具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了心力衰竭的新的生物标志物。具体地，本发明发现了一种生物标志物集合，所述的集合包括一种或多种心力衰竭的生物标志物，可以用于评估待测对象的心力衰竭的诊断、预后评估及相关疾病风险预测，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，术语“液-质联用”为高效液相-质谱联用的简称，即“液-质联用”与“高效液相-质谱联用”可互换使用。

以乙酰左旋肉碱、左旋肉碱、氧化三甲胺为例，进行描述。

如本文所用，术语“乙酰左旋肉碱”简称ALC，即“乙酰左旋肉碱”与“ALC”可互换使用。

如本文所用，术语“左旋肉碱”简称肉碱，即“左旋肉碱”与肉碱可互换使用。

如本文所用，术语“氧化三甲胺”简称TMAO，即“氧化三甲胺”与“TMAO”可互换使用。

如本文所用，术语“超高效液相色谱”简称UPLC，即“超高效液相色谱”与“UPLC”可互换使用。

如本文所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)化合物可通过任何合适的方式电离并检测“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。

术语“大约”如本文所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％。

根据本发明，术语“生物标志物集合”是指一种生物标志物、或两种及两种以上生物标志物的组合。

根据本发明，生物标志物质的含量通过质谱信号面积归一化值指示。

根据本发明，参考集指训练集。

根据本发明，由现有技术可知，训练集和验证集具有相同的含义。在本发明的一个实施方式中，训练集指心力衰竭患者和健康对照生物样品中的生物标志物含量的集。在本发明的一个实施方式中，验证集是指用于测试训练集性能的数据集。在本发明的一个实施方式中，生物标志物的含量可以根据测定的方法代表为绝对值或相对值。例如，当用质谱来测定生物标记物的水平(比如含量)时，峰的强度或面积可以代表生物标记物的水平，这是一个相对值的水平；当用PCR来测定生物标志物的水平时，基因的拷贝数或基因片段的拷贝数可以代表的生物标志物的水平。

在本发明的一个实施方式中，参照值是指健康对照的参考值或正常值。本领域的技术人员清楚，在样品数量足够多情况下，每个生物标志物的正常值(绝对值)的范围可以通过检验和计算方法得到。因此，当利用除质谱以外的其他方法来检测生物标志物的水平时，这些生物标记物水平的绝对值，可以直接与正常值比较，从而评价患有心力衰竭诊断或早期诊断心力衰竭。在本发明中，还可以使用统计方法。

根据本发明，术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG标记)等。生物标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。

根据本发明，术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。

根据本发明，术语“血浆”指的是全血的液体成分。根据所使用的分离方法，血浆可能完全不含细胞成分，也可能含有不同量的血小板和/或少量其它细胞成分。

根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。

需要说明的是，在此提供术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。

检测方法

根据本发明，质谱(MS)可以分为离子阱质谱、四极杆质谱、轨道阱质谱和飞行时间质谱，偏差分别为0.2amu、0.4amu、3ppm和5ppm。在本发明中，利用串联四级杆质谱获得MS数据。

试剂盒

在本发明中，本发明的试剂盒包括本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合。

在另一优选例中，本发明第一方面所述的集合中各个生物标记物用作标准品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述的说明书记载了来源于心力衰竭患者和/或健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平(如含量)的参考数据集。

ROC-AUC

ROC-AUC是一种评价模型准确性的方法，ROC曲线为受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve)，以假阳性概率(False positive rate)为横轴，真阳性(True positive rate)为纵轴所组成的坐标图，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标。AUC为ROC曲线下方面积(Area under the curve)。ROC-AUC值在1.0和0.5之间，越接近于1，说明诊断效果越好，在0.5～0.7时有较低准确性，在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次公开了一组用于心力衰竭诊断的“肠心轴”上的肠道微生物代谢标志物，包括乙酰左旋肉碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱及TMAO中的一种或多种。其中，乙酰左旋肉碱首次应用于心力衰竭诊断中。经验证，本发明提供的“肠心轴”上的肠道微生物代谢标志物中乙酰左旋肉碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱及TMAO在用于诊断区分心力衰竭患者与健康人群时，AUC均在0.8以上(ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性)。其中,乙酰左旋肉碱诊断区分心力衰竭患者与健康人群的效果最好，乙酰左旋肉碱与γ-丁基甜菜碱、乙酰左旋肉碱与左旋肉碱、乙酰左旋肉碱与氧化三甲胺中任何一个指标两两联合应用时，AUC比单个指标更接近于1，诊断效果更好；乙酰左旋肉碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱三个指标联合应用时，AUC比单个指标和两个指标联合应用更接近于1，诊断区分效果最好。

(b)本发明的检测方法操作简单，分析时间短(联检仅需5分钟)、检测结果准确，且结果重现率高(CV＜10％)。

(c)本发明提供的试剂盒可以用于心力衰竭诊断，提高诊断便利性，促进诊断方法标准化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

如无特别说明，本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。

实施例1检测方法及具体实验过程

1、标本来源

在取得患者同意后，收集了30例心力衰竭患者(左心室射血分数<35％、BNP>400ng/L，纽约心脏协会的功能鉴定为II至IV)的血浆样本，30例健康人的年龄、性别与心力衰竭患者相匹配，采血时间均为清晨空腹状态。

2、主要仪器与设备：

岛津LC-MS 8050；LabSolutions Insight软件。

3、试剂与材料：

乙酰左旋肉碱、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺标准品；乙酰左旋肉碱-D3、γ-丁基甜菜碱-D9、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、氧化三甲胺-D9、甲醇、乙腈、乙醇、甲酸、氨水、碳吸附人血浆皆为市售试剂。

4、液相色谱和质谱分析条件：

色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC(1.7μM，2.1×100mm)；

保护预柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC VanGuard pre-column(1.7μM，2.1×5mm)；

流动相A：0.1％(v/v)甲酸(A)+0.025％(v/v)氨水(B)的水溶液；流动相B：0.1％(v/v)甲酸(A)的乙腈溶液；以流动相B的总体积计；流速0.6mL/min：柱温45℃：进样室温度：8℃；进样量1μL；洗针液：50％甲醇水。

流动相梯度方法：

质谱条件：

采用电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM模式检测；

雾化气流量3L/min，加热气流量10L/min；干燥气流量10L/min；接口温度：300℃；DL温度：300℃；加热块温度：400℃；

5、实验过程：

5-1溶液配制

5-1-1混合标准曲线溶液配制：

精密称取乙酰左旋肉碱、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解后分别配制成浓度为5mmol/L的标准品储备液。再用50％甲醇水溶液将浓度为5mmol/L的标准品储备液依次稀释为以下标准曲线工作溶液。

混合标准品溶液，所述的乙酰左旋肉碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、三甲基赖氨酸这四种物质标准曲线的浓度为0.05、0.25、1、2.5、5、10、25μmol/L；所述的甜菜碱、氯化胆碱、左旋肉碱、氧化三甲胺这四种物质标准曲线的浓度为0.1、0.5、2、5、10、20、50μmol/L；以上混标溶液的配制基质为50％甲醇水溶液。

5-1-2混合内标溶液配制：

精密称取乙酰左旋肉碱-D3、γ-丁基甜菜碱-D9、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、氧化三甲胺-D9适量，用甲醇溶解得到1mmol/L混合内标储存溶液，再用甲醇稀释到10μmol/L的混合内标工作溶液。

5-1-3提取溶剂

所述的提取溶剂的成分为乙腈和乙酸，且乙酸的体积比为2.0％。

5-2质控品I和质控品II的配制：

取适量Seralab碳吸附空白人血浆，加入少量混合标准品的浓度最高点溶液，分别配制质控I和质控II。

5-3血浆样本的前处理及进样分析：

分别将混合标准品工作液和待测血浆样本各25μL加入到96孔板的不同孔中，然后向每个孔中依次加入20μL的混合内标，再加入400μL乙酸乙腈溶液(乙酸浓度为2％)，涡旋1min，4000rpm离心5min，取上清液120μL，分别进样1μL到液质联用仪，测定分析待测血浆样本中肠道菌群代谢物各代谢物的含量(单位为μM)。其中，以上化合物的标准回归曲线如图1-图8所示。

如图1-图8所示，以上化合物的标准回归曲线线性很好，R2＞0.99，符合性能要求。

5-4结果

如以下表1所示，根据ROC曲线法自动导出的灵敏度和特异性数据，当固定所有指标的特异性为96.7％时(即健康人样本中只有一例为阳性时),从ROC曲线中得到的AUC面积及阈值如表1所示。表1中大于该阈值的为定义为+，小于该阈值的定义为-。

表1各指标的AUC及阈值

实施例2构建ROC曲线,比较以上肠道菌群代谢物单个或联合对诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力

采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，通过30例心力衰竭样本与30例健康人群血浆样本中乙酰左旋肉碱、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸、氧化三甲胺的表达水平判断其用于诊断心力衰竭的能力。根据ROC曲线法自动导出的灵敏度和特异性数据，当固定所有指标的特异性为96.7％时(即健康人样本中只有一例为阳性时),从ROC曲线中得到的灵敏度、AUC及阈值如表2所示。

表2单个差异代谢物诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力

从表2可以看出，从“肠心轴”上的肠道菌群代谢物中乙酰左旋肉碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱和TMAO在单个用于诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力较强，AUC均在0.8以上。氯化胆碱、巴豆甜菜碱、甜菜碱、三甲基赖氨酸在单个用于诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力较弱，AUC均在0.7以下(ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性)。

乙酰左旋肉碱首次应用于诊断区分心力衰竭患者和健康人群中，在以上四个差异性指标中诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力最强，AUC为0.98，灵敏度为86.7％、特异性为96.7％。TMAO作为心血管疾病风险预测比较成熟的指标，诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力反而其次，AUC为0.902，灵敏度为80％、特异性为96.7％。γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力次之，AUC分别为0.884、0.842，灵敏度分别为53.3％、60％、特异性均为96.7％。

此外，进一步验证了乙酰左旋肉碱是否与γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺这三个指标的联合检测作用，结果如表3和表4所示。

表3两个差异代谢物联合诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力

表4三个差异代谢物联合诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力

如表3所示，当乙酰左旋肉碱与γ-丁基甜菜碱联合应用时，可明显提升诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力，AUC为0.99，诊断区分效果很好；在特异性均为96.7％的情况下，灵敏度分别由单检时的86.7％、53.3％提升到联检时的93.3％。当乙酰左旋肉碱与左旋肉碱联合应用时，也可明显提升诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力，AUC为0.99，诊断区分效果很好；在特异性均为96.7％的情况下，灵敏度分别由单检时的86.7％、60％提升到联检时的93.3％。当乙酰左旋肉碱和氧化三甲胺联合应用时，也可明显提升诊断区分心力衰竭患者和健康人群的能力，AUC为0.99；灵敏度分别由单检时的86.7％、80％提升到联检时的96.7％，特异性由96.7％降为93.3％。

如表4所示，当乙酰左旋肉碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱三指标联合应用时，AUC比任意两个联合应用更接近于1，AUC为0.991，诊断区分效果更好；在特异性均为96.7％的情况下，灵敏度分别由单检时的86.7％、53.3％、60％提升到联检时的96.7％。其中，指标联检ROC曲线模型图参考图9。

实施例3心力衰竭样本中筛选出的指标在心肌梗塞样本中的验证

1、标本来源

在取得患者同意后，收集了20例心肌梗塞患者(肌钙蛋白＞500pg/mL)的血浆样本，30例健康人的年龄、性别与心肌梗塞患者相匹配，采血时间均为清晨空腹状态。

2、使用实施例1中的实验方法对20例心肌梗塞患者和30例健康人的血浆进行前处理及LC-MS/MS上机检测，再构建ROC曲线进一步验证心力衰竭样本中筛选出的单个或指标组合在心肌梗塞样本中的灵敏度、特异性。根据ROC曲线法自动导出的灵敏度和特异性数据，当固定心肌梗塞中所有联检指标的特异性与心力衰竭中所有联检指标的特异性一致时(均为96.7％),从ROC曲线中得到的灵敏度如表5、表6所示。

表5心衰中单个或两个联合差异代谢物在区分心肌梗塞患者和健康人群的验证

表6心衰中三个差异代谢物的联合在区分心肌梗塞患者和健康人群的验证

如表5所示，在心力衰竭样本中筛选出的乙酰左旋肉碱单个指标在特异性为96.7％的条件下，灵敏度在心力衰竭样本中达到86.7％，在心肌梗塞样本中仅为25％，说明乙酰左旋肉碱能很好地区分诊断心力衰竭样本和健康样本，心肌梗塞样本对乙酰左旋肉碱无干扰。

进一步地，在心力衰竭样本中筛选出的乙酰左旋肉碱与γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺中的任何一个指标联检时(特异性一样)，灵敏度在心力衰竭样本中分别达到93.3％、93.3％、96.7％，在心肌梗塞样本中仅为25％、30％、40％。说明乙酰左旋肉碱与γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺中的任何一个指标联检时都能很好地区分诊断心力衰竭样本和健康样本，心肌梗塞样本对以上两指标组合无干扰。

更进一步地，如表6所示，在心力衰竭样本中筛选出的乙酰左旋肉碱与γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱三种指标联检时(特异性一样)，灵敏度在心力衰竭样本中达到96.7％，在心肌梗塞样本中仅为25％。说明乙酰左旋肉碱与γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱三种指标联检时可很好地区分诊断心力衰竭样本和健康样本，心肌梗塞样本对该三指标的组合无干扰。

实施例4：检测试剂盒的制备

基于本发明提供的代谢标志物制备了检测试剂盒，该试剂盒包括如下成分：质控品、同位素内标提取液、提取溶剂、流动相添加剂A、流动相添加剂B。优选地，所述检测试剂盒还包括对照品、96孔反应板、96孔过滤板、说明书等。本发明的试剂盒可用于检测乙酰左旋肉碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱及TMAO这四种肠道菌群代谢物的含量。

具体地，在本发明的试剂盒中，对照品和/或质控品含有乙酰左旋肉碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱及TMAO，同位素内标提取液中含有乙酰左旋肉碱-D3、γ-丁基甜菜碱-D9、左旋肉碱-D9、TMAO-D9，浓度均为5μM，提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸，体积比(v/v)为2.0％，流动相添加剂A为甲酸，流动相添加剂B为氨水。本试剂盒保存于2～8℃。

当然，设计检测试剂盒时，并不需要完全包含上述4个代谢标志物的标准品，可以仅使用其中几个进行组合。这些标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。该试剂盒是基于本发明提供的代谢标志物而设计的，可以用于诊断区分心力衰竭患者和健康人群。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。