3-卤代-7-（4-溴苯甲酰基）-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法及应用
阅读说明：本技术 3-卤代-7-（4-溴苯甲酰基）-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法及应用 (Separation and detection method for isomer impurities in 3-halogenated-7- (4-bromobenzoyl) -1-hydro-indole and application thereof ) 是由 路起飞 孔庆兰 郑项元 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法及应用,涉及分析化学技术领域。一种3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法,采用高效液相色谱法,色谱条件包括：采用正相手性色谱柱；以正己烷-异丙醇混合溶液为流动相；等度洗脱；所述异构体杂质为3-卤代-7-(3-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚。本发明的方法经过系统方法学验证,系统适应性好、专属性强、耐用性好、灵敏度高,可用于原料药溴芬酸钠的原料及其异构体杂质的测定和分离,提高了溴芬酸钠滴眼液使用的安全性和有效性。(The invention provides a separation and detection method and application of isomer impurities in 3-halo-7- (4-bromobenzoyl) -1-hydro-indole, and relates to the technical field of analytical chemistry. A separation and detection method of isomer impurities in 3-halo-7- (4-bromobenzoyl) -1-hydro-indole adopts high performance liquid chromatography, and the chromatographic conditions comprise: adopting a normal-phase chiral chromatographic column; taking a n-hexane-isopropanol mixed solution as a mobile phase; isocratic elution; the isomer impurity is 3-halo-7- (3-bromobenzoyl) -1 h-indole. The method is verified by a systematic methodology, has good systematic adaptability, strong specificity, good durability and high sensitivity, can be used for measuring and separating impurities of the raw material of the bulk drug bromfenac sodium and isomers thereof, and improves the safety and effectiveness of the bromfenac sodium eye drops.)
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法及应用。
背景技术
溴芬酸钠，化学名称为2-氨基-3-(4-溴苯甲酰基)苯乙酸钠，是一种非甾体类抗炎药。溴芬酸钠滴眼液于2000年在日本由Senju公司首次推出，用于治疗结膜炎、眼睑炎、强膜炎(包括上强膜炎)和术后炎症等。
目前溴芬酸钠的主流合成方法，以对溴苯甲腈和吲哚啉为原料，用三氯化硼和三氯化铝为催化剂，进行Friedel-crafts酰化，再经活性二氧化锰氧化、NBS或NCS卤化、磷酸水解、氢氧化钠水解成盐制备溴芬酸钠，其合成路线为：
3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚是溴芬酸钠的关键中间体，而3-卤代-7-(3-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚是其异构体杂质，由起始原料对溴苯甲腈中的异构体间溴苯甲腈引入后生成的。
由于该杂质是3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚的位置异构体，两者极性相近，利用普通反相色谱洗脱体系进行检测，难以对两者进行有效的分离。鉴于控制原料药起始物料杂质对于终产物溴芬酸钠的质量至关重要，对其原料的质量控制直接影响到制剂终产品的质量。目前该杂质及其检测方法尚未有文献报道。故本发明对溴芬酸钠原料及其制剂质量有着重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用正相手性色谱柱；以正己烷-异丙醇混合溶液为流动相；等度洗脱；
所述3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚的结构式如下：
所述异构体杂质为3-卤代-7-(3-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚，结构式如下：
其中，X选自Cl或Br。
进一步的，X选自Cl，即所述3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚为3-氯-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚，其异构体杂质为3-氯-7-(3-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚。
进一步的，所述正己烷与异丙醇的体积比为(92-98)：(2-8)。
进一步的，所述正己烷与异丙醇的体积比为(93-97)：(3-7)。
进一步的，所用检测器为紫外检测器，检测波长为215-225nm。
进一步的，所用检测器为紫外检测器，检测波长为218-222nm。
进一步的，所用柱温为25-35℃
进一步的，所用柱温为28-32℃
进一步的，所用流速为0.9-1.1mL/min
进一步的，所用流速为0.95-1.05mL/min
进一步的，所述所述正相手性色谱柱以共价键合多糖衍生物球形硅胶为填充剂。
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用日本大赛璐公司的IA色谱柱；以正己烷-异丙醇混合溶液为流动相，所述正己烷与异丙醇的体积比为(93-97)：(3-7)；所用检测器为紫外检测器，检测波长为218-222nm；所用柱温为28-32℃；所用流速为0.95-1.05mL/min；等度洗脱。
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用日本大赛璐公司的IA色谱柱；以正己烷-异丙醇混合溶液为流动相，所述正己烷与异丙醇的体积比为95：5；所用检测器为紫外检测器，检测波长为220nm；所用柱温为30℃；所用流速为1.0mL/min；等度洗脱。
作为本发明的第二个方面，本发明提供了上述分离检测方法在溴芬酸钠原料或制剂的质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚中异构体杂质的分离检测方法，通过对流动相、色谱柱的优化设计，使3-卤代-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚及其异构体杂质达到有效分离，且分离度良好，不受其他杂质干扰。经过系统方法学验证，系统适应性好、专属性强、耐用性好、灵敏度高，可用于溴芬酸钠的原料中异构体杂质的分离检测，提高了溴芬酸钠滴眼液使用的安全性和有效性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1-1中LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图；
图2为实施例1-1中氯代物对照品溶液的HPLC谱图；
图3为实施例1-1中LD-Z1+氯代物混合溶液的HPLC谱图；
图4为实施例2中检测限溶液的HPLC谱图；
图5为实施例2中定量限溶液的HPLC谱图；
图6为实施例3-1中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图7为实施例3-2中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图8为实施例3-3中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图9为实施例3-4中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图10为实施例3-5中供试品+LD-Z1混合溶液的LD-Z1谱图；
图11为实施例3-6中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图12为实施例3-7中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图13为实施例3-8中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图14为实施例3-9中供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图；
图15为对照实施例1中LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图；
图16为对照实施例1中氯代物对照品溶液的HPLC谱图；
图17为对照实施例2中LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图；
图18为对照实施例2中氯代物对照品溶液的HPLC谱图；
图19为对照实施例3中LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图；
图20为对照实施例3中氯代物对照品溶液的HPLC谱图；
图21为对照实施例4中LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图；
图22为对照实施例4中氯代物对照品溶液的HPLC谱图；
图23为对照实施例5中LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图；
图24为对照实施例5中氯代物对照品溶液的HPLC谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明以氯代物代表3-氯-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚，以LD-Z1代表3-氯-7-(3-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚，以溴代物代表3-溴-7-(4-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚，以LD-Z2代表3-溴-7-(3-溴苯甲酰基)-1氢-吲哚。
LD-Z1对照品、LD-Z2对照品、氯代物对照品和溴代物对照品来自MalladiDrugs&PharmaceuticalsLtd.。
实施例1专属性试验
LD-Z1对照品溶液：精密称取LD-Z1对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.4mg的溶液，作为LD-Z1对照品贮备液。精密量取LD-Z1对照品贮备液0.5mL，置100mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为LD-Z1对照品溶液。
氯代物对照品溶液：精密称取氯代物对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.4mg的溶液，作为氯代物对照品贮备液。精密量取氯代物对照品贮备液1mL，置100mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为氯代物对照品溶液。
LD-Z1+氯代物混合溶液：精密量取LD-Z1对照品贮备液和氯代物对照品贮备液各0.5mL，置100mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为LD-Z1+氯代物混合溶液。
溶样液：以正己烷-异丙醇为溶剂，两者体积比为1：1。
实施例1-1
色谱条件：
色谱柱：IA(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：以正己烷-异丙醇为流动相，两者的体积比为95：5；
检测波长：紫外检测器，检测波长为220nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
等度洗脱。
LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图如图1所示。
由图1可知，LD-Z1的保留时间为21.185min。
氯代物对照品溶液的HPLC谱图如图2所示。
由图2可知，氯代物的保留时间为27.860min。
LD-Z1+氯代物混合溶液的HPLC谱图如图3所示，检测数据如表1所示。
表1 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
由图3和表1可知，LD-Z1与氯代物之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将LD-Z1与氯代物完全分离，且相互之间无干扰。
实施例1-2
色谱条件：
色谱柱：IA(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：以正己烷-异丙醇为流动相，两者的体积比为98：2；
检测波长：紫外检测器，检测波长为215nm；
流速：1.1mL/min；
柱温：35℃；
进样量：20μL；
等度洗脱。
LD-Z1+氯代物混合溶液检测数据如表2所示。
表2 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
由表2可知，LD-Z1与氯代物之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将LD-Z1与氯代物完全分离，且相互之间无干扰。
实施例1-3
色谱条件：
色谱柱：IA(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：以正己烷-异丙醇为流动相，两者的体积比为92：8；
检测波长：紫外检测器，检测波长为225nm；
流速：0.9mL/min；
柱温：25℃；
进样量：20μL；
等度洗脱。
LD-Z1+氯代物混合溶液检测数据如表3所示。
表3 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
由表3可知，LD-Z1与氯代物之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将LD-Z1与氯代物完全分离，且相互之间无干扰。
实施例1-4
色谱条件：
色谱柱：IA(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：以正己烷-异丙醇为流动相，两者的体积比为93：7；
检测波长：紫外检测器，检测波长为222nm；
流速：1.05mL/min；
柱温：32℃；
进样量：20μL；
等度洗脱。
LD-Z1+氯代物混合溶液检测数据如表4所示。
表4 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
由表4可知，LD-Z1与氯代物之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将LD-Z1与氯代物完全分离，且相互之间无干扰。
实施例1-5
色谱条件：
色谱柱：IA(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：以正己烷-异丙醇为流动相，两者的体积比为97：3；
检测波长：紫外检测器，检测波长为218nm；
流速：0.95mL/min；
柱温：28℃；
进样量：20μL；
等度洗脱。
LD-Z1+氯代物混合溶液检测数据如表5所示。
表5 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
由表5可知，LD-Z1与氯代物之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将LD-Z1与氯代物完全分离，且相互之间无干扰。
实施例2灵敏度试验
LD-Z1杂质对照品贮备液：精密称取LD-Z1杂质对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.4mg的溶液，作为LD-Z1杂质对照品贮备液。
氯代物对照品贮备液：精密称取氯代物对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.4mg的溶液，作为氯代物对照品贮备液。
LD-Z1+氯代物混合贮备液：精密量取LD-Z1对照品贮备液和氯代物对照品贮备液各1mL，置100mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为LD-Z1+氯代物混合贮备液。
定量限溶液:精密量取LD-Z1+氯代物混合贮备液0.5mL，置20mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。
检测限溶液:精密量取LD-Z1+氯代物混合贮备液1.6mL，置200mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。
溶样液：以正己烷-异丙醇为溶剂，两者体积比为1：1。
色谱条件：
色谱柱：IA(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：以正己烷-异丙醇为流动相，两者的体积比为95：5；
检测波长：紫外检测器，检测波长为220nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
等度洗脱。
检测限溶液的HPLC谱图如图4所示，检测数据如表6所示。
表6检测限溶液检测结果
由图4和表6可知，当LD-Z1的浓度为0.0316μg/mL时，相当于供试品浓度的0.008％，信噪比大于3，当氯代物的浓度为0.0301μg/mL时，相当于供试品浓度的0.008％，信噪比大于3，符合检测限要求。
定量限溶液的HPLC谱图如图5所示，检测数据如表7所示。
表7定量限溶液检测结果
由图5和表7可知，当LD-Z1的浓度为0.1054μg/mL时，相当于供试品浓度的0.025％，信噪比大于10，当氯代物的浓度为0.1005μg/mL时，相当于供试品浓度的0.025％，信噪比大于10，符合定量限要求。
实施例3耐用性试验
LD-Z1对照品贮备液：精密称取LD-Z1杂质对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.4mg的溶液，作为LD-Z1对照品贮备液。
氯代物对照品贮备液：精密称取氯代物对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.4mg的溶液，作为氯代物对照品贮备液。
LD-Z1+氯代物混合溶液：精密量取LD-Z1对照品贮备液和氯代物对照品贮备液各1mL，置100mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为LD-Z1+氯代物混合溶液。
供试品+LD-Z1混合溶液：精密称取氯代物10mg，置25mL量瓶中，用溶样液超声溶解，加2.5mLLD-Z1对照品溶液，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为供试品+LD-Z1混合溶液。
溶样液：以正己烷-异丙醇为溶剂，两者体积比为1：1。
色谱条件：
色谱柱：IA(4.6mm×250mm，5μm)；
检测波长、柱温、流速和流动相比例条件如下：
进样量：20μL；
等度洗脱。
实施例3-1
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表8所示。
表8 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图6所示，检测数据如表9所示。
表9供试品+LD-Z1混合溶液检测结果
实施例3-2
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表10所示。
表10 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图7所示，检测数据如表11所示。
表11供试品+LD-Z1混合溶液的检测结果
实施例3-3
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表12所示。
表12 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图8所示，检测数据如表13所示。
表13供试品+LD-Z1混合溶液的检测结果
实施例3-4
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表14所示。
表14 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图9所示，检测数据如表15所示。
表15供试品+LD-Z1混合溶液检测结果
实施例3-5
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表16所示。
表16 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图10所示，检测数据如表17所示。
表17供试品+LD-Z1混合溶液检测结果
实施例3-6
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表18所示。
表18 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图11所示，检测数据如表19所示。
表19供试品+LD-Z1混合溶液检测结果
实施例3-7
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表20所示。
表20 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图12所示，检测数据如表21所示。
表21供试品+LD-Z1混合溶液检测结果
实施例3-8
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表22所示。
表22 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图13所示，检测数据如表23所示。
表23供试品+LD-Z1混合溶液检测结果
实施例3-9
LD-Z1+氯代物混合溶液的检测数据如表24所示。
表24 LD-Z1+氯代物混合溶液检测结果
供试品+LD-Z1混合溶液的HPLC谱图如图14所示，检测数据如表25所示。
表25供试品+LD-Z1混合溶液检测结果
由图6-14，表8-25可知，在检测波长、柱温、流速流动相比例稍作改变时，LD-Z1都能够很好地检出，说明在本发明的色谱条件下的检测方法耐用性良好。
对照实施例1
LD-Z1对照品溶液：精密称取LD-Z1对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.5mg的溶液，作为LD-Z1对照品贮备液。精密量取LD-Z1对照品贮备液1mL，置10mL量瓶中，用溶样液稀释至刻度，摇匀，作为LD-Z1对照品溶液。
氯代物对照品溶液：精密称取氯代物对照品适量，加溶样液溶解并稀释制成每1mL含0.5mg的溶液，作为氯代物对照品溶液。
溶样液：乙腈。
色谱条件：
色谱柱：Agela XBP C18(L)(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：流动相为甲醇-水，两者的体积比为70：30；
检测波长：紫外检测器，检测波长为220nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：20μL；
等度洗脱。
LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图如图15，氯代物对照品溶液的HPLC谱图如图16所示。
由图15可知，LD-Z1保留时间为38.114min；由图16可知，氯代物的保留时间为37.997min，两者保留时间重合，不能分离。
对照实施例2
本对照实施例的色谱条件与对照实施例1的不同之处在于，流动相：流动相为甲醇-水，两者的体积比为80：20；其他条件均相同。
LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图如图17，氯代物对照品溶液的HPLC谱图如图18所示。
由图17可知，LD-Z1保留时间为13.604min；由图18可知，氯代物的保留时间为13.487min，两者保留时间重合，不能分离。
对照实施例3
本对照实施例的色谱条件与对照实施例1的不同之处在于，色谱柱：AgilentPursuit 5 PFP(4.6mm×250mm，5μm)；其他条件均相同。
LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图如图19，氯代物对照品溶液的HPLC谱图如图20所示。
由图19可知，LD-Z1保留时间为27.184min；由图20可知，氯代物的保留时间为27.961min，两者保留时间重合，不能分离。
对照实施例4
本对照实施例的色谱条件与对照实施例1的不同之处在于，流动相：流动相为乙腈-水，两者的体积比为75：25；其他条件均相同。
LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图如图21，氯代物对照品溶液的HPLC谱图如图22所示。
由图21可知，LD-Z1保留时间为10.829min；由图22可知，氯代物的保留时间为10.955min，两者保留时间重合，不能分离。
对照实施例5
本对照实施例的色谱条件与对照实施例1的不同之处在于，流动相：流动相为乙腈-水，两者的体积比为60：40；其他条件均相同。
LD-Z1对照品溶液的HPLC谱图如图23，氯代物对照品溶液的HPLC谱图如图24所示。
由图23可知，LD-Z1保留时间为29.663min；由图24可知，氯代物的保留时间为30.306min，两者保留时间重合，不能分离。
本发明对溴代物中LD-Z2的分离效果与氯代物中LD-Z1的分离效果相似，在此不再赘述。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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