.2.1对大鼠肺组织中SOD的影响

与空白组相比，第7天、第21天时模型组大鼠肺组织中SOD的含量均明显降低(P<0.01)，其余各组大鼠也有不同程度降低，说明模型复制成功。与模型对照组相比，实验化合物1高、中、低剂量组均可显著升高PF大鼠肺组织中SOD的含量(P<0.05)，具体的见表3。

表3第7、21天各组大鼠肺组织中超氧化物歧化酶SOD的参数比较(n＝10,U/mgprot)

注：与空白组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

2.2.2对大鼠肺组织中GSH-Px的影响

空白对照组第7天和第21天大鼠肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量稳定；与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织中GSH-Px的含量均明显降低(P<0.01)，其余各组也有不同程度降低，说明模型复制成功。与模型组相比，实验化合物1高、中、低剂量组均可升高肺纤维化大鼠肺组织中GSH-Px的含量(P<0.05，P<0.01)，具体的见表4。

表4第7、21天各组大鼠肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)参数比较(n＝10,U/gprot)

注：与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型对照组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；

2.2.3对大鼠肺组织中NO的影响

与空白对照组相比，第7天、21天时模型组大鼠肺组织中NO含量均明显升高(P<0.01)，其余各组也有不同程度增高，说明模型复制成功；与模型对照组相比，实验化合物1高、中、低剂量组可显著降低肺纤维化大鼠肺组织中NO的含量(P<0.05)，具体的见表5。

表5、第7、21天各组大鼠肺组织中一氧化氮(NO)参数比较(n＝10,umol/mgprot)

注：与空白对照组比较，1)P<0.05,2)P<0.01；与模型对照组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；2.2.4对大鼠肺组织中MDA的影响

与空白组相比，第7天、第21天时时模型组大鼠肺组织中MDA的含量均明显升高(P<0.01)，其余各组也有不同程度升高，说明模型复制成功。与模型对照组相比，实验化合物1高、中、低剂量组均可显著降低PF大鼠肺组织中MDA的含量(P<0.05)，具体的见表6。

表6、第7、21天各组大鼠肺组织中丙二醛MDA的参数比较(n＝10,nmol/mgprot)

注：与空白组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；

2.3对大鼠肺组织病理形态学变化的影响

2.3.1大体观察

空白组第7，14，21天时，双肺呈粉红色，表面光滑，弹性好。模型组，第7天，双肺见密集的点状出血灶并黑色瘀斑，肺体积增大；第14天，双肺呈灰白色，局部可见大小不等的结节样改变及陈旧性出血点，肺组织较硬；第21天双肺苍白，体积缩小，触及较硬，表面结节样改变及条索状凹沟。与模型组比较，第7天时，阳性组及高、中、低剂量组两肺外观病理变化明显好于模型组，两肺稍暗红，弹性尚可，其中高、中剂量组明显好于阳性组、小剂量组；第14-21天时，高、中剂量组大部分动物两肺颜色稍暗，双肺弹性尚可，偶可见部分肺叶有散在的点状灰色斑块，但好于阳性组与低剂量组，而阳性组及低剂量组略好于模型组。

2.3.2 HE染色光镜观察

如图2至图7所示，空白组：肺组织结构清晰，肺泡间隔未见增厚，无充血水肿、炎症及纤维化表现，肺泡腔内无明显渗出。

模型组：第7d肺泡炎明显，肺泡腔及肺间质均可见大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主，肺泡间隔水肿，轻度增宽。第14d肺泡炎程度有所减轻，肺泡间隔增厚以巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主，成纤维细胞增生，肺泡腔变窄，间质胶原纤维增生呈带状，发生纤维化。第21d纤维化进一步加重，肺泡结构破坏或消失，大量炎症细胞浸润，肺组织以胶原沉积、肺纤维化改变为主。

阳性组：肺泡炎及肺纤维化程度较模型组减轻，第7d时炎性细胞浸润较模型组明显减少。第14d时呈轻中毒肺泡炎改变，肺泡间隔增厚，病变程度较同期模型组轻，肺组织结构基本完整。第21d时呈轻微肺纤维化改变，病变范围较局限，胸膜和肺泡间隔胶原纤维沉积呈束状。

实验化合物1各组：高、中剂量组肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组明显减轻。第7d时肺组织炎性细胞浸润区域较模型组减少。第14d时呈轻中度肺泡炎改变，肺组织结构较模型组完整，成纤维细胞增殖减轻，病变程度较同期模型组轻。第21d时轻中度纤维化改变，病变范围局限，胸膜和肺泡间隔胶原纤维沉积呈束状。实验化合物1低剂量组的肺泡炎及肺纤维化程度与模型组比较，略微减轻，但无统计学意义(P>0.05)。

2.3.3病理形态学半定量分析结果

光镜观察，空白组未出现肺泡炎、肺纤维化的病理改变。模型组明显出现肺泡炎至肺纤维化的病理改变。依据文献Szapiel SV等的方法确定肺泡炎(－至+++级)的程度和肺纤维化(－至+++级)的程度。经Radit分析，较模型组，实验化合物1的低、中、高剂量组较模型组肺泡炎症显著减轻。具体的见表7。

表7、各组大鼠肺泡炎和肺间质纤维化病理学分析结果(n＝10)

2.4对大鼠血清细胞因子网络的影响

2.4.1对大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响

第7、21天，空白组血清中TNF-a含量基本保持不变；与空白组比较，模型组血清中TNF-a含量均显著增高(P<0.01)，说明造模成功；与模型组比较，阳性组TNF-a参数显著降低(P<0.05)；实验化合物1低剂量组无显著性差异(P＞0.05)；实验化合物1中、高剂量组大鼠血清中TNF-a的水平显著降低(P<0.05)；中剂量组在第7天TNF-a水平与阳性组相当，而到第21天，高剂量组的TNF-a水平与阳性组相当。实验化合物1低、中、高剂量血清中TNF-a水平呈持续降低趋势，显示出明显的量效改变，具体的见表9。

表9第7、21天各组大鼠血清TNF-a参数比较(pg/mL,)

注：与空白对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

2.4.2对PF大鼠血清血小板衍生生长因子(PDGF)的影响

第7、21天，空白对照组血清中PDGF含量波动不大；与空白对照组相比，模型组血清中PDGF含量均显著增加(P<0.01)，说明造模成功；与模型组比较，阳性组血清PDGF参数显著降低(P<0.01、P<0.05)；第7天，实验化合物1低剂量组血清PDGF含量降低(P<0.05)，第21天则无显著性差异(P＞0.05)；实验化合物1中、高剂量组明显降低(P<0.05或P<0.01)；实验化合物1低、中、高剂量组血清PDGF含量呈持续降低趋势，显示出明显的量效改变，具体的见表10。

表10第7、21天各组大鼠血清PDGF参数比较(pg/mL,)

注：与空白对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；

2.4.3对PF大鼠血清转化生长因子(TGF-β)的影响

第7、21天，空白对照组血清中TGF-β1含量变动不大；与空白对照组比较，模型对照组血清中TGF-β1含量均显著增高(P<0.01、P<0.05)；与模型组比较，阳性组血清中TGF-β1含量明显降低(P<0.01)；实验化合物1低、中、高剂量组血清TGF-β1含量降低(P<0.01、P<0.05)，并显示出明显的量效改变，具体的见表11。

表11第7、21天各组大鼠血清TGF-β1参数比较(pg/mL,)

注：与空白对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。