一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法
阅读说明：本技术 一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法 (Method for establishing fungal proteolytic peptide fingerprint ) 是由 张萍 魏锋 马双成 康帅 李娟� 刘薇 李明华 陆兔林 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法,包括真菌蛋白的提取；对所述真菌蛋白液进行纯化与酶解；对酶解后的所述真菌蛋白液进行UPLC-MS分析,按质谱-色谱条件下的方法建立质谱指纹图谱,并进行方法学考察；所述质谱指纹图谱为进一步寻找冬虫夏草及各发酵虫草制剂的特征离子提供了大数据支持。本发明构建的方法具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点,能从质谱的整体特征上把握各样品真菌蛋白酶解肽的质量情况,为冬虫夏草及各发酵虫草菌粉和制剂的质量控制、真伪鉴别提供了新的科学方法。(The invention discloses a method for establishing a fungal protein enzymolysis peptide fingerprint, which comprises the steps of extracting fungal protein; purifying and performing enzymolysis on the fungal protein liquid; carrying out UPLC-MS analysis on the fungus protein liquid after enzymolysis, establishing a mass spectrum fingerprint spectrum according to a method under the mass spectrum-chromatographic condition, and carrying out methodology investigation; the mass spectrum fingerprint provides big data support for further searching characteristic ions of cordyceps sinensis and various fermented cordyceps sinensis preparations. The method constructed by the invention has the advantages of simple operation, high sensitivity, good accuracy and the like, can grasp the quality condition of the fungal proteolysis peptide of each sample from the overall characteristics of the mass spectrum, and provides a new scientific method for quality control and authenticity identification of cordyceps sinensis and fermented cordyceps sinensis powder and preparations.)
技术领域
本发明属于中药成分鉴定技术领域，尤其涉及一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法。
背景技术
中药成分复杂，以某一成分作为控制指标已经不适合中药质量控制的要求。中药指纹图谱既可以评判中药材的真伪与优劣也可以判断中药成方制剂的质量优劣及制备工艺的合理性。与单一成分作为控制指标的质量控制方法相比，指纹图谱能够从整体化学成分上全面反映样品的质量，进而达到有效控制质量的目的，克服了中药有效成分大多不明确这一劣势。
化学计量学是一门将统计学、数学以及计算机技术的方法和原理结合应用来处理化学数据的学科，它可以对化学测量过程进行优化，并可以从所测量得到的化学数据中最大程度的提取对分析有用的化学信息，其最突出的特征是将多变量分析的方法引入到了化学研究的领域，这种思想是与中医用药的思想有相通之处的，因此，将化学计量学应用于中药的研究中是可行的。指纹图谱应用于中药质量控制中的研究是离不开化学计量学的。将现代仪器分析的方法与化学计量学方法合理结合利用，有效提取有用信息，对于改善并提高中药质量控制方法，推进中药现代化进程有深远的影响。
天然冬虫夏草与各发酵虫草菌粉中有相似的化学成分，如甾醇类、核苷类、虫草多糖类、蛋白质和氨基酸类、甘露醇、硬脂酸、软脂酸、维生素、有机酸及微量元素等。真菌蛋白作为有效成分之一，研究甚少。为考察冬虫夏草及这些发酵虫草菌粉及制剂的真菌蛋白特点和差异，我们在同样的条件下分析并建立了各样品中真菌蛋白酶解后所得多肽类成分的质谱指纹图谱，并进行了方法学考察，为后期考察各样品的整体质量及寻找能够鉴别冬虫夏草和不同发酵虫草菌粉及制剂的特征肽段，为各发酵虫草菌粉及制剂的质量控制建立了有效方法，同时为综合评价各发酵虫草菌粉及制剂的质量提供技术支持。基于上述分析，提出一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法。
发明内容
本发明提供一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法。
本发明包括以下步骤：
A真菌蛋白的提取；
B对所述真菌蛋白液进行纯化与酶解；
C对酶解后的所述真菌蛋白液进行UPLC-MS分析，按质谱-色谱条件下的方法记录质谱指纹图谱；
D对所述质谱指纹图谱进行方法学考察，验证所建立质谱指纹图谱方法的可行性，为下一步寻找冬虫夏草及各发酵虫草制剂的特征离子进而鉴别真伪提供大数据支持。
进一步地，所述真菌蛋白的提取的方法包括：取样品粉末约10mg，加入去离子水涡旋混匀后，离心，弃去上清液，按试剂盒法提取真菌蛋白。提取2次，合并上清液，混匀后离心，吸取上清液测定蛋白的浓度，上清液全部置于内衬离心管中，离心，弃去滤液，离心管中加0.05M NH4HCO3溶液适量，洗涤2次，分别离心，弃去滤液，将内衬离心管倒置反超滤离心，滤液中加0.05M NH4HCO3溶液稀释至浓度为1mg/mL的溶液，混匀，待用。
进一步地，所述蛋白提取液纯化与酶解的方法包括：将样品与上样Buffer混合，加热5min，放置室温，每孔上样20μL，100V通电10min将样品跑入16％聚丙烯酰胺分离胶中纯化，考马斯亮蓝染色，乙酸脱色，将蓝色条带切下并切成小块，超纯水清洗，加入10mM DTT没过胶块于56℃下反应，吸出液体，加入55mM碘乙酰胺液室温下避光反应。加入0.05MNH4HCO3/ACN(1:1)溶液脱色至胶块变为无色，吸取液体，真空干燥。按1:20(W/W)加入胰蛋白酶，放置使胶粒充分溶胀，加入0.05M NH4HCO3适量，37℃下酶解18h，加入50％ACN(含5％TFA)于胶粒中，37℃温育1h，0.1％甲酸溶解后离心取上清液进行UPLC-MS-MS分析。
进一步地，所述色谱-质谱联用检测的色谱条件的流动相：A：0.1％甲酸液；B：0.1％甲酸-乙腈液；流速：300nL/min。梯度洗脱程序如下：
进一步地，在色谱-质谱联用检测的质谱条件采用纳米电喷雾离子源(NSI)正离子监测模式，喷雾电压2.2kV，鞘气(N2)流速60arb(约400kPa)，扫描范围(m/z)为350～1550，一级质谱采用Orbitrap检测器，Orbitrap Resolution：120000，二级质谱扫描为DIA扫描，采用离子肼检测器，二级质谱碰撞能量为35％。
进一步地，对所述质谱指纹图谱进行方法学考察，包括(1)精密度考察：取百令胶囊内容物10mg，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法重复进样6次，记录质谱指纹图谱。因本实验建立指纹图谱的目的是寻找各样品的差异性特征肽成分，每个水解多肽的标识是保留时间和精确质量，故选取指纹图谱中保留时间有代表性的7个离子(330.1976，508.2743，615.3333，577.2941，218.2128，802.4413，246.2455)提取色谱峰，计算7个离子色谱峰的保留时间和精确质量，提取离子色谱图见图1，结果表明，各离子色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，符合指纹图谱技术要求。(2)重复性考察：取百令胶囊10mg，共6份，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法进样，记录质谱指纹图谱。同理选取上述7个离子提取色谱峰，计算7个离子色谱峰的保留时间和精确质量。结果表明，各色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，符合指纹图谱技术要求。(3)稳定性考察：取百令胶囊10mg，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法分别于0，2，4，8，12，24小时测定，记录质谱指纹图谱。选取上述7个离子提取色谱峰，结果表明，7个离子色谱峰在24小时内均可检出，各色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，说明样品在24小时内较为稳定，符合指纹图谱定性鉴别的技术要求。
本发明的有益效果为：
本发明构建方法具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点，能从质谱的整体特征上把握各样品真菌蛋白酶解肽的质量情况，为冬虫夏草及各发酵虫草菌粉和制剂的质量控制、真伪鉴别提供了新的科学方法。
附图说明
图1为本发明的真菌蛋白酶解肽指纹图谱的提取离子色谱示意图；
图2为本发明的真菌蛋白酶解肽指纹图谱的冬虫夏草样品总离子流多肽LC/MS/MS质谱图；
图3为本发明的真菌蛋白酶解肽指纹图谱的百令胶囊总离子流多肽LC/MS/MS质谱图；
图4为本发明的真菌蛋白酶解肽指纹图谱的心肝宝胶囊总离子流多肽LC/MS/MS质谱图；
图5为本发明的真菌蛋白酶解肽指纹图谱的金水宝胶囊总离子流多肽LC/MS/MS质谱图；
图6为本发明的真菌蛋白酶解肽指纹图谱的至灵胶囊总离子流多肽LC/MS/MS质谱图；
图7为本发明的真菌蛋白酶解肽指纹图谱的宁心宝胶囊总离子流多肽LC/MS/MS质谱图；
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
仪器与试药
仪器：超高效液相色谱仪(美国Thermo公司)；Orbitrap Fusion质谱仪(美国Thermo公司)；EPS-301电泳仪(美国General Electric公司)；真空离心浓缩仪。
试剂：聚丙烯酰胺、考马斯亮蓝、乙酸、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、三氟乙酸(TFA)、碳酸氢铵等均为化学纯或分析纯；甲酸、乙腈均为色谱纯(美国Fisher公司)；去离子水为Millipore超纯水；胰蛋白酶为序列纯。
色谱条件
色谱柱：ZorbaxSB-C18(150mm×75mm，3μm)；
流动相：A：0.1％甲酸液；B：0.1％甲酸-乙腈液；梯度洗脱程序如下：
流速：300nL/min。
质谱条件
采用纳米电喷雾离子源(NSI)正离子监测模式，喷雾电压2.2kV，鞘气(N2)流速60arb(约400kPa)，扫描范围(m/z)为350～1550，一级质谱采用Orbitrap检测器，OrbitrapResolution：120000，二级质谱扫描为DIA扫描，采用离子肼检测器，二级质谱碰撞能量为35％。
样品溶液制备
真菌蛋白提取
取样品粉末约10mg，加入去离子水约涡旋混匀后，离心，弃去上清液，按试剂盒法提取真菌蛋白。提取2次，合并上清液，混匀后离心，吸取上清液测定蛋白的浓度，上清液全部置于内衬离心管中，离心，弃去滤液，离心管中加0.05M NH4HCO3溶液适量，洗涤2次，分别离心，弃去滤液，将内衬离心管倒置反超滤离心，滤液中加0.05M NH4HCO3溶液稀释至浓度为1mg/mL的溶液，混匀，待用。
真菌蛋白液纯化与酶解
将样品与上样Buffer混合，加热5min，放置室温，每孔上样20μL，100V通电10min将样品跑入16％聚丙烯酰胺分离胶中纯化。考马斯亮蓝染色，乙酸脱色，将蓝色条带切下并切成小块，超纯水清洗。加入10mM DTT没过胶块于56℃下反应，吸出液体，加入55mM碘乙酰胺液室温下避光反应。加入0.05M NH4HCO3/ACN(1:1)溶液脱色至胶块变为无色，吸取液体，真空干燥。按1:20(W/W)加入胰蛋白酶，放置使胶粒充分溶胀，加入0.05M NH4HCO3适量，37℃下酶解18h，加入50％ACN(含5％TFA)于胶粒中，37℃温育1h。0.1％甲酸溶解后离心取上清进行UPLC-MS-MS分析。
方法学考察
精密度考察：
取百令胶囊10mg，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法重复进样6次，记录质谱指纹图谱。因本实验建立指纹图谱的目的是寻找各样品的差异性特征肽成分，每个水解多肽的标识是保留时间和精确质量，故选取指纹图谱中保留时间有代表性的7个离子(330.1976，508.2743，615.3333，577.2941，218.2128，802.4413，246.2455)提取色谱峰，计算7个离子色谱峰的保留时间和精确质量，提取离子色谱图见图1。结果表明，各离子色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，符合指纹图谱技术要求。
重复性考察
取百令胶囊10mg，共6份，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法进样，记录质谱指纹图谱。同理选取上述7个离子提取色谱峰，计算7个离子色谱峰的保留时间和精确质量。结果表明，各色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，符合指纹图谱技术要求。
稳定性考察：
取百令胶囊10mg，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法分别于0，2，4，8，12，24小时测定，记录质谱指纹图谱。选取上述7个离子提取色谱峰，结果表明，7个离子色谱峰在24小时内均可检出，各色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，说明样品在24小时内较为稳定，符合指纹图谱定性鉴别的技术要求。
数据采集
将酶解后的样品溶液分别进入质谱仪，得到各样品的总离子流一级、二级质谱图，一级质谱总离子流图如下图2-7。分别为冬虫夏草、百令胶囊、心肝宝胶囊、金水宝胶囊、至灵胶囊、宁心宝胶囊的总离子流多肽质谱图。
本实验通过色谱-质谱联用检测，得到各样品的总离子流多肽指纹图谱，目的是为下一步寻找各样品间的差异性特征多肽成分打下基础，因每个水解多肽的标识为保留时间和精确质量，在梯度洗脱中，可能对色谱峰的保留时间产生影响，考虑到不同的溶剂比例，可能对检测成分的离子化产生影响。故在指纹图谱中选取保留时间有代表性的7个离子作为检测指标，考察7个离子色谱峰的保留时间和精确质量，并进行总离子流多肽指纹图谱的方法学考察，结果表明，本实验建立的质谱指纹图谱方法可行，满足实验要求。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
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