用于评估猪肉肌内脂肪含量的生物标志物及其应用
阅读说明：本技术 用于评估猪肉肌内脂肪含量的生物标志物及其应用 (Biomarker for evaluating intramuscular fat content of pork and application thereof ) 是由 马云龙 詹慧雯 赵书红 李新云 谢胜松 付亮亮 赵云霞 舒航 张凯丽 彭夏 于 2020-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了生物标志物在评估猪肉肌内脂肪含量中的应用,利用代谢组学分析挖掘出一组有效的生物标志物,包括8种甘油三酯类物质TG(18:1/18:4/18:4)、TG(14:0/20:1/22:1)、TG(18:1/18:1/20:0)、TG(12:0/16:0/18:3)、TG(18:0/20:1/20:1)、TG(16:0/16:1/20:1)、TG(18:1/18:1/22:0)、TG(18:1/18:3/18:3)。通过生物标志物对猪肉的肌内脂肪含量进行简便、快速的评估,可辅助开展猪肉品质分类,解决肉质性状难于度量的问题,进而推动肉质性状遗传评估工作的开展。(The invention discloses application of biomarkers in evaluating intramuscular fat content of pork, and a group of effective biomarkers comprising 8 triglyceride substances TG (18:1/18:4/18:4), TG (14:0/20:1/22:1), TG (18:1/18:1/20:0), TG (12:0/16:0/18:3), TG (18:0/20:1/20:1), TG (16:0/16:1/20:1), TG (18:1/18:1/22:0) and TG (18:1/18:3/18:3) are excavated by utilizing metabonomic analysis. The intramuscular fat content of the pork is simply and quickly evaluated through the biomarker, the pork quality classification can be assisted to be developed, the problem that the meat quality is difficult to measure is solved, and the development of the meat quality genetic evaluation work is further promoted.)
技术领域
本发明属于猪肉质性状分子标志物鉴定技术领域，具体涉及用于评估猪肉肌内脂肪含量的生物标志物及其在评估猪肉品质中的应用。
背景技术
猪肉是人们日常生活中重要的动物性食品，我国是目前猪肉消费量最大的国家，生猪产量以及猪肉进口量都排在全球前列。随着人们生活水平与消费水平的不断提高，猪肉品质也逐渐受到关注。不仅包括基本的安全卫生问题，需要符合绿色食品标准外，对于肉质的口感、鲜嫩程度也有了更高的要求，而如何提高猪肉品质也成为了从养殖到屠宰加工的整条产业链的重要研究方向。
肉质是一个综合性状，对于猪肉品质的评定常用的检测指标包括PH、肉色、肌肉脂肪含量、滴水损失、大理石纹、嫩度、风味物质等。其中肌内脂肪含量(IMF)是影响猪肉品质的关键因素，肌内脂肪也是肉质细嫩多汁而味美的物质基础。目前许多养猪发达国家也已经把肌内脂肪含量列为新世纪猪育种工作中的重要选择性状。肌内脂肪是指沉积在肌肉内的脂肪，由肌内脂肪组织和肌纤维中的脂肪组成，主要存在于肌外膜、肌束膜和肌内膜上。猪的肌内脂肪作为猪肉品质的重要指标，对于肉品的嫩度、系水力、剪切力、风味和多汁性都有着显著的影响。因而通过改变肌内脂肪含量来改善猪肉品质是一条有效的途径。
猪肉肌内脂肪含量在2-3％之间是一个较为理想的标准，当肌内脂肪含量低于2％时，猪肉的质地和口感都很差；而当其含量高于3％时，肉的风味不再有显著提高。目前大多数商品猪的肌肉脂肪含量都低于理想标准，因此加强肌内脂肪的调控越来越受到重视。
而如何快速准确地测定猪肉的肌内脂肪含量则成为亟需解决的问题。目前测定肌内脂肪含量的主要方法是索氏抽提法，不仅步骤复杂，检测耗时长，同时实验条件苛刻，在测定过程中也极易出错。作为难于度量的性状，肉质性状在种猪遗传评估中往往很难开展。而高效的猪肌内脂肪含量评估方法能够在准确评估猪肉品质，避免测定误差，缩短检测耗时的基础上，极大地降低了育种评估的成本，解决性状难于度量的难题，进而提高个体选择的准确性，为养猪业的实际育种工作与猪肉产业链提供有效的技术支持和决策指导。因此，利用代谢组分析挖掘高效的生物标记物来快速准确评估猪肌内脂肪含量性能具有重要的理论意义与经济价值。
发明内容
本发明利用代谢组学技术，基于UPLC-MS/MS检测平台、自建数据库以及多元统计分析等手段，分离鉴定猪背最长肌肌肉组织中的代谢物，分析肌内脂肪含量的代谢物差异，寻找与肌内脂肪性状相关的重要特征及特异生物标志物，从而实现对猪肌内脂肪含量高效准确的评估，为实际育种工作与决策提供有力的技术支持。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明采用以下方法筛选肌内脂肪含量组织样本与低肌内脂肪含量组织样本间差异代谢物：
(1)利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对肌肉组织总代谢物进行分离与定性定量；
(2)对液相色谱串联质谱进行定性定量后的代谢物采用偏最小二乘法(PLS-DA)，同时结合正交信号校正(OSC)进行判别分析，根据代谢物图谱(metabolite profile)去除不相关差异，筛选差异代谢物；
(3)利用正交偏最小二乘法(OPLS-DA)判别分析获得的代谢物，选择变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值大于或等于1的代谢物，同时结合单变量分析中，选择差异倍数值(fold change)大于等于2，或小于等于0.5的代谢物，作为代谢物生物标记候选物；
(4)通过正交偏最小二乘判别分析的负荷值来确认差异代谢物生物标记候选物差异表达的上调或下调类型；
(5)利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对差异代谢物的代谢途径及各步反应进行注释，并通过通路富集分析，最终确定用于猪肌内脂肪含量评估的8种生物标志物。
通过使用LC-MS/MS分析高、低不同水平肌内脂肪含量个体的肌肉组织中的代谢物，已经检测到446种代谢物；进一步地，通过正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)及变量重要性投影(VIP)的值、选择差异倍数值(fold change)等，筛选出171种有效的代谢物生物标记；最后通过差异倍数的Log 2FC处理、ROC曲线与KEGG通路富集分析，最终确定8种甘油三酯类生物标志物用于猪肌内脂肪含量评估，包括：TG(18:1/18:4/18:4)，TG(14:0/20:1/22:1)，TG(18:1/18:1/20:0)，TG(12:0/16:0/18:3)，TG(18:0/20:1/20:1)，TG(16:0/16:1/20:1)，TG(18:1/18:1/22:0)，TG(18:1/18:3/18:3)。
利用上述生物标志物用于评估猪肉肌内脂肪含量的方法：
利用液相色谱串联质谱对肌肉组织中的生物标志物进行定量检测，根据生物标志物含量高低进行排序与高低水平分组，生物标志物含量高的样品则肌内脂肪含量高。
进一步，选取一种或多种生物标志物进行定量分析，对标志物或标志物组合的均值进行排序与高低水平分组，利用单变量或多变量分析方法对分组结果进行检验，生物标志物含量高的样品则肌内脂肪含量高。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明利用代谢组学分析筛选出用于评估猪肉肌内脂肪含量性能的生物标志物群组，通过筛选出的生物标志物能够对猪的肌肉组织进行高效准确的检测，有助于优化提高猪肉产品分级分类流程，并且通过解决种猪肉质性状难于度量的问题，进而推动育种场对猪肉质性状进行育种价值评估，同时避免胴体测量导致的损失，极大地降低了育种评估的成本。
高效的生物标记检测能够快速评估猪肉肌内脂肪含量性能，提高个体选择的准确性，也为提高市场上猪肉品质检测的效率提供了有效方案，为养猪业的实际育种工作与猪肉产业链提供有效的技术支持和决策指导，具有重要的生产与经济效益。
附图说明
图1为高脂肪含量肌肉组与低脂肪含量肌肉组OPLS-DA得分图；
图2为高脂肪含量肌肉组与低脂肪含量肌肉组OPLS-DA s-plot图；
图3为使用不同代谢物指标评定肌内脂肪含量水平的受试者工作特征曲线。
具体实施方式
实施例1筛选高、低脂肪含量肌肉组织样本间的差异代谢物
一、样本的索氏抽提
1、将猪背最长肌肌肉样品至于60℃烘箱解冻18-24小时，切除筋膜后利用绞肉机搅碎，并放置于平皿中进行称重，平皿重量为m1，平皿和肉糜总重量为m2。将烘箱温度调整为100℃，烘烤2小时，2小时后每一小时进行一次翻样，继续烘干至恒重状态。
2、对烘干至恒重的样品进行打粉、过筛、装包，通过依序执行以下过程完成：从烘箱中取出样品，放入干燥器中冷却30分钟，取出样品后再次进行称重，记录平皿和肉糜的恒重m3，放入粉碎机中粉碎过筛，将样品粉末装入三个滤纸包中，并进行称重，每个滤纸包重量为m4。将烘箱温度调整为100℃，所有样品再次烘烤5.5小时。
3、进行索氏抽提，通过依序执行以下过程完成：从烘箱中取出样品冷却30分钟，对滤纸包进行称重，记录滤纸包恒重m5。将乙醚倒入索氏抽提器中，同时将滤纸包放入索氏抽提器中，65℃过夜浸提12小时。
4、从索氏抽提器中取出样品，在通风橱挥发15分钟后，将样品放入烘箱100℃烘烤2.5小时，取出后冷却30分钟，并进行称重，记录抽提后的滤纸包恒重m6。
5、基于上述步骤，该方法计算的样品的肌内脂肪含量为三个滤纸包重复的平均值：
二、样本的代谢组前处理
取-80℃储存的肌肉组织样(共10头，每头样本取50mg组织样)，放入液氮中2分钟，取出后置于冰上解冻5分钟，涡旋混匀。重复上述步骤三次；于12000r/min，4℃条件下离心10分钟。取上清液300μL加入到对应已编号的离心管中，加入1mL的脂质提取液(包含甲醇及甲基叔丁基醚)。涡旋2分钟，超声5分钟，加入500uL水。涡旋1分钟，于12000r/min，4℃条件下离心10分钟。离心结束后吸取上清液500μL至已编号的离心管中，进行浓缩。使用100μL流动相B乙腈(0.04％的乙酸)复溶，用于LC-MS/MS分析。
三、代谢组LC-MS/MS分析
使用数据采集仪器系统，包括超高效液相色谱(UPLC)及串联质谱(MS/MS)实现代谢物的分离与鉴定。
设定液相条件：1)色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm*100mm；2)流动相：A相为超纯水(0.04％的乙醇)，B相为乙腈(0.04％的乙酸)；3)洗脱梯度：0min水/乙腈(95:5V/V)，11.0min为5:95V/V，12.0min为5:95V/V，12.1min为95:5V/V，14.0min为95:5V/V；4)流速0.4ml/min，柱温40℃，进样量5μl。
设定质谱条件：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)，设置温度550℃，质谱电压5000V(positive)，-4500V(negative)，离子源气体I(GS I)55psi，气体II(GS II)60psi，气帘气(curtain gas,CUR)25psi，碰撞诱导电离(collision-activateddissociation，CAD)，参数设置为高。在三重四级杆(Qtrap)中，每个离子对根据优化的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)进行扫描检测。
四、代谢组检测数据预处理
基于自建靶向标品数据库MWDB(metware database)，根据检测物质的保留时间RT(Retention time)、子母离子对信息及二级谱数据对代谢物进行定性分析；利用三重四级杆质谱的多反应检测模式(multiple reaction monitoring，MRM)对代谢物进行定量分析，获取不同样本的液质下机数据；
通过依序执行以下过程将样本检测结果转换成可计算的统计学数值：
1.色谱峰的提取：利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，对所有代谢物的提取
离子色谱峰分别进行峰下面积积分；
2.色谱峰的校正：使用软件MultiQuant处理样本下机质谱文件，对其中同一代谢物在不同标本中的色谱峰进行积分校正。
3.样本质控分析：检测样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析过程中，每10个检测分析样本中插入1个质控样本，以检测分析过程的重复性。保证仪器的高稳定性以保障数据的重复性和可靠性。
五、多元变量统计分析
采用偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)有监督模式识别的多元统计分析方法对高肌内脂肪含量与低肌内脂肪含量的两组样本进行模型分析，PLS-DA可以使区间组分最大化，有利于寻找差异代谢物。正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)结合了正交信号校正(OSC)，能够将X矩阵信息分解成Y相关与不相关的两类信息，去除与模型分类不相关的差异信息即正交信号，来筛选差异变量。OPLS-DA得分图如图1所示，过滤掉与分类不相关的噪音信号后，两组样本完全分为两个聚类，分别处于第1主成分(T[1])的正负两侧，即不同水平肌内脂肪含量的两组样本之间具有显著的代谢差异，能够很好地实现代谢谱分离。本模型对数据进行了200次随机排列组合实验，n＝200，评估OPLS-DA模型的参数：R2Y＝0.999，Q2＝0.826，模型解释率(R2Y)和模型预测率(Q2)均接近于1，说明OPLS-DA模型拟合准确性高，能够很好地解释不同水平肌内脂肪含量样本之间的差异。
六、差异代谢物筛选
利用正交偏最小二乘法判别分析获得的代谢物，由于过滤了与分类无关的正交信号，获得的差异性代谢物更加可靠。选择变量投影重要性(variable importance inprojection,VIP)值大于或等于1的代谢物，作为差异代谢物候选标记，由VIP结果绘制的OPLS-DA s-plot图，如图2所示。基于以上找到的差异代谢物，本发明同时结合单变量分析，进一步从中筛选出其中更具代表性且灵敏度更高的有效生物标志物，在保证检测准确性的基础上，更进一步地简化检测程序。选择差异倍数值(fold change)大于等于2，或小于等于0.5的代谢物，总共找到171种差异代谢物候选标记，同时为了精简差异代谢物数目，比较各差异代谢物在高、低肌内脂肪水平两组样本中的差异倍数变化，以Log2为底，将计算结果进行排序，选择|Log 2FC|大于2.2的差异代谢物，共计30种物质，作为生物候选标记，基于本地代谢数据库，检测代谢物的保留时间和离子流强度，差异性代谢物检测结果如表1所示。
表1.高脂肪含量肌肉组与低脂肪含量肌肉组间的差异性代谢物
七、ROC曲线分析及生物标志物质的鉴定检验
在以上方案的基础上，针对筛选到的30种差异性代谢物候选标记，进一步筛选出能够有效评估猪肉肌内脂肪含量的生物标志物，以在确保检测准确性的基础上，进一步地优化检测程序。利用受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic，ROC)对差异代谢物的性能预测准确性进行评估，ROC曲线分析以(1-特异性)为横坐标，敏感度为纵坐标，将试验的灵敏度及特异性结合，是一种科学可靠的评价检测手段，能够指示本发明找到的生物标志物评估肌内脂肪含量高低的效果。曲线下面积(AUC)越大，预测效果越佳，AUC接近0.5时，无预测意义；AUC＜0.7，表示预测准确率较低；AUC在0.7-0.9，表示准确性中等；AUC＞0.9时，表示预测准确性较高。如图3所示，不同肌内脂肪含量组中，8种甘油三酯类代谢物(TG(18:1/18:4/18:4)、TG(14:0/20:1/22:1)、TG(18:1/18:1/20:0)、TG(12:0/16:0/18:3)、TG(18:0/20:1/20:1)、TG(16:0/16:1/20:1)、TG(18:1/18:1/22:0)、TG(18:1/18:3/18:3))经过ROC分析后AUC为1.000，酰基肉碱与游离酰基肉碱经过ROC分析后AUC分别为0.771和0.727。其中使用甘油三酯类代谢物生物标记物在评定肌内脂肪含量水平时表现出100％的敏感度、100％的特异性及1.000的AUC值。因此，通过比对8种甘油三酯类代谢物能够用于准确评判肌内脂肪水平。
本发明同时利用KEGG数据库进行了代谢通路富集分析，对找到的差异代谢物的代谢途径及各步反应进行注释，对富集的相关通路与性状间的关联进行了验证。注释猪不同肌内脂肪水平中受到影响的代谢通路，可知受影响的甘油酯代谢、胆固醇代谢、产热作用、胰岛素耐受性、脂肪消化与分解的调控，以及维生素的消化吸收通路等之间具有相关关联，且这些代谢与猪肉肌内脂肪含量变化密切相关。并由此最终确定用于猪肌内脂肪含量评估的8种生物标志物。
根据本发明，利用代谢组分析能够有效评估猪肌内脂肪含量，将高肌内脂肪猪与低肌内脂肪猪差异性地进行分离，具有高灵敏度与特异性。检测到的差异代谢物8种，均为上调代谢物8种，表现为在高肌内脂肪猪肌肉中含量显著高于低肌内脂肪猪。所述8种差异代谢物为甘油三酯类化合物。在实际猪肉品质分类与猪遗传评估工作中，只需要针对表2中的这8种代谢物中的一种或多种进行以上代谢组学检测以及OPLS-DA分析，即可快速高效地指示猪肌内脂肪含量水平的高低。
利用单一生物标志物的肌内脂肪含量评估，其方法如下：对所选生物标志物进行定量检测后，根据其含量高低进行排序与高低水平分组，可利用单变量分析中的差异倍数值(fold change)对分组结果进行检验，生物标志物高的样品则肌内脂肪含量高；对于多种组合形式生物标志物的肌内脂肪含量评估，其方法如下：对所选生物标志物组合进行定量检测后，将所选标志物含量进行scale标准化并计算每个样本个体的标志物组合的均值，对均值进行排序与高低水平的分组，可利用多变量PLS-DA和OPLS-DA分析对分组结果进行检验即可，生物标志物组合的均值高，则对应的样品中肌内脂肪含量高。
表2.利用ROC曲线分析最终鉴别的肌内脂肪含量生物标志物质
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，同样适用于其他品种猪。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。