藤黄酸作为制备预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物的用途
阅读说明：本技术 藤黄酸作为制备预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物的用途 (Application of gambogic acid in preparation of medicine for preventing or treating renal ischemia-reperfusion injury ) 是由 陈刚 李亚坤 韩珍旖 于 2021-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种藤黄酸作为制备预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物的用途。本发明通过对传统中药藤黄的提取物藤黄酸进行动物试验和细胞实验,发现一定剂量的藤黄酸能够显著减轻小鼠肾脏缺血-再灌注损伤,这种保护作用主要是通过增强线粒体自噬来实现,这为预防或治疗肾脏IRI提供了重要的技术支持。临床上可以采用藤黄酸冻干粉针配制注射液,通过静脉注射给药,给药时间是在获取移植器官前24h之内对供体进行至少一次静脉推注,静脉推注的有效剂量每次为4～40mg/m～(2)。本发明已证实藤黄酸在肾脏保护和修复中的新用途,这也为医学科研人员在临床上探索治疗心脏、肝脏、肺等其他器官的缺血-再灌注损伤提供了新的选择方案或思路。(The invention discloses an application of gambogic acid in preparing a medicament for preventing or treating renal ischemia-reperfusion injury. Animal experiments and cell experiments are carried out on gambogic acid which is an extract of traditional Chinese medicine gamboge, and the gambogic acid with a certain dose is found to be capable of remarkably relieving mouse renal ischemia-reperfusion injury, and the protection effect is mainly realized by enhancing mitochondrion autophagy, so that important technical support is provided for preventing or treating renal IRI. Clinically, the gambogic acid freeze-dried powder injection can be prepared into injection for intravenous injection administration, and the administration time isPerforming intravenous injection on the donor at least once within 24 hours before the transplanted organ is obtained, wherein the effective dose of the intravenous injection is 4-40 mg/m each time 2 . The invention proves the new application of the gambogic acid in kidney protection and repair, and provides a new selection scheme or thought for medical researchers to clinically explore and treat ischemia-reperfusion injury of other organs such as heart, liver, lung and the like.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，主要涉及藤黄酸的一种新制药用途，具体地指藤黄酸作为制备预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物的用途。
背景技术
缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是急性肾损伤最常见的致病因素之一，常见于患者肾移植、心脏手术、创伤和休克等情况。例如，肾移植是目前治疗终末期肾脏病最为有效的手段。然而，肾移植的过程包括从供体切取肾脏、体外肾脏的保存、以及供肾植入受者体内的血管重建及血液再灌注，因此会不可避免地出现供肾获取前在供者体内的热缺血损伤、冷保存过程中的冷缺血损伤、以及移植到受者体内血流恢复后的再灌注损害。这种缺血-再灌注损伤往往导致移植肾功能恢复延迟、急性和慢性排斥反应发生率增加、进而显著影响移植物的近期和远期预后。因此，肾脏IRI一直是器官移植领域的研究热点之一。
2015年1月1日以来，公民逝世后的器官捐献已成为我国主要的移植器官来源，死亡器官捐献数量也在快速增长。根据相关记载，2017年我国共施行肾移植手术10793例，居全世界第2位。我国的器官移植数量在快速增长，然而供体短缺问题依然十分严重。以肾脏透析患者为例，我国每年新增透析人数超过5万，而年肾移植例数才刚刚过万。为了缓解这一严峻形势，边缘供体被纳入供者池。但这类供者通常会经历反复低血压、低氧血症、以及心肺复苏等情况，从而在肾移植后造成更为严重的肾脏IRI，继而显著影响移植的近期和远期效果。因此，研究及开发具有临床应用可行性的、能有效防治患者肾脏IRI的药物，对于移植医学有着十分重要的意义。
目前，医学科研人员在关于肾脏IRI的基础研究方面已经取得了很大的成绩，其中有不少药物在动物及细胞实验方面表现出良好的效果，但是在后续临床转化过程中却因为溶解性、安全性以及有效性等问题而以失败告终。因此，现阶段能够用于临床肾移植中肾脏IRI保护的有效手段还极为欠缺。
为了解决上述难题，医学科研人员除了在化学药物方面进行深入研究外，也一直在尝试寻找能够对肾脏IRI发挥保护作用的中药组分。中药及天然植物中的活性成分具有广泛的药理学活性，其中藤黄酸是中药藤黄的主要活性成分。实验表明，藤黄酸的药理作用十分广泛，抗肿瘤作用尤为显著，注射用藤黄酸在我国曾被用于临床抗肿瘤研究，并表现出良好的人体耐受性和安全性。例如国内某医科大学藤黄酸课题组与某药企合作，围绕藤黄酸在抗肿瘤中的作用进行了大量研究，并开发出了藤黄酸冻干粉针，上述注射用藤黄酸冻干粉针在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中都表现出毒副作用小、人体耐受性和安全性好的特性，但是由于其在治疗恶性肿瘤上并无明显临床优势，难以通过临床的优效性评价，只能终止该新药的后续研究，十分令人惋惜。
医学科研人员近期的实验也显示，藤黄酸在实验性肺、肝纤维化中均可以发挥良好的保护作用，并有研究证明藤黄酸具有一定的抗炎效应，但其是否能够对肾脏IRI发挥保护作用却未见报道。肾脏IRI在临床中十分常见，而目前临床上仍缺乏能有效治疗肾脏IRI的药物。因此，本领域迫切期待能够为临床提供对肾脏IRI具有保护作用的药物。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有技术存在的不足，提供一种藤黄酸作为制备预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物的用途，为肾移植手术开拓可以及时干预肾脏IRI的新药物。
为实现上述目的，本发明公开了中药藤黄提取物在新制备药物中的应用，即一种藤黄酸作为制备预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物的用途。
进一步地，所述药物是药剂学中含有藤黄酸活性成分的任何一种可接受的药剂。
更进一步地，所述药剂是含有藤黄酸活性成分的片剂、胶囊剂、滴丸剂、冻干粉针或注射液。
再进一步地，所述药剂是藤黄酸冻干粉针。
作为优选方案，所述藤黄酸冻干粉针在临床上通过静脉途径给药，给药时间是在获取移植器官前24h之内对供体进行静脉推注。
进一步地，所述给药时间是在获取移植器官前24～12h对供体进行第一次静脉推注，在获取移植器官前2～1h对供体进行第二次静脉推注。
更进一步地，所述给药时间是在获取移植器官前12h对供体进行第一次静脉推注，在获取移植器官前1h对供体进行第二次静脉推注。
作为优选方案，所述静脉推注的有效剂量每次为4～40mg/m2，其中单位mg/m2表示供体每平方米体表面积所用药物的毫克量。在医学领域中，人体(供体)的体表面积常用计算公式如下：
当体重≤30kg时，体表面积(m2)＝0.035×体重(kg)+0.1；
当体重＞30kg时，体表面积(m2)＝1.05+【体重(kg)-30】×0.02。
藤黄酸用于供体的有效剂量可在上述范围内根据多种因素确定，例如根据供体的体重、年龄、身体状态等进行调节。
进一步地，所述静脉推注的有效剂量每次为8～16mg/m2。
更进一步地，所述静脉推注的有效剂量每次为12mg/m2。
本发明通过构建小鼠肾脏IRI模型，并采用藤黄酸对小鼠肾脏IRI模型施行腹腔注射给药，来研究藤黄酸对肾脏IRI的作用并探讨其可能机制。实验数据显示，藤黄酸预处理肾脏IRI小鼠后，小鼠血生化检测以及肾组织HE、TUNEL和MPO染色结果显示，相比于肾脏IRI小鼠对照组，其血清肌酐、尿素氮水平明显降低，肾组织损伤、凋亡以及中性粒细胞浸润情况均明显减轻。透射电镜、免疫荧光染色以及蛋白质印迹(Western blot)分析结果显示，线粒体损伤、活性氧累积以及自噬及线粒体自噬抑制的现象在藤黄酸预处理后的IRI小鼠中相比于IRI小鼠对照组均明显减轻。此外，使用线粒体自噬激动剂预处理小鼠，也能够明显改善缺血-再灌注诱导的肾功能障碍、肾组织损伤、凋亡以及中性粒细胞浸润。然而，当线粒体自噬抑制剂与藤黄酸联合应用之后，藤黄酸预处理对肾脏IRI小鼠的保护作用被显著削弱了。这些实验结果证明，对于经典的肾脏IRI小鼠，藤黄酸可以通过增强线粒体自噬而有效改善肾脏IRI，从而可以利用藤黄酸制备预防或治疗肾脏IRI的药物。
本发明的有益效果在于：通过对传统中药藤黄的提取物藤黄酸进行动物试验和细胞实验，探索藤黄酸在肾脏IRI中的作用，发现一定剂量的藤黄酸能够明显减轻小鼠肾脏缺血-再灌注损伤，这种保护作用主要是通过增强线粒体自噬来实现，这为临床预防或治疗肾脏IRI相关疾病提供了重要的技术支持，临床上可以采用藤黄酸冻干粉针配制注射液，通过静脉给药途径应用。根据本发明的实验结果进行合理推论，藤黄酸也适于在制备预防或治疗心脏、肝脏、肺等器官缺血-再灌注损伤药物中的应用。
附图说明
图1包括图1A～图1G，其显示了8周龄C57小鼠先给予溶剂或藤黄酸(GA)预处理、然后分别行假手术或左肾缺血-再灌注手术、收集再灌注24h后的血清及肾组织、行血生化及HE、TUNEL和MPO染色的分析结果。其中：图1A为各组的血清肌酐(Serum Creatinine)、尿素氮(BUN)水平柱状对比图；图1B为各组肾组织的HE染色结果对比图；图1C为各组肾组织标本损伤评分柱状对比图；图1D为各组肾组织的TUNEL染色结果对比图，DAPI染细胞核；图1E为各组肾组织标本每高倍镜视野(400倍)凋亡细胞数目柱状对比图；图1F为各组肾组织的MPO染色结果对比图；图1G为各组肾组织标本每高倍镜视野MPO阳性细胞数目柱状对比图。各图中，Sham组为溶剂预处理+假手术组；RIRI组为溶剂预处理+肾脏缺血再灌注损伤组；GA+RIRI组为藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤组。
图2包括图2A～图2D，其显示了8周龄C57小鼠先给予溶剂或藤黄酸(GA)预处理、然后分别行假手术或左肾缺血-再灌注手术、收集再灌注24h后的肾组织、行透射电镜及DHE免疫荧光染色的分析结果。其中：图2A为各组肾组织的透射电镜结果对比图；图2B为各组肾组织标本线粒体损伤情况柱状对比图；图2C为各组肾组织的DHE免疫荧光染色结果对比图；图2D为各组肾组织标本DHE平均荧光强度柱状对比图。各图中，Sham组为溶剂预处理+假手术组；RIRI组为溶剂预处理+肾脏缺血再灌注损伤组；GA+RIRI组为藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤组。
图3包括图3A～图3I，其显示了8周龄C57小鼠先给予溶剂或藤黄酸(GA)预处理、然后分别行假手术或左肾缺血-再灌注手术、收集再灌注24h后的肾组织、行Western blot、透射电镜及免疫荧光染色的分析结果。其中：图3A为各组肾组织中LAMP1、LC3-II、p62和β-actin的Western blot对比图；图3B为各组肾组织中LAMP1、LC3-II和p62的表达量柱状对比图；图3C为各组肾组织的透射电镜结果对比图；图3D为各组肾组织中PINK1、Parkin和β-actin的Western blot对比图；图3E为各组肾组织中PINK1和Parkin的表达量柱状对比图；图3F为各组肾组织的LC3和Tom20的免疫荧光结果对比图；图3G为各组肾组织的Parkin和Tom20的免疫荧光结果对比图；图3H为各组肾组织中每个肾小管内黄色斑点(代表LC3与Tom20共定位)数目的柱状对比图以及含有黄色斑点(代表Parkin和Tom20共定位)的线粒体相对于所有线粒体的百分比柱状对比图；图3I为各组肾组织的透射电镜结果对比图。各图中，Sham组为溶剂预处理+假手术组；RIRI组为溶剂预处理+肾脏缺血再灌注损伤组；GA+RIRI组为藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤组。
图4包括图4A～图4I，其显示了8周龄C57小鼠先给予溶剂、线粒体自噬激动剂雷帕霉素(Rapa)或藤黄酸(GA)预处理、或在每次藤黄酸(GA)给药前1h给予线粒体自噬抑制剂3-MA或给药前30min给予线粒体自噬抑制剂Mdivi-1、然后分别行假手术或左肾缺血-再灌注手术、收集再灌注24h后的血清及肾组织、行血生化及HE、TUNEL、MPO及DHE染色的分析结果。其中：图4A为各组的血清肌酐、尿素氮水平柱状对比图；图4B为各组肾组织的HE染色结果对比图；图4C为各组肾组织标本损伤评分柱状对比图；图4D为各组肾组织的TUNEL染色结果对比图；图4E为各组肾组织标本每高倍镜视野凋亡细胞数目柱状对比图；图4F为各组肾组织的MPO染色结果对比图；图4G为各组肾组织标本每高倍镜视野MPO阳性细胞数目柱状对比图；图4H为各组肾组织的DHE免疫荧光染色结果对比图；图4I为各组肾组织标本DHE平均荧光强度柱状对比图。各图中，Sham组为溶剂预处理+假手术组；RIRI组为溶剂预处理+肾脏缺血再灌注损伤组；Rapa+RIRI组为雷帕霉素预处理+肾脏缺血再灌注损伤组；GA+RIRI组为藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤组；3-MA+GA+RIRI组为3-MA以及藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤组；Mdivi-1+GA+RIRI组为Mdivi-1以及藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤组。
图5包括图5A～图5B。其中：图5A为人肾小管上皮细胞系HK-2细胞经藤黄酸(GA)及氯化钴(CoCl2)处理后流式细胞术检测细胞凋亡的对比图；图5B为各组细胞凋亡率柱状对比图。
图6包括图6A～图6D。其中：图6A为人肾小管上皮细胞系HK-2细胞经3-甲基腺嘌呤(3-MA)、雷帕霉素(Rapa)、藤黄酸(GA)及氯化钴(CoCl2)处理后流式细胞术检测细胞凋亡的对比图；图6B为各组细胞凋亡率柱状对比图；图6C为人肾小管上皮细胞系HK-2细胞经藤黄酸(GA)、氯化钴(CoCl2)或巴佛洛霉素A1(Baf-A1)处理后流式细胞术检测细胞凋亡的对比图；图6D为各组细胞凋亡率柱状对比图。
图7包括图7A～图7B。其中：图7A为人肾小管上皮细胞系HK-2细胞转染NC siRNA或Parkin siRNA后经藤黄酸(GA)及氯化钴(CoCl2)处理后流式细胞术检测细胞凋亡的对比图；图7B为各组细胞凋亡率柱状对比图。
具体实施方式
以下结合附图、实施例和实验例对本发明作进一步的详细描述。当然，本发明的保护范围并不限于下述实施例。本领域专业技术人员能够理解，在不背离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但本发明仍然在此作尽可能详细的描述。以下实施例是进一步说明本发明，而不是限制本发明。任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明技术方案的范畴。
实施例1
可以采用藤黄酸冻干粉针配制的注射液，在肾移植手术之前通过静脉推注对供体给药，给药时间是在获取移植器官前24～20h对供体进行第一次静脉推注，在获取移植器官前2～1h对供体进行第二次静脉推注。给药的有效剂量一般每次4～40mg/m2，可根据供体的体重、年龄、身体状态等因素进行调节，其中单位mg/m2表示供体每平方米体表面积所用药物的毫克量。例如选择每次静脉推注的有效剂量为14～16mg/m2，用于预防供体发生肾脏缺血-再灌注损伤，或者对已产生的肾脏缺血-再灌注损伤进行修复。
实施例2
采用藤黄酸冻干粉针配制的注射液，在肾移植手术之前通过静脉推注对供体给药，给药时间是在获取移植器官前14～12h对供体进行第一次静脉推注，在获取移植器官前2～1h对供体进行第二次静脉推注。选择每次静脉推注的有效剂量可以为8～10mg/m2，用于预防供体发生肾脏缺血-再灌注损伤，或者对已产生的肾脏缺血-再灌注损伤进行修复。
实施例3
采用藤黄酸冻干粉针配制的注射液，在肾移植手术之前通过静脉推注对供体给药，给药时间是在获取移植器官前12h对供体进行第一次静脉推注，在获取移植器官前1h对供体进行第二次静脉推注。选择每次静脉推注的有效剂量为11～13mg/m2，用于预防供体发生肾脏缺血-再灌注损伤，或者对已产生的肾脏缺血-再灌注损伤进行修复。
为了证实本发明所述藤黄酸应用于预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物方面的优异疗效，下面进一步介绍其在各项药理学基础研究中所取得的结果。实验中采用市售藤黄酸粉末，溶解配制成藤黄酸注射液。为方便描述，各项药理学中的概念、含义或名称的缩写词如下：
GA：藤黄酸；
Serum：血清；
Creatinine：肌酐；
BUN：尿素氮；
HE：苏木精-伊红染色法；
TUNEL：原位末端转移酶标记法；
DAPI：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；
HPF：高倍镜视野；
MPO：髓过氧化物酶；
DHE：二氢乙啶；
LAMP-1：溶酶体相关膜糖蛋白1A；
LC-3：微管相关蛋白1-轻链3；
LC-3I：微管相关蛋白1-轻链3-I；
LC-3II：微管相关蛋白1-轻链3-II；
β-actin：β肌动蛋白；
PINK1：PTEN诱导激酶1；
Parkin：parkin RBR E3泛素蛋白连接酶；
Tom20：线粒体外膜转位酶20；
Merge：图片融合；
Rapa：雷帕霉素；
3-MA：3-甲基腺嘌呤；
Mdivi-1：线粒体分裂抑制剂1；
Baf-A1：巴佛洛霉素A1；
NC siRNA：阴性对照siRNA。
Annexin V：膜联蛋白V；
PI：碘化丙啶。
实验例1
藤黄酸对肾脏缺血-再灌注损伤模型小鼠的影响
以下实验通过实验研究藤黄酸对肾脏IRI小鼠肾损伤程度的影响，证明藤黄酸可作为预防或治疗肾脏IRI的药物。
实验步骤如下：
1、实验动物
SPF级雄性C57BL/6J小鼠(6周龄)购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心SPF级动物房，自由饮食，维持12h昼/夜周期。本实验所涉及的所有动物操作均符合华中科技大学实验动物伦理委员会的相关规定。6周龄C57小鼠进入屏障环境后使其适应2周，于小鼠8周龄时开始实验处理。
实验分组1：22只小鼠随机分配入溶剂预处理+假手术(Sham)组(n＝6)、溶剂预处理+肾脏缺血再灌注损伤(RIRI)组(n＝8)、以及藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤(GA+RIRI)组(n＝8)。
实验分组2：46只小鼠随机分配入溶剂预处理+假手术(Sham)组(n＝6)、溶剂预处理+肾脏缺血再灌注损伤(RIRI)组(n＝8)、线粒体自噬激动剂雷帕霉素预处理+肾脏缺血再灌注损伤(Rapa+RIRI)组(n＝8)、藤黄酸预处理+肾脏缺血再灌注损伤(GA+RIRI)组(n＝8)、线粒体自噬抑制剂3-MA+藤黄酸预处理后肾脏缺血再灌注损伤(3-MA+GA+RIRI)组(n＝8)、以及线粒体自噬抑制剂Mdivi-1+藤黄酸预处理后肾脏缺血再灌注损伤(Mdivi-1+GA+RIRI)组(n＝8)。
2、肾脏缺血-再灌注损伤模型
各组实验小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(80mg/kg)，腹部向上固定于32℃恒温毯上，待小鼠呼吸心跳平稳后开始造模。取腹部正中切口打开腹腔，暴露右肾，用6-0丝线结扎肾蒂及输尿管后切除右肾。再显露左肾，游离肾蒂后用无损伤血管夹夹闭左肾蒂，并立即将小鼠放入32℃婴儿保温箱中。34min后取掉血管夹，观察肾脏颜色变化以确认肾脏灌注良好，之后还原肠道，并行双层连续缝合关闭腹腔。Sham组小鼠不夹闭左肾蒂，其余操作与RIRI组相同。整个手术过程遵循无菌操作原则，手术器械均高压蒸汽消毒灭菌，手术后继续将小鼠放入婴儿保温箱中，待其苏醒后再放回鼠笼，正常饮食。
3、药物干预及结果处置
藤黄酸(腹腔注射，2mg/kg)及雷帕霉素(腹腔注射，2mg/kg)的干预时间为缺血前36h、12h及1h各注射一次；线粒体自噬抑制剂3-MA在每次藤黄酸注射前1h注射(腹腔注射，30mg/kg)；线粒体自噬抑制剂Mdivi-1在每次藤黄酸注射前30min注射(腹腔注射，25mg/kg)；Sham组和RIRI组小鼠每次腹腔注射等体积溶剂。
再灌注24h后，先收集各组小鼠血清，再处死小鼠，取左侧肾脏，剔除肾包膜，将肾脏纵切分为两半，一半置于4％中性甲醛溶液中固定，随后针对各组样本分别给予HE、TUNEL、MPO及LC3+Tom20和Parkin+Tom20的免疫荧光染色；另一半置于-80℃环境中，后期行DHE荧光染色和Western blot(检测LAMP1、LC3-II、p62、PINK1、Parkin)；或取少许肾组织(约1mm×1mm×1mm)置于电镜固定液中固定，随后行透射电镜检测。上述检测结果参见图1至图4。
图1(图1A～图1G)显示了藤黄酸对缺血-再灌注诱导的肾功能异常、肾组织损伤以及炎症细胞浸润的影响。其中：图1A显示缺血-再灌注导致小鼠血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平明显升高，而经藤黄酸预处理后Cr和BUN水平明显降低，说明小鼠肾功能得到明显改善。图1B和图1C显示藤黄酸预处理能明显减轻缺血-再灌注诱导的小鼠肾组织损伤。图1D和图1E显示藤黄酸预处理能显著改善缺血-再灌注诱导的小鼠肾组织内细胞凋亡。图1F和图1G显示藤黄酸预处理能明显减轻缺血-再灌注诱导的小鼠肾组织内MPO阳性细胞(即中性粒细胞)浸润。图中，***代表<0.001vs Sham组，###代表<0.001vs RIRI组。
图2(图2A～图2D)显示了藤黄酸对缺血-再灌注诱导的肾组织内线粒体损伤以及活性氧累积的影响。其中：图2A和图2B为透射电镜结果，其显示藤黄酸预处理能显著减轻缺血-再灌注诱导的小鼠肾组织内线粒体损伤。图2C和图2D为DHE免疫荧光染色结果，表明藤黄酸预处理后小鼠肾组织内DHE的平均荧光强度明显减少，说明活性氧含量降低。图中，***代表<0.001vs Sham组，###代表<0.001vs RIRI组。
结合图1和图2的实验数据，说明藤黄酸预处理能显著改善缺血-再灌注诱导的肾组织损伤，从而可以利用藤黄酸制备预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤的药物。
图3(图3A～图3I)显示了藤黄酸对肾组织内自噬及线粒体自噬的影响。其中：图3A和图3B为Western blot结果，其显示相比于RIRI组藤黄酸预处理能显著增加LAMP1和LC3-II的表达量，并降低p62的表达量。图3C为透射电镜结果，其显示缺血-再灌注导致肾组织内自噬小体/自噬溶酶体(黑色箭头所指示)的数量明显减少，而藤黄酸预处理后上述结构的数量有所增加。图3A至3C的实验结果说明：缺血-再灌注导致肾组织内自噬被明显抑制，而藤黄酸预处理能减轻上述抑制作用。图3D和图3E为Western blot结果，其显示藤黄酸预处理组的肾组织内PINK1和Parkin的表达量相比RIRI组显著升高。图3F至图3H显示了缺血-再灌注导致肾组织内线粒体自噬尤其是Parkin依赖的线粒体自噬被明显抑制，而藤黄酸预处理后上述抑制现象被显著减轻。图3I为透射电镜结果，其显示缺血-再灌注导致肾组织内线粒体自噬小体/线粒体自噬溶酶体(黑色箭头所指示)的数量明显减少，而藤黄酸预处理后上述结构的数量有所增加。图3D至3I的结果说明：缺血-再灌注导致肾组织内线粒体自噬被明显抑制，而藤黄酸预处理能减轻上述抑制作用。图中，**代表<0.01，***代表<0.001vsSham组，##代表<0.01，###代表<0.001vs RIRI组。
图4(图4A～图4I)显示了抑制线粒体自噬对藤黄酸的抗肾脏缺血-再灌注损伤作用的影响。其中：图4A显示线粒体自噬激动剂雷帕霉素预处理组的血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平相比RIRI组明显降低，而使用线粒体自噬抑制剂3-MA或Mdivi-1后这两组的Cr和BUN水平相比于GA+RIRI组明显升高。图4B和图4C的HE染色结果显示增强线粒体自噬可以改善缺血-再灌注诱导的肾组织损伤，而抑制线粒体自噬则削弱藤黄酸预处理对缺血-再灌注诱导的肾组织损伤的保护作用。图4D和图4E的TUNEL染色结果显示增强线粒体自噬可以改善缺血-再灌注诱导的肾组织内细胞凋亡，而抑制线粒体自噬则削弱藤黄酸预处理对缺血-再灌注诱导的肾组织内细胞凋亡的保护作用。图4F和图4G的MPO染色结果显示增强线粒体自噬可以减轻缺血-再灌注诱导的肾组织内中性粒细胞浸润，而抑制线粒体自噬则削弱藤黄酸预处理对缺血-再灌注诱导的肾组织内中性粒细胞浸润的抑制作用。图4H和图4I的DHE免疫荧光染色结果表明增强线粒体自噬可以减少缺血-再灌注诱导的肾组织内活性氧累积，而抑制线粒体自噬则削弱藤黄酸预处理对缺血-再灌注诱导的肾组织内活性氧累积的抑制作用。图中，*代表<0.05，**代表<0.01，***代表<0.001。
结合图3和图4的实验数据，说明藤黄酸预处理能显著减轻缺血-再灌注对肾组织内线粒体自噬的抑制作用，而抑制线粒体自噬会明显削弱藤黄酸预处理对肾脏缺血-再灌注损伤的保护效果。
实验例2
藤黄酸对肾小管上皮细胞缺氧损伤的影响
人肾小管上皮细胞系HK-2细胞用含10％胎牛血清的1640培养基培养于含5％CO2的37℃细胞培养箱中，细胞呈贴壁生长。采用氯化钴(CoCl2)处理细胞24h建立体外细胞缺氧损伤模型。
细胞实验一采用如下分组：
Control组：无任何干预；
CoCl2组：给予CoCl2(400μM)刺激24h；
GA+CoCl2组：先给予GA(100nM)预处理细胞4h，再用CoCl2(400μM)刺激24h。
如上处理细胞结束后，收集细胞行流式细胞术检测细胞凋亡情况。上述检测结果参见图5(图5A～图5B)。图5A和5B显示藤黄酸预处理能显著减轻CoCl2模拟缺氧诱导的细胞凋亡。
细胞实验二采用如下分组：
Control组：无任何干预；
CoCl2组：给予CoCl2(400μM)刺激24h；
Rapa+CoCl2组：先给予Rapa(100nM)预处理细胞1h，再用CoCl2(400μM)刺激24h；
GA+CoCl2组：先给予GA(100nM)预处理细胞4h，再用CoCl2(400μM)刺激24h；
3-MA+GA+CoCl2组：3-MA(10mM)预处理细胞1h，再用GA(100nM)预处理细胞4h，再用CoCl2(400μM)刺激24h；
GA+CoCl2+Baf-A1组：先给予GA(100nM)预处理细胞4h，再用CoCl2(400μM)刺激24h，在CoCl2处理结束前4h加入Baf-A1(100nM)；
NC siRNA+GA+CoCl2组：NC siRNA细胞转染24h之后，先给予GA(100nM)预处理细胞4h，再用CoCl2(400μM)刺激24h；
Parkin siRNA+GA+CoCl2组：Parkin siRNA细胞转染24h之后，先给予GA(100nM)预处理细胞4h，再用CoCl2(400μM)刺激24h。
上述用量单位为体积摩尔浓度(即物质的量浓度)，可简写为M，表示mol/L。常见的有nM(nmol/L)、μM(μmol/L)、mM(mmol/L)、M(mol/L)。1000nM＝1μM；1000μM＝1mM；1000mM＝1M。
如上处理细胞结束后，收集细胞行流式细胞术检测细胞凋亡情况。上述检测结果参见图6(图6A～图6D)和图7(图7A～图7B)。图6A～图6D显示线粒体自噬激动剂雷帕霉素(Rapa)预处理能显著减轻CoCl2模拟缺氧诱导的细胞凋亡；而联合使用线粒体自噬抑制剂3-MA或Baf-A1则显著削弱藤黄酸对细胞缺氧损伤的保护作用。图7A～图7B显示抑制Parkin依赖的线粒体自噬会显著削弱藤黄酸对细胞缺氧损伤的保护作用。
结合图5至图7的实验数据，说明藤黄酸通过增强线粒体自噬可显著减轻缺氧诱导的肾小管上皮细胞损伤。
综上所述，借助于本发明的技术方案，结合上述动物及细胞实验数据，说明藤黄酸能够显著减轻肾脏缺血-再灌注损伤，这种保护作用主要是通过增强线粒体自噬来实现，从而能够确定藤黄酸在预防或治疗肾脏缺血-再灌注损伤药物方面的新用途，这种新用途为医学科研人员在临床针对肾脏缺血-再灌注损伤的探索中提供了新的选择方案。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修饰、等同替换、改进等等，均应包含在本发明的保护范围之内。