一种区分生青皮和醋青皮的质量评价方法
阅读说明：本技术 一种区分生青皮和醋青皮的质量评价方法 (Quality evaluation method for distinguishing green tangerine peels from vinegar tangerine peels ) 是由 李慧芬 崔伟亮 张学兰 赵盼 刘青芝 于 2021-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于材料分析领域,具体涉及一种区分生青皮和醋青皮的质量评价方法。该评价方法通过以下步骤实现：制备供试品溶液和对照品溶液,利用高效液相色谱分别建立生青皮和醋青皮的指纹图谱,通过指纹谱图进行生青皮和醋青皮区分验证。本发明系统研究青皮醋炙前后化学成分的变化,筛选醋青皮的质量标志物,为制定更加合理的醋青皮质量标准和进一步研究醋炙青皮的炮制原理提供科学依据；该方法稳定可靠,建立的指纹图谱分析方法能够系统地反映生青皮、醋青皮饮片化学成分的差异,筛选出的新增成分可以作为区分生青皮、醋青皮的质量标志物,为制定更加合理的醋青皮质量标准和进一步研究醋炙青皮的炮制原理提供科学依据。(The invention belongs to the field of material analysis, and particularly relates to a quality evaluation method for distinguishing green tangerine peels from vinegar tangerine peels. The evaluation method is realized by the following steps: preparing a test solution and a reference solution, respectively establishing fingerprint spectrums of green tangerine orange peel and vinegar green tangerine orange peel by using high performance liquid chromatography, and performing differentiation verification on the green tangerine orange peel and the vinegar green tangerine orange peel by using the fingerprint spectrums. The invention systematically studies the change of chemical components before and after vinegar processing of the green tangerine peel, screens the quality marker of the vinegar green tangerine peel, and provides scientific basis for formulating more reasonable quality standard of the vinegar green tangerine peel and further studying the processing principle of the vinegar processed green tangerine peel; the method is stable and reliable, the established fingerprint spectrum analysis method can systematically reflect the difference of chemical components of the green tangerine orange peel and the vinegar green tangerine orange peel decoction pieces, the screened new components can be used as quality markers for distinguishing the green tangerine orange peel and the vinegar green tangerine orange peel, and scientific basis is provided for formulating more reasonable quality standard of the vinegar green tangerine orange peel and further researching the processing principle of the vinegar roasted green tangerine orange peel.)
技术领域
本发明属于材料分析领域，具体涉及一种区分生青皮和醋青皮的质量评价方法。
背景技术
青皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮，具有疏肝破气，消积化滞的作用，用于胸胁胀痛，疝气疼痛，
乳癖，乳痈，食积气滞，脘腹胀痛[1]。 醋青皮最早记载于宋《三因极一病
证方论》“米醋熬”，《中国药典》2020版中收载了青皮和醋青皮两种饮片，
但两种饮片的质量标准中除了外观性状和橙皮苷的含量限度有区别（青皮含橙皮苷不得少于4.0%，醋青皮含橙皮苷不得少于3.0%），无明确的醋青皮质量标志物，导致无法有效区分外观性状缺失的青皮不同炮制品的粉末或含有青皮不同炮制品的中成药。现代研究发现，青皮中主要含有挥发油（D-柠檬烯）、黄酮类（橙皮苷）、生物碱（辛弗林）等活性成分，醋炙后挥发油、橙皮苷、辛弗林的含量均下降。王耀丽等人采用HPLC测定了青皮醋炙前后的指纹图谱，鉴定了橙皮苷，认为青皮醋炙前后指纹图谱、相对峰面积差距均较小，无法有效区分醋青皮与生青皮。
发明内容
针对现有技术中存在的无法有效区分醋青皮与生青皮的技术难题，本发明提供了一种区分生青皮和醋青皮的质量评价方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种区分生青皮和醋青皮的质量评价方法，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取生青皮或醋青皮样品粉末，精密称定，精密加入甲醇，后称重，超声，冷却，补足失重，过滤，取续滤液，过微孔滤膜，即得；
（2）对照品溶液的制备：分别称取辛弗林、橙皮苷，精密称定，加甲醇分别制成对照品储备液，精密吸取对照品储备液，加甲醇稀释定容，制备成混合对照品溶液;
（3）利用高效液相色谱分别建立生青皮和醋青皮的指纹图谱；
（4）通过指纹谱图进行生青皮和醋青皮区分验证。
本发明提供的供试品溶液具体的制备过程为：取样品粉末约0.20 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入100%甲醇25 mL，密塞，称重，超声（100W，40KHz）30 min，冷却，补足失重，过滤，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜。
本发明提供的对照品溶液具体的制备过程为：分别称取辛弗林、橙皮苷适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含1.10 mg辛弗林、0.335 mg橙皮苷的对照品储备液，精密吸取上述对照品储备液各1 mL置于25mL容量瓶中，加甲醇稀释定容，制备成每1 mL含44.00 µg辛弗林、13.40 µg橙皮苷的混合对照品溶液。
进一步的，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；进样体积：10 μL；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：283nm，进行梯度洗脱。
进一步的，所述梯度洗脱的条件为：0~8 min，10%-14% A；8~17 min，14%-16% A；17~38 min，16%-18% A；38~50 min，18%-30% A；50~72 min， 30%-38% A；72~88 min，38%-50%A；88~88.01 min，50%-10% A；88.01~98 min，10% A。
本发明提供的质量评价方法中，能够区分生青皮和醋青皮的质量标志物为1号峰和5号峰。
本发明的有益效果为：
（1）本发明建立青皮醋炙前后HPLC指纹图谱并进行化学计量学分析，系统研究青皮醋炙前后化学成分的变化，筛选醋青皮的质量标志物，为制定更加合理的醋青皮质量标准和进一步研究醋炙青皮的炮制原理提供科学依据。
（2）本发明提供的生青皮及醋青皮的指纹图谱分析方法，该方法稳定可靠，可用于生青皮与醋青皮的指纹图谱研究及鉴别。建立的指纹图谱分析方法能够系统地反映生青皮、醋青皮饮片化学成分的差异，筛选出的新增成分可以作为区分生青皮、醋青皮的质量标志物，为制定更加合理的醋青皮质量标准和进一步研究醋炙青皮的炮制原理提供科学依据。
附图说明
图1为生青皮和醋青皮的HPLC指纹图谱；
其中，A为生青皮；B为醋青皮。
图2为混合标准品HPLC图谱。
图3为生青皮、醋青皮饮片PCA 3D得分图（A）及载荷图（B）。
图4为生青皮、醋青皮PLS-DA模型得分图（A）及模型检验图（B）。
图5为生青皮饮片、醋青皮饮片偏最小判别二乘分析VIP图。
图6为生青皮饮片、醋青皮饮片饮片聚类分析树状图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（包括DAD检测器，美国Agilent公司），KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），METTLER TOLEDO十万分之一电子天平（美国梅特勒托利多公司），Synergy UV超净水仪（美国密理博公司）。
1.2 试剂
橙皮苷对照品（批号110721-201316）、辛弗林对照品（批号110727-200306），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯；水为自制超纯水；其余试剂均为分析纯；糯米香醋（莱阳鲁花醋业食品有限公司，批号：20201222）。
1.3 材料
10批生青皮经山东中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮的加工炮制品。样品信息见表1。
表1 10批生青皮信息
2.1 醋青皮的制备
根据《中国药典》2020版一部醋青皮炮制方法，炒至微黄色。对应生青皮饮片编号S1~S10，醋青皮的编号记为C1~C10。
2.2 色谱条件
色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；进样体积：10 μL；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：283nm。梯度洗脱条件为：0~8 min，10%-14% A；8~17 min，14%-16% A；17~38 min，16%-18% A；38~50min，18%-30% A；50~72 min， 30%-38% A；72~88 min，38%-50% A；88~88.01 min，50%-10%A；88.01~98 min，10% A。
2.3 溶液的制备
2.3.1 对照品溶液制备
分别称取辛弗林、橙皮苷适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含1.10 mg辛弗林、0.335 mg橙皮苷的对照品储备液。精密吸取上述对照品储备液各1 mL置于25mL容量瓶中，加甲醇稀释定容，制备成每1 mL含44.00 µg辛弗林、13.40 µg橙皮苷的混合对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备
取样品粉末（过5号筛）约0.20 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入100%甲醇25 mL，密塞，称重，超声（100W，40KHz）30 min，冷却，补足失重，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 参照峰选择
本实验以橙皮苷为参照峰，用于计算指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
2.4.2 精密度试验
取生青皮（批号：2007001）的供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以3号峰（橙皮苷）的保留时间为参照峰，记录各共有色谱峰的相对保留时间。结果显示共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值范围0.04%~0.97%，表明仪器精密度符合要求。
2.4.3 稳定性试验
取生青皮（批号：2007001）的供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，分别在0，3，6，9，12，24h进样，记录色谱图，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以3号峰（橙皮苷）的保留时间为参照，记录各共有色谱峰的相对保留时间。结果显示共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值范围0.05%~1.00%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.4.4 重复性试验
取生青皮（批号为：2007001）粉末，按照“2.3.2”项下制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以3号峰（橙皮苷）的保留时间为参照，记录各共有色谱峰的相对保留时间。结果显示共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD值范围0.03%~0.54%，表明方法重复性良好。
2.5 指纹图谱的建立及相似度分析
2.5.1 青皮醋炙前后HPLC指纹图谱的建立及分析
取各样品依照“2.3.2”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。记录色谱图，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012年A版）软件，采用中位数法和多点校正法，时间宽度为0.10min，进行Mark峰匹配，分别建立青皮醋炙前后HPLC指纹图谱，在此基础上分别建立生青皮、醋青皮对照图谱，如图1。生青皮指纹图谱中标定了8个共有峰，醋青皮指纹图谱中标定了9个共有峰，其中，5号峰为醋青皮指纹图谱中共同的新增峰。通过对照品比对发现，1号峰为辛弗林，3号峰为橙皮苷，5号峰为未知成分，见图2。选择峰面积较高，分离度较好的3号橙皮苷色谱峰为参照峰，各样品共有峰的相对保留时间基本一致，RSD≤3.21%，差异较小，各共有峰的相对峰面积RSD为25.96%～192.24%，表明各批饮片成分相似，但成分的含量有一定差别。
2.5.2 相似度评价
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012年A版”软件，计算生青皮、醋青皮与各自对照图谱之间的相似度，见表2~表4。结果生青皮指纹图谱与其对照图谱的相似度≥0.956，醋青皮指纹图谱与其对照图谱的相似度≥0.941，两种饮片之间的相似度范围0.937~0.999，表明样品各批次之间相似度高，炮制工艺稳定，但相似度评价难以有效区分生青皮与醋青皮，需要进一步明确其差异，有效区分两种饮片。
表2 生青皮饮片指纹图谱相似度评价结果
表3 醋青皮饮片指纹图谱相似度评价结果
表4 生青皮、醋青皮饮片指纹图谱相似度评价结果
2.6 生青皮及醋青皮指纹图谱的多元统计分析
2.6.1 主成分分析
将生青皮、醋青皮共有峰及醋青皮5号峰峰面积数据导入SIMCA14.1软件，基于PCA建立无监督的识别模式，观察样品分布趋势，结果见表5。由表5可知，变量可拟合为两个主成分（PC1，PC2），PC1描述了55.8%的样本变化，PC2描述了27.4%的样本变化，总预测能力63.1%，认为模型较好。生青皮聚成一类，醋青皮聚成一类，二者可被有效区分。根据主成分分析得到所有样本的 PCA 三维投影图和9个变量的分布图，结果见图3。9个变量分布在不同位置，反映各色谱峰在主成分分析中所占的比例，离Y轴距离越远的点对PC1的贡献越大，故对PC1贡献度由大到小为：8号峰＞9号峰＞6号峰＞2号峰＞3号峰（橙皮苷）＞7号峰＞5号峰＞1号峰（辛弗林）＞4号峰。离X轴距离越远的点对PC2的贡献越大，故对PC2峰贡献度由大到小为：1号峰＞4号峰＞5号峰＞7号峰＞3号峰（橙皮苷）＞2号峰＞9号峰＞6号峰＞8号峰。
表5 PCA参数
2.6.2 偏最小二乘判别分析（PLS-DA）
PLS-DA属于有监督的模式识别分析，为进一步筛选对两种饮片质量产生影响贡献较大的成分，以生青皮、醋青皮共有峰及醋青皮5号峰峰面积作为变量。在前期主成分分析的基础上采用SIMCA14.1 软件分别对两种饮片的峰面积进行PLS-DA 分析，得到模型得分图及模型检验图，结果见图4，由模型得分图可以看出，生青皮和醋青皮可以被有效区分，与横坐标轴交点均＜0.5，与纵坐标交点均＜1，且左边模拟R2、Q2均小于右侧，认为模型没有出现过拟合现象，具有较好的预测能力。以峰编号为横坐标，以表明变量重要性的投影值（variable important in project，VIP）为纵坐标做，结果见图5。VIP 值一般认为VIP值大于1的成分为主要差异成分，VIP值越高，对区分两种样品的贡献率越高。由统计结果可知，5号峰和1号峰的VIP大于1，故认为这2个色谱峰所代表的成分可以做为区分生青皮和醋青皮的质量标志物。
2.6.3 均值聚类分析及分层聚类分析
将筛选出的贡献值较大的5号峰峰面积导入SPSS Statistics 22软件，进行均值K-聚类分析，结果见表6。由表6可知，生青皮、醋青皮可被分成两类，10批生青皮均属于组1，大多数醋青皮属于组2，C2、C8与生青皮归为一类。故进一步进行分层聚类分析，结果见图6。由图6可知，生青皮可聚为一类，醋青皮可聚为一类。
表6 均值K-聚类分析结果
通过对生青皮和醋青皮色谱图进行主成分分析、偏最小二乘判别分析、聚类分析发现，有2种主成分，且可对生青皮与醋青皮进行区分。为进一步区分生青皮与醋青皮中化学成分的差异，建立了偏最小二乘判别分析模型，所建立的模型具有较好的解析能力和预测能力，并确定1号峰和5号峰为生青皮与醋青皮的差异性成分。共同用1号峰和5号峰或单独用1号峰进行K-聚类分析时发现区分程度不好，不能将生、醋青皮区分开，单独用5号峰进行K-聚类分析，生青皮可聚为一类，醋青皮大部分可聚为一类，但C2、C8的均值聚类与其它醋青皮样品无法聚为一类。分析原因是由于这两批样品色谱图中的5号峰峰面积较小，无法与生品色谱图进行有效区分。
实验发现，除了5号峰为所有醋青皮色谱图中的共有新增色谱峰外，还有其它新增色谱峰，但因样品不同，新增色谱峰有所不同，故认为5号峰为青皮醋炙后新增成分色谱峰。
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