用于预防/治疗仔猪肠道损伤的egf/mmt复合物
阅读说明：本技术 用于预防/治疗仔猪肠道损伤的egf/mmt复合物 (EGF/MMT compound for preventing/treating intestinal tract injury of piglets ) 是由 刘淑杰 徐子伟 齐珂珂 吴杰 于 2021-11-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于预防/治疗仔猪肠道损伤的EGF/MMT复合物,该复合物通过如下方法制备获得：向pH值小于8的缓冲液中加入EGF和MMT或者金属基蒙脱石反应,取沉淀物,烘干；本发明制备EGF/MMT复合制剂,使之增强抵抗消化道不利因素的能力,并随吸附剂MMT“聚集”肠道黏膜损伤部位靶向结合受体,提高损伤部位EGF的稳定性和浓度,达到快速修复损伤肠道的目的,有效发挥EGF及MMT对肠道双重保护作用。(The invention provides an EGF/MMT compound for preventing/treating intestinal tract injury of piglets, which is prepared by the following method: adding EGF and MMT or metal-based montmorillonite into buffer solution with pH value less than 8 for reaction, taking precipitate, and drying; the EGF/MMT composite preparation prepared by the invention enhances the capability of resisting adverse factors of the digestive tract, and gathers' the targeting binding receptor of the injured part of the intestinal mucosa along with the MMT adsorbent, thereby improving the stability and concentration of the EGF at the injured part, achieving the aim of quickly repairing the injured intestinal tract and effectively playing the dual protection role of the EGF and the MMT on the intestinal tract.)
技术领域
本发明属于畜牧兽医技术领域，尤其涉及一种EGF/MMT复合物的制备及其在预防/治疗断奶仔猪肠道损伤中的应用。
背景技术
仔猪早期断奶技术是现代规模化猪场普遍采用的关键技术，其重要性日益显著。然而早期断奶仔猪的消化机能与免疫系统尚未发育完全，还不能适应营养与外界环境因素的突然改变，早期断奶首当其冲危害其肠道健康。断奶应激极易造成仔猪肠道损伤，肠绒毛断落、隐窝深度增加，消化酶活性降低，并且肠道黏膜免疫系统中的细胞因子、抗体等分泌改变，最终导致生产性能降低，抗病力下降，常引发腹泻，甚至造成仔猪死亡，给养猪生产带来极大的经济损失。动物肠道不仅是营养物质消化吸收的场所，也是机体重要的免疫器官。因此，改善肠道结构与功能，促进断奶仔猪肠道发育，提高饲料利用率，对解决仔猪早期断奶应激综合症问题具有重要意义。
表皮生长因子是一种强有力的细胞有丝分裂原，可刺激细胞分裂、增殖，增加上皮组织的DNA与蛋白质合成，其独特作用是促进胃肠组织生长与损伤修复，诱导小肠分泌消化酶类。猪表皮生长因子(pEGF)是一个含有53个氨基酸的单链多肽，分子质量为6.05kDa，母乳是动物哺乳时期肠道pEGF的主要来源。pEGF基本生物学作用如下：(1)促进胃肠道上皮细胞增殖与分化；(2)增加胃肠黏膜血流量，缓解胃肠道损伤，抑制胃酸分泌；(3)增加胃黏膜黏液糖蛋白的合成与分泌，促进受损上皮组织的修复；(4)诱导小肠黏膜刷状缘消化酶表达，改善对养分的消化利用。
早期断奶使仔猪突然中断乳源性EGF，此时通过外源方法供给可有效弥补内源性EGF不足，对仔猪肠道发育具有重要作用。但是目前主要是通过口服途径直接将EGF递送给仔猪，效果还不稳定。有些研究显示，补充EGF的断奶仔猪空肠绒毛高度/隐窝深度比值及黏膜蛋白质含量并未改变，断奶仔猪肠道结构、功能及生长性能未有显著提高。关键原因是EGF发挥作用必须满足两点要求，一是EGF在消化道内要稳定存在，二是足够剂量的EGF到达肠道，并与肠道黏膜受体相结合才能发挥作用。然而EGF经仔猪口服后进入消化道极端环境，部分可能被胃酸和消化酶等降解成无活性的小分子形式，或者与大量食糜混合随粪便排出体外，而EGF靶向结合肠道受体的机率被大大降低，增加EGF口服剂量无疑会增加成本。因此，需要寻找一个优越的肠道递送载体，能够保护EGF免受消化道极端环境破坏，并可将EGF递送至肠道释放与受体相结合，从而使其发挥最大功效。
MMT是由两层硅氧四面体片和一层夹于其间的铝(镁)氧(羟基)八面体片构成的2:1型层状硅酸盐矿物质。硅氧四面体中的Si4+可被Al3+替换，铝氧八面体片中的Al3+可被Mg2+、Zn2+、Mn2+或Fe2+替换，从而使晶层间产生永久性负电荷，以及具有离子交换特性。MMT颗粒细小(粒径小于2pm)，通常以数以千计的结果单元层堆砌而成，特殊结构使MMT具有较大的比表面积，可使其均匀的覆盖整个肠道黏膜表面并与黏膜蛋白结合，对肠道黏膜起到保护和修复的作用。另外，MMT还具有优良的吸附特性、良好的纳米空间结构，使其成为优越的药物输送载体，可保护药物免受消化道不良因素破坏，特别是其能在病灶部位“浓缩”并缓释释放药物，达到了靶向输送并提高局部药物浓度目的。蛋白质分子可依赖于带负电的酸性氨基酸基团、带正电的碱性氨基酸基团，通过离子交换反应、嵌入反应等方式进入MMT片层，还可以吸附MMT颗粒表面。以MMT作为载体制备EGF/MMT复合制剂，可增强其抵抗消化道不利因素的能力，并随吸附剂MMT聚集于肠道黏膜损伤部位靶向结合受体，实现靶向递送、缓释与精准调控，用于“禁抗”背景下断奶仔猪的肠道损伤修复、抗腹泻及提高生产性能。
发明内容
针对仔猪消化道特殊环境，本发明制备EGF/MMT复合制剂，使之增强抵抗消化道不利因素的能力，并随吸附剂MMT“聚集”肠道黏膜损伤部位靶向结合受体，提高损伤部位EGF的稳定性和浓度，达到快速修复损伤肠道的目的，有效发挥EGF及MMT对肠道双重保护作用。
第一方面，本发明提供一种用于预防/治疗仔猪肠道损伤的EGF/MMT复合物，该复合物通过如下方法制备获得：向pH值小于8的缓冲液中加入EGF和MMT或者金属基蒙脱石反应，取沉淀物，烘干。
本发明制备的EGF/MMT复合物稳定性好，能够靶向递送至肠道黏膜损伤部位发挥作用，减少EGF使用剂量，安全且制备简单。
在一些实施例中，所述的缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
在一些实施例中，缓冲液的pH小于4.6。
在一些实施例中，所述金属基蒙脱石为Na-MMT，所述EGF和Na-MMT质量比为1:1×103-1×106；优选地，所述EGF和Na-MMT质量比为1:2×104-4×104。
在一些优选实施例中，所述的复合物通过如下方法制备获得：配制浓度为0.05mol/LpH值为3.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，向缓冲液中分别加入EGF和Na-MMT，振荡1h，离心，沉淀物烘干后，研磨成粉。
第二方面，本发明提供一种用于预防/治疗仔猪肠道损伤的饲料添加剂，该饲料添加剂包括前述所述的EGF/MMT复合物。
第三方面，本发明提供一种用于预防/治疗仔猪肠道损伤的饲料，该饲料包括前述所述的EGF/MMT复合物。
第四方面，本发明将前述所述的EGF/MMT复合物应用于增加仔猪肠道长度，调节小鼠细胞因子浓度、抑制肠道炎症以及维护肠道功能屏障完整性反应。
本发明以改性蒙脱石吸附制备EGF/MMT复合制剂，使之增强抵抗消化道不利因素的能力，并随吸附剂MMT“聚集”肠道黏膜损伤部位靶向结合受体，提高损伤部位EGF的稳定性和浓度，达到预防和快速修复损伤肠道的目的，有效发挥EGF及MMT对肠道双重保护作用。
此外，MMT/EGF复合物的成功研发有望解决当前“禁抗”环境下断奶仔猪的肠道损伤、腹泻及生产性能降低等问题，对提高仔猪健康状况、猪场的经济效益具有重要的意义和实用价值，可替代抗生素用于猪肠道健康调控。
附图说明
图1为不同反应pH值下MMT对EGF的吸附量；
图2为不同反应时间下MMT对EGF的吸附量；
图3为不同质量比时MMT对EGF的吸附量；
图4为MMT及EGF/MMT复合物的FT-IR谱图；
图5为MMT及EGF/MMT复合物的TG曲线；
图6为各组小鼠结肠组织病理图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明实施进行详细的说明。以下实施例中所用的EGF、MMT和相关的化学试剂等，以及未注明具体条件的实验方法，按常规或按商品供货商所建议的条件进行。
反应体系优化及EGF/MMT复合物的制备以下实施例使用的蒙脱石均为钠基蒙脱石(Na-MMT)。
实施例1
确定反应体系适宜pH值：分别配制浓度为0.05mol/LpH值为3.0、3.8、4.6、6.2、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，向20mL缓冲液分别加入6mg EGF和100mg Na-MMT，然后振荡1.5h，离心，取出上清液，用去离子水洗涤沉淀物，合并上清液，采用BCA试剂盒测定上清液中蛋白质含量，根据反应完全及仔猪胃环境确定反应最适pH3.8。
说明，参见图1，在反应体系pH3.0-4.6条件下，Na-MMT与EGF几乎完全反应，Na-MMT对EGF吸附量约100％；pH6.2-8.0条件下，Na-MMT对EGF的吸附量降低。
实施例2
确定适宜反应时间：配制浓度为0.05mol/L pH值为3.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，向20mL缓冲液加入6mg EGF和100mg Na-MMT，然后分别振荡0.5、1、2、3、4、5、6和22h，离心，取出上清液，用去离子水洗涤沉淀物，合并上清液，采用BCA试剂盒测定上清液中蛋白质含量。确定适宜反应时间为1h。
说明，参见图2，在反应时间为0.5-22h时EGF和Na-MMT均可完全反应，Na-MMT对EGF吸附量约100％，考虑反应完全性及工艺简化选择1h。
实施例3
确定EGF和Na-MMT适宜质量比：分别配制浓度为0.05mol/LpH值为3.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，向20mL缓冲液加入100mgNa-MMT，分别按照EGF和Na-MMT质量比1:10、1:20、1:40、1:60、1:80和1:100加入EGF，然后振荡1h，离心，取出上清液，用去离子水洗涤沉淀物，合并上清液，采用BCA试剂盒测定上清液中蛋白质含量，以上浓度比均可完全反应。
说明，参见图3，EGF和Na-MMT质量比1:10、1:20、1:40、1:60、1:80和1:100时，EGF和Na-MMT均可完全反应，Na-MMT对EGF吸附量约100％。
实施例4EGF/MMT复合物制备
通过实施例1-3的条件优化，配制浓度为0.05mol/LpH值为3.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，向缓冲液中分别加入10mg EGF和100mg Na-MMT，然后振荡1h，离心，用去离子水洗涤沉淀物，沉淀物55℃烘干36h后，研磨至粒径小于0.074mm，获得EGF/MMT复合物。
将EGF/MMT复合物进行FT-IR测试，结果如图4所示，EGF/MMT复合物的FT-IR谱图，波数2000-1000/cm出现酰胺带特征峰，具备MMT和EGF的特征峰。
将EGF/MMT复合物进行TG测试，如图5所示，TG曲线中，其中EGF失重比例更大，EGF/MMT复合物改善了EGF的失重，提高了EGF稳定性，使得EGF/MMT复合物在制备干燥过程中不易被降解。
试验例1EGF/MMT体外释放试验
称取100mg实施例4获得EGF/MMT复合物，加入3mL pH分别为3.8、7、8和9的缓冲溶液，将样品置于37℃、150r/min恒温摇床中，分别在1、3和5h取出样品，3000r/min离心10min，取200uL上清液，然后迅速补足新的介质，采用BCA试剂盒测定上清EGF含量；如下表1所示，EGF/MMT复合物在pH3.8时几乎不释放EGF，而在pH7-9时可缓释释放EGF。
表1为不同pH值体系下EGF/MMT复合物体外释放
众所周知，仔猪胃内pH值约为3.8左右，肠道pH值约为7、8，或7-8之间；而实施例4的EGF/MMT复合物在pH值为3.8释放体系下，复合物几乎未释放EGF，在pH值为7-9时可缓释释放EGF，说明EGF/MMT复合物在仔猪胃内几乎不释放EGF，到达肠道可缓释释放EGF；解决了现有的EGF经仔猪口服后进入消化道极端环境后被胃酸和消化酶等降解成无活性的小分子形式的技术问题。
试验例2MMT/EGF复合物对损伤肠道的修复作用
实验材料与方法：
雌性健康BALB/C小鼠72只(清洁级，浙江省医学科学院动物实验中心提供)；磁力搅拌器(德国IKA公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)，荧光显微镜摄像机(日本OLYMPUS公司BX20型)，自动脱水机(英国Thermo shandon公司)、酶标仪(美国Bioteck公司)。
雌性健康BALB/C小鼠72只，分为6组。空白对照组(组Ⅰ)、DSS组(组Ⅱ)、MMT组(组Ⅲ)、EGF/MMT低剂量组(组IV)、EGF/MMT中剂量组(组Ⅴ)、EGF/MMT高剂量组(组Ⅵ)；而各个剂量组的EGF/MMT复合物制备方法参照实施例4，区别仅在于EGF/MMT质量比不同，EGF/MMT低剂量组(组IV)、EGF/MMT中剂量组(组Ⅴ)、EGF/MMT高剂量组(组Ⅵ)对应的EGF/MMT复合物中EGF/MMT质量比如表1所示；本实施例中各组的处理见表2。
表2小鼠试验分组及处理
组别
饮水处理
灌胃处理
MMT/EGF复合物比例
组Ⅰ
水
水
—
组Ⅱ
3％DSS
水
—
组Ⅲ
3％DSS
1g/kg MMT水溶液
—
组IV
3％DSS
1g/kg EGF/MMT水溶液
EGF:MMT＝1:3.3×10<sup>5</sup>
组Ⅴ
3％DSS
1g/kg EGF/MMT水溶液
EGF:MMT＝1:3.3×10<sup>4</sup>
组Ⅵ
3％DSS
1g/kg EGF/MMT水溶液
EGF:MMT＝1:8.3×10<sup>3</sup>
组Ⅱ-组Ⅵ所有小鼠第1-9天每天饮用3％DSS，第10-16天饮用纯净水；组Ⅰ小鼠第1-16天自由饮用纯净水。第1-9天，组Ⅰ和组Ⅱ每隔1天灌服100ul纯净水，组Ⅲ每隔1天灌服100ulMMT水溶液，组IV-组Ⅵ每隔1天灌服100ul不同剂量EGF/MMT水溶液。试验第10-16天，各组小鼠改为每天灌服各自的灌胃处理物。在第0、16天早晨，所有小鼠空腹称重。第16天，于眶下静脉采血，分离血清，测定血清DAO活性和D-LAC浓度；颈椎脱臼法处死小鼠，沿腹中线打开腹腔，取出结肠组织，测量从盲肠端至肛门的结肠长度；取1cm结肠组织，放入10％中性甲醛液中，样品经石蜡包埋后切片，HE染色，进行组织病理学分析及结肠炎性评分；另准确称取小鼠剩余结肠重量，加入灭菌生理盐水，机械匀浆后离心取上清，分析肠道细胞因子水平和紧密连接蛋白浓度。
结果如表3所示，与空白对照组相比，各组小鼠结肠长度显著降低，但EGF/MMT中、高剂量组结肠长度分别高于DSS组和MMT组。结肠炎性评分结果显示，DSS组和MMT组小鼠结肠炎性评分显著高于空白对照组，而EGF/MMT低、中和高剂量组炎性评分显著低于DSS组和MMT组，而与空白对照组相比差异不显著。
表3为各组小鼠结肠长度及炎性评分
HE染色结果显示(图6)，空白对照组结肠组织各层结构完整，黏膜上皮细胞完整，未见炎症细胞浸润、溃疡和肿瘤等；DSS组结肠各层结构尚存在，固有层和黏膜下层内可见大量炎症细胞浸润，甚至形成淋巴滤泡，腺体有不同程度的萎缩，未见溃疡、肿瘤等；MMT组结肠各层结构清晰，未见明显溃疡，黏膜固有层内较多炎症细胞浸润；黏膜上皮略有增生等；EGF/MMT各剂量组结肠各层结构清晰，未见明显溃疡，低剂量组仅见黏膜固有层内少量炎症细胞浸润，中剂量组偶见极少量炎症细胞浸润，高剂量组偶见较少量炎症细胞浸润等。
另外，与空白对照组相比，DSS组IL-10浓度极显著降低(P<0.01)，TNF-α、IFN-γ和IL-6浓度极显著升高(P<0.01)(表4)。与DSS组相比，MMT组IL-10浓度显著升高(P<0.05)，TNF-α浓度极显著降低(P<0.01)(表4)。与DSS组相比，EGF/MMT低和中剂量组TNF-α、IFN-γ和IL-6浓度极显著降低(P<0.01)，低剂量组IL-10浓度极显著升高(P<0.01)，中剂量组IL-10浓度显著升高(P<0.05)。高剂量组IL-6浓度显著低于DSS组(P<0.05)(表4)。这些说明，DSS组小鼠肠道缩短，结肠组织不同程度损伤，并诱发炎症反应，而EGF/MMT复合物能够增加肠道长度，调节细胞因子浓度恢复正常水平，抑制肠道炎症反应，对肠道具有一定的保护与损伤修复作用。
表4各组小鼠结肠细胞因子浓度
对结肠通透性检测结果显示(表5)，与空白对照组相比，DSS组血清DAO活性、D-LAC浓度极显著升高(P<0.01)，结肠claudin-1、occludin浓度极显著降低(P<0.01)。与DSS组相比，MMT组claudin-1浓度显著升高(P<0.05)，occludin浓度极显著升高(P<0.01)。与DSS组相比，EGF/MMT低和中剂量组DAO活性、D-LAC浓度极显著降低(P<0.01)，claudin-1、occludin浓度极显著升高(P<0.01)。与DSS组相比，高剂量组结肠occludin浓度极显著升高(P<0.01)。这些说明DSS增加了小鼠肠道的通透性，破坏了肠道功能屏障完整性，而EGF/MMT复合物显著降低了肠道黏膜通透性，保护了肠道功能屏障完整性。综合来看，EGF/MMT中剂量效果更好。
表5各组小鼠血清DAO活性、D-LAC浓度及结肠紧密连接蛋白浓度
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