一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物及其应用
阅读说明：本技术 一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物及其应用 (Pharmaceutical composition for inhibiting proliferation and migration of triple negative breast cancer cells and application thereof ) 是由 何钢 刘美 颜军 刘坤平 刘嵬 甘亚 梁立 胡建平 孙晓华 于 2021-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物,其特征在于：所述药物组合物包括金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26；所述金腰乙素的浓度为0.25×10～(-4)-1×10～(-)～(4)mol/L,所述为小分子抑制剂SBFI-26的浓度为1×10～(-4)mol/L；所述金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26应用于制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物；所述药物组合物用于三阴性乳腺癌,可有效促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞死亡,以及抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移,且所述药物组合物对正常细胞毒性低。(The invention discloses a pharmaceutical composition for inhibiting proliferation and migration of triple negative breast cancer cells, which is characterized by comprising the following components in part by weight: the pharmaceutical composition comprises chrysosplenetin B and a small molecule inhibitor SBFI-26; the concentration of the chrysosplenetin B is 0.25 multiplied by 10 ‑4 ‑1×10 ‑ 4 mol/L, the concentration of the small molecule inhibitor SBFI-26 is 1x 10 ‑4 mol/L; the chrysosplenetin and the small molecule inhibitor SBFI-26 are applied to preparing a pharmaceutical composition for inhibiting the proliferation and migration of triple-negative breast cancer cells; the pharmaceutical composition is used for triple negative milkAdenocarcinoma can effectively promote the death of MDA-MB-231 cells of triple-negative breast cancer and inhibit the migration of MDA-MB-231 cells of triple-negative breast cancer, and the pharmaceutical composition has low toxicity to normal cells.)
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，具体是一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物的应用。
背景技术
乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，约占女性恶性肿瘤的25％,在女性各种肿瘤中居首位,近年来发病率呈迅速上升趋势。三阴性乳腺癌(Triple Negative BreastCancer，TNBC)，即免疫组化显示雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone Receptor，PR)和HER-2均为阴性。作为乳腺癌的一种亚型，TNBC占所有乳腺癌的15％～20％。TNBC临床表现为较具侵袭性的病理特征，包括较高的复发率、对化疗药物的耐药性、确诊时较频繁的远端转移(指肿瘤细胞从原始发生的部位经由侵入循环系统，转移到身体其他部位继续生长的过程，也称恶性转移)和较差的预后等特点。而临床上治疗TNBC的方法包括手术、化疗和放疗，其中化疗是内科主要疗法。虽然化疗方案多样，但仍有35％的TNBC患者出现复发转移，且其生存期较短。
由于TNBC的细胞表面不存在特殊的细胞表面受体，因此，三阴乳腺癌具有侵袭力强，复发时间提前，恶性转移发生率高，疾病进展迅速，治疗手段有限，疗效欠佳，无病生存率、总生存率较低，总的生存时间缩短等特点。现有针对三阴性乳腺癌的药物具有毒性高、治疗缓解率较低的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物的应用，以达到降低三阴性乳腺癌细胞的存活率及抑制细胞迁移的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26；所述金腰乙素的浓度为0.25-1×10-4mol/L，所述为小分子抑制剂SBFI-26的浓度为1×10-4mol/L。
更进一步的，所述金腰乙素的浓度为0.25×10-4mol/L，所述为小分子抑制剂SBFI-26的浓度为1×10-4mol/L。
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物的应用，所述金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26应用于制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物。
所述金腰乙素的分子式为C19H18O8，化学结构式如下：
用于抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移；
所述小分子抑制剂SBFI-26的分子式为C28H22O4，化学结构式如下：
用于抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移；两者在一定的剂量下协同作用，促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞死亡，以及抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移。
本发明的有益效果是：本发明涉及的药物组合物应用于三阴性乳腺癌，可有效促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞死亡，以及抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移，且所述药物组合物对正常细胞毒性低。
附图说明
图1金腰乙素对于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制图；
图2金腰乙素作用于三阴性乳腺癌细胞24h细胞生存情况图；
图3金腰乙素联合SBFI-26作用于三阴性乳腺癌细胞24h细胞存活率图；
图4金腰乙素联合SBFI-26对三阴性乳腺癌细胞迁移的抑制图；
图5金腰乙素联合SBFI-26对三阴性乳腺癌细胞迁移抑制作用图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26；所述金腰乙素的浓度为0.25×10-4mol/L，所述为小分子抑制剂SBFI-26的浓度为1×10-4mol/L。
实施例2
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26；所述金腰乙素的浓度为0.5×10-4mol/L，所述为小分子抑制剂SBFI-26的浓度为1×10-4mol/L。
实施例3
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26；所述金腰乙素的浓度为0.75×10-4mol/L，所述为小分子抑制剂SBFI-26的浓度为1×10-4mol/L。
实施例4
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素和小分子抑制剂SBFI-26；所述金腰乙素的浓度为1×10-4mol/L，所述为小分子抑制剂SBFI-26的浓度为1×10-4mol/L。
实施例5
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素；所述金腰乙素的浓度为0.25×10-4mol/L。
实施例6
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素；所述金腰乙素的浓度为0.5×10-4mol/L。
实施例7
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素；所述金腰乙素的浓度为0.75×10-4mol/L。
实施例8
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括金腰乙素；所述金腰乙素的浓度为1×10-4mol/L。
实施例9
一种抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的药物组合物，所述药物组合物包括小分子抑制剂SBFI-26；所述SBFI-26的浓度为1×10-4mol/L。
空白对照组
所有空白对照组均使用体积分数为0.1％DMSO处理。
用实施例1-实施例9涉及的药物配比以及空白对照组进行实验，检验对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增值、存活和迁移的作用。
1、金腰乙素和SBFI-26母液的配制、保存和管理
(1)称取0.0037g金腰乙素，其后将称取的金腰乙素溶于100μL的DMSO中，其后涡旋混匀得0.1mol/L的金腰乙素，其后分别向5个50μL的离心管内分别装入1×10-4mol/L的金腰乙素20μL，其后将离心管置于-80℃超低温冰箱保存。
(2)称取10mg SBFI-26，其后溶解于1mL的DMSO中，其后涡旋混匀得10mg/mL的SBFI-26，其后向5个1.5mL的离心管内分别装入200μL的10mg/mL的SBFI-26，其后将离心管置于-80℃超低温冰箱保存。
2、金腰乙素对于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的调控实验
(1)将处于对数生长期的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞培养液以5000/孔接种于96孔板中，在“5％CO2，37℃”条件下的细胞培养箱内过夜培养使细胞贴壁；
(2)配置体积分数为0.1％的DMSO，浓度为0.25×10-4mol/L、0.5×10-4mol/L、0.75×10-4mol/L和1×10-4mol/L的金腰乙素；
具体操作为：
(2.1)取4支1.5mL的离心管和一支5mL的离心管，分别标记“0.1％DMSO、0.25×10- 4mol/L金腰乙素、0.5×10-4mol/L金腰乙素、0.75×10-4mol/L金腰乙素和1×10-4mol/L金腰乙素”；
(2.2)其后取100mM的金腰乙素5μL于标记“1×10-4mol/L金腰乙素”的离心管内，加入4995μL RPMI Medium 1640 Basic(1X)后涡旋混匀，得1×10-4mol/L金腰乙素；
(2.3)其后依次取(2.2)得到的1×10-4mol/L金腰乙素250μL、500μL、750μL于标记“0.25×10-4mol/L金腰乙素、0.5×10-4mol/L金腰乙素、0.75×10-4mol/L金腰乙素”的离心管内，再依次添加750μL、500μL、250μL RPMI Medium 1640 Basic(1X)，分别涡旋混匀后备用；同时取1μL DMSO于标记“0.1％DMSO”的离心管内，加999μL RPMI Medium 1640 Basic(1X)，涡旋混匀，备用；
(2.4)吸弃96孔板中的细胞培养液，每孔加100μL对应培养基，其后使用0.25×10- 4mol/L金腰乙素、0.5×10-4mol/L金腰乙素、0.75×10-4mol/L金腰乙素和1×10-4mol/L金腰乙素、体积分数为0.1％DMSO处理细胞培养液，每组6个重复；其后在细胞培养箱内继续培养24h后，在倒置显微镜下进行拍照记录，放大倍数为200倍；
(2.5)其后分别吸弃培养基，其后每孔添加100μL新的培养基，再每孔添加10μL的CCK8试剂，其后在37℃条件下孵育2h，其后用全自动酶标仪测定A450；
(2.6)根据细胞存活率公式①计算细胞存活率；并使用GraphPad Prism软件对数据进行处理并绘图。
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab]×100％ ①
As：实验孔(含有细胞培养基、CCK、毒性物质)
Ac：对照孔(含有细胞培养基、CCK、没有毒性物质)
Ab：空白孔(不含细胞和毒性物质的培养基、CCK)
实验结果如图1和2所示，从图1中可以看出，0.25×10-4mol/L金腰乙素就能导致三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞形态发生皱缩，说明金腰乙素能够抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，从图2中可以看出，0.25×10-4mol/L、0.5×10-4mol/L、0.75×10-4mol/L和1×10-4mol/L金腰乙素能够降低三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞存活，表明金腰乙素能够抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖。
3、金腰乙素联合SBFI-26对于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的调控
(1)将处于对数生长期的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞以5000/孔接种于96孔板中，每孔加100μL对应培养基，在“5％CO2，37℃”条件下的细胞培养箱内过夜使细胞贴壁；
(2)配置体积分数为0.1％的DMSO，浓度为0.25×10-4mol/L、0.5×10-4mol/L、0.75×10-4mol/L和1×10-4mol/L的金腰乙素与浓度为1×10-4mol/L SBFI-26的混合液；
具体操作为：
(2.1)取4支1.5mL的离心管和一支5mL的离心管，分别标记“0.1％DMSO、0.25×10- 4mol/L金腰乙素+SBFI-26、0.5×10-4mol/L金腰乙素+SBFI-26、0.75×10-4mol/L金腰乙素+SBFI-26和1×10-4mol/L金腰乙素+SBFI-26”；
(2.2)其后取100mM金腰乙素3μL于标记“1×10-4mol/L金腰乙素+SBFI-26”的离心管内，再向离心管内加入2997μL RPMI Medium 1640 Basic(1X)后涡旋混匀，得到1×10- 4mol/L金腰乙素；
(2.3)其后依次取(2.2)得到的1×10-4mol/L金腰乙素250μL、500μL、750μL于标记“0.25×10-4mol/L金腰乙素+SBFI-26、0.5×10-4mol/L金腰乙素+SBFI-26、0.75×10-4mol/L金腰乙素+SBFI-26”的离心管内，然后向每个离心管内添加10mg/mL SBFI-26 4.23μL，最后依次添加745.77μL、495.77μL、245.77μL RPMI Medium 1640 Basic(1X)，分别涡旋混匀后备用；剩余的1×10-4mol/L金腰乙素吸弃504.23μL后加10mg/mL SBFI-26 4.23μL，其后涡旋混匀后备用，同时取1μL DMSO于标记“0.1％DMSO”的离心管内，加999μL RPMI Medium 1640Basic(1X)，涡旋混匀，备用；
(2.4)吸弃96孔板中的细胞培养液，每孔加100μL对应培养基，其后使用不同浓度(0.25×10-4mol/L、0.5×10-4mol/L、0.75×10-4mol/L和1×10-4mol/L)的金腰乙素与1×10-4mol/L SBFI-26混合液以及0.1％DMSO处理细胞，在细胞培养箱内培养24h，每组6个重复；
(2.5)其后分别吸弃培养基，然后每孔添加100μL新的培养基，再添加10μL CCK8试剂，其后在37℃条件下孵育2h后使用全自动酶标仪测定A450；
(5)根据公式①计算细胞的存活率，并使用GraphPad Prism软件对数据进行分析处理。
实验结果如图3所示，可以看出，与空白对照相比，0.25×10-4mol/L金腰乙素联合1×10-4mol/L SBFI-26显著降低三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的存活率，下降60％以上(***p≤0.001)，与单独使用最高剂量(1×10-4mol/L)金腰乙素相比，存活率下降以上20％(***p≤0.001)，表明金腰乙素联合1×10-4mol/L SBFI-26能够显著抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，0.5×10-4mol/L、0.75×10-4mol/L和1×10-4mol/L金腰乙素联合1×10-4mol/LSBFI-26对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖也同样存在抑制；结合图2和3结果，选择0.25×10-4mol/L金腰乙素进行三阴性乳腺癌细胞迁移的抑制实验。
4、金腰乙素联合SBFI-26对于三阴性乳腺癌细胞迁移的抑制实验
(1)将在75cm2细胞培养瓶中的处于对数生长期的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞吸除旧的培养基，同时细胞培养瓶中加入5mL DPBS缓冲液后轻柔摇晃，倒掉，再向细胞培养瓶中加入5mL DPBS缓冲液重复清洗操作一次，洗掉旧培养基，其后加入3mL、0.25％Trypsin-EDTA(1X)将细胞消化成单细胞悬液，其后加入等体积的培养基，其后转移至15mL离心管内，在相对离心力为900g的条件下离心3min；
(2)去除离心后的上清液，向沉淀中加1mL的RPMI 1640 Basic(1X)，其后用移液枪吹打混匀，将细胞分散成单细胞悬液，其后进行细胞计数。
(3)其后将细胞悬液稀释成1-5×105/mL，接种至6孔板((提前在孔板背面画若干条平行线)，每孔接种2mL，其后置于细胞培养箱内过夜，等待细胞贴壁长满；
(4)配制体积分数为0.1％DMSO、浓度为0.25×10-4mol/L金腰乙素、1×10-4mol/LSBFI-26和0.25×10-4mol/L金腰乙素与1×10-4mol/L SBFI-26混合液；
具体操作如下：
(4.1)取4支15mL的离心管，分别标记“0.1％DMSO、0.25×10-4mol/L金腰乙素、1×10-4mol/L SBFI-26和0.25×10-4mol/L金腰乙素+1×10-4mol/L SBFI-26”；取100mM金腰乙素3μL于标记“0.25×10-4mol/L金腰乙素”的离心管内，其后加11997μL RPMI Medium 1640Basic(1X)涡旋混匀，得0.25×10-4mol/L金腰乙素；
(4.2)其后取0.25×10-4mol/L金腰乙素6mL于标记“0.25×10-4mol/L金腰乙素+1×10-4mol/LSBFI-26”的离心管内，吸除25.4μL后加25.4μL浓度为10mg/mL的SBFI-26，其后涡旋混匀备用；同时取25.4μL 10mg/mL SBFI-26于标记“1×10-4mol/L SBFI-26”的离心管内，加5974.6μL RPMI Medium 1640 Basic(1X)涡旋混匀后备用；同时取6μL DMSO于标记“0.1％DMSO”的离心管内，加5994μL RPMI Medium 1640 Basic(1X)涡旋混匀后备用；
(5)吸出6孔板培养孔内的培养基，用200μL枪头垂直于所画平行线进行细胞划痕，每孔至少有三条划痕(可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决前后观察时位置不固定的问题)；
(6)小心用DPBS冲洗划下的细胞，其后在倒置显微镜下观察，保证划痕均一；
(7)吸弃6孔板中的细胞培养液，其后向培养孔内添加提前配制的体积分数为0.1％DMSO、浓度为0.25×10-4mol/L金腰乙素、1×10-4mol/L SBFI-26和0.25×10-4mol/L金腰乙素与1×10-4mol/L SBFI-26混合液，每孔2mL。对照组添加0.1％DMSO，实验组使用0.25×10-4mol/L金腰乙素、1×10-4mol/L SBFI-26和0.25×10-4mol/L金腰乙素联合1×10-4mol/L SBFI-26进行处理，每组3个重复，在“5％CO2、37℃”条件下的细胞培养箱内培养24h；
(7)在倒置显微镜下进行拍照记录培养孔板，放大倍数为200倍；
(8)采用ImageJ软件对图像进行处理，计算划痕面积；
(9)采用GraphPad Prism软件对面积数据进行分析整理。
实验结果如图4和5所示，从图4可以看出，与空白对照相比，0.25×10-4mol/L金腰乙素能够抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移；与单独使用0.25×10-4mol/L金腰乙素、1×10-4mol/L SBFI-26相比，0.25×10-4mol/L金腰乙素联合1×10-4mol/L SBFI-26几乎使得三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移停止，接近90％(图5，***p≤0.001)；图4、5也表明0.25×10-4mol/L金腰乙素比1×10-4mol/L SBFI-26对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的抑制效果好；表明金腰乙素能够抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移，且联合用药效果最为显著。
综上，金腰乙素能够抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移，并且联合SBFI-26能够显著的抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞存活、增殖和迁移。
表1所用试剂和仪器表
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。