阅读说明：本技术 一种基于液质联用技术快速精准分析茶鲜叶中茶氨酸的方法 (Method for rapidly and accurately analyzing theanine in fresh tea leaves based on liquid chromatography-mass spectrometry technology ) 是由 张丽 康法 刘腾飞 张季雨 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于液质联用技术快速精准分析茶鲜叶中茶氨酸的方法,包括以下步骤：(1)茶鲜叶的前处理；(2)配制茶氨酸标准溶液；(3)获得最佳超高效液相色谱条件和质谱条件；(4)采用超高效液相色谱-质谱法,根据步骤(3)中的色谱/质谱条件对茶鲜叶中的茶氨酸进行定性确证,并进行定量分析。本发明以茶鲜叶代替茶叶干样作为样品,用纯水低温提取后,经一定比例的乙醇水溶液纯化除杂,利用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测,实现了快速精准测定茶鲜中茶氨酸成分的目的,为茶叶质量评价和等级评定提供了理想的分析手段。(The invention provides a method for quickly and accurately analyzing theanine in fresh tea leaves based on a liquid chromatography-mass spectrometry technology, which comprises the following steps of: (1) pretreating fresh tea leaves; (2) preparing a theanine standard solution; (3) obtaining the optimal ultra performance liquid chromatography condition and the optimal mass spectrum condition; (4) and (3) qualitatively confirming the theanine in the fresh tea leaves by adopting an ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry method according to the chromatographic/mass spectrometry condition in the step (3), and carrying out quantitative analysis. According to the method, fresh tea leaves are used as a sample to replace a tea dry sample, pure water is used for low-temperature extraction, the sample is purified by a certain proportion of ethanol water solution, and the ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry is used for detection, so that the purpose of rapidly and accurately determining the theanine component in the fresh tea leaves is realized, and an ideal analysis means is provided for tea quality evaluation and grade evaluation.)

一种基于液质联用技术快速精准分析茶鲜叶中茶氨酸的方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，涉及化学成分的检测方法，具体涉及一种基于液质联用技术快速精准分析茶鲜叶中茶氨酸的方法。

背景技术

茶树新梢的芽或叶内富含多种氨基酸类物质，其组成和含量与茶叶的品质密切相关，是茶叶品质的重要评价因子之一。目前，可鉴别的茶叶氨基酸达20余种，其中茶氨酸约占茶叶中游离氨基酸总量的40％以上，是茶叶中特有的氨基酸，具有类似味精的鲜爽和焦糖香气，可缓解茶的苦涩味，增强其甜味，也是茶叶鲜爽味的主要来源。因此，茶叶中茶氨酸成分分析对于茶叶品质鉴定具有十分重要的意义。

茶鲜叶是从茶树新梢上采摘下来的鲜活的芽或叶，作为加工各类成品茶的原料，其质量优劣直接影响到茶叶产品的质量水平。目前茶叶中氨基酸分析方法的研究中以干样较多。国家标准GB/T8303-2013中规定，茶样需磨碎后在电热恒温干燥箱中加热、除去水分至恒重后再用于氨基酸含量的测定。由于干样经过高温杀青、烘干和粉碎而成，高温过程中蛋白质变性，其蛋白酶的生物活性丧失，易造成蛋白质降解导致氨基酸含量增加，同时烘干等步骤可能会引起茶叶多种生化成分转化，使得测试数据并不能真实反应茶叶中氨基酸的实际水平，从而产生检测误差。

对茶叶中氨基酸成分的分析方法一直在摸索中。茚三酮比色法是目前测定游离氨基酸总量的常规方法，也是国家标准GB/T 8314-2013《茶游离氨基酸总量的测定》中所采用的检测方法，但该法只适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定，不能检测茶叶中各游离氨基酸组分的含量。氨基酸分析仪使用茚三酮作为衍生试剂柱后衍生测定，存在设备价格及仪器局限性等问题。中国发明专利“一种茶叶鲜样中茶氨酸含量的快速分析方法”(专利号ZL201710234515.1)报道了一种以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生剂，结合高效液相色谱-荧光检测器快速定量检测茶叶鲜样叶中茶氨酸的方法。但该发明方法需进行复杂的柱前衍生，仅依靠保留时间定性确证，存在步骤繁琐，易受杂质干扰，衍生化精准性和检测精准度不高等问题。

发明内容

要解决的技术问题：本发明以茶鲜叶代替茶叶干样作为样品，代替传统方法中以茶叶干样作为样品来检测茶氨酸成分，避免了高温、烘干等步骤可能引起的茶叶各种生化成分间的转化、导致茶氨酸含量变化而产生的检测误差；用纯水低温提取后，经一定比例的乙醇水溶液纯化除杂，利用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测，实现了快速精准测定茶鲜中茶氨酸成分的目的，为茶叶质量评价和等级评定提供了理想的分析手段。

技术方案：一种基于液质联用技术快速精准分析茶鲜叶中茶氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)精密称取适量茶氨酸标准品，置于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得茶氨酸浓度为1mg/mL，于4℃冰箱保存；

(2)配制茶氨酸标准溶液；

(3)获得超高效液相色谱条件：

色谱柱：沃特世Acquity UPLC HSS T3柱；

柱温：40℃；

进样体积：1.0μL；

流速：0.4mL/min；

流动相A为2mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为甲醇；

梯度洗脱：0～0.5min，2％B；0.5～6.0min，2％～90％B；6.0～8.0min，90％B；8.0～8.01min，2％B；8.01～13.0min，2％B；

质谱条件：

电喷雾离子化，正离子扫描，多反应监测模式；

毛细管电压：0.5kV；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气温度：600℃；

脱溶剂气流量：1000L/h；

碰撞气：氩气；

流速：0.15mL/min；

(4)茶叶的前处理；

(5)采用超高效液相色谱-质谱法，根据步骤(3)中的色谱/质谱条件对茶叶进行定性筛查，并进行定量分析。

进一步的，所述步骤(2)中茶氨酸标准溶液的质量浓度分别为1、10、50、100、200、400μg/L。

进一步的，所述步骤(3)中色谱柱：2.1mm×100mm，1.8μm。

进一步的，所述步骤(3)中质谱条件中的质谱参数为：母离子：175m/z；定量离子：84m/z；定性离子：158m/z；锥孔电压：10V；碰撞能量：20V、15V。

进一步的，所述步骤(4)中茶叶的前处理：取茶鲜叶搅碎并混合均匀，称取0.1g，加入10mL超纯水，涡旋混匀，4℃提取30min，9000r/min离心2min，取4mL上层提取液，加入等量的80％乙醇水溶液，4℃条件下以9000r/min离心10min，取上清液过0.45μm水相滤膜，待测。

有益效果：

1.本发明首次建立了利用液质联用技术快速精准分析茶鲜叶中茶氨酸的分析方法，不需要对茶样进行衍生化处理，简化实验步骤，操作更加简单方便；以保留时间、特征离子对进行定性确证，有效排除假阳性干扰，检测结果更加准确。

2.本发明以茶鲜叶作为样品，代替传统方法中以茶叶干样作为样品来检测茶氨酸成分，避免了高温、烘干等步骤可能引起的茶鲜叶各种生化成分间的转化、导致茶氨酸含量变化而产生的检测误差。

3.本发明创新地利用80％乙醇水溶液对提取液进行纯化，有效去除蛋白杂质对茶氨酸分析影响，使测定数据更加精准可靠，真实地反应茶鲜叶中茶氨酸的含量水平。

附图说明

：

图1为茶氨酸的总离子流色谱图。

图2为实施例1和对比例1的茶氨酸回收率对比图。

具体实施方式

茶氨酸标准品(美国Sigma公司)；甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸、乙醇、甲酸铵(色谱纯，Sigma公司)；实验用水为超纯水(18.4MΩ)。

精密称取适量茶氨酸标准品，置于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得茶氨酸浓度为1mg/mL，于4℃冰箱保存。

超高效液相色谱条件：

沃特世Acquity UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；柱温：40℃；进样体积：1.0μL；流速：0.4mL/min；流动相A为2mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱：0～0.5min，2％B；0.5～6.0min，2％～90％B；6.0～8.0min，90％B；8.0～8.01min，2％B；8.01～13.0min，2％B。

质谱条件：

电喷雾离子化(ESI)，正离子(ESI⁺)扫描，多反应监测模式，毛细管电压0.5kV，离子源温度150℃，脱溶剂气温度600℃，脱溶剂气流量1000L/h，碰撞气为氩气，流速0.15mL/min。茶氨酸的质谱参数见表1。

表1分析物质谱参数

茶氨酸的总离子流色谱图如图1所示。

1、方法的回归方程、相关系数及检出限

配制质量浓度分别为1、10、50、100、200、400μg/L的茶氨酸标准溶液进样测定，以氨基酸溶液浓度(X)为横坐标、对应峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，并进行线性回归分析，计算相关系数。结果表明，在1～400μg/L范围内，茶氨酸的质量浓度与其峰面积的线性关系良好，相关系数为0.9998。以3倍信噪比计算方法的检出限，结果见表2。

表2线性方程、相关系数和检出限

2、方法准确度

通过标准加入法确定方法的回收率。精密称取0.2g已知茶氨酸含量的茶鲜叶样品5份，向其中加入一定体积的茶酸酸标液，进行样品制备后测定，采用外标法定量，计算茶氨酸的回收率和相对标准偏差(RSD)，结果表明，在50和200μg/L两个加标水平下，茶氨酸的平均回收率在89.2％～95.3％之间，相对标准偏差在6.84％～9.21％之间，方法具有较高的准确度。

表3茶鲜叶加标回率收结果

3、方法精密度

取适量茶氨酸标准溶液，按上述方法进样分析，连续进样5次，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标计算RSD，考察其精密度。茶氨酸保留时间RSD在0.1％～0.55％，峰面积RSD在2.02％～3.21％，说明本方法精密度较高。

4、方法重复性

取同一茶鲜叶样品5份，按上述方法提取、测定，以色谱峰峰面积超过1％的氨基酸的保留时间和峰面积为指标分别计算RSD，考察方法的重复性。茶鲜叶中茶氨酸保留时间RSD在0.90％～2.38％之间，峰面积RSD在3.28％～4.88％之间，重复性较好。

实施例1：

茶叶鲜样取自苏州洞庭东山

样品制备

取茶鲜叶搅碎并混合均匀，称取0.1g，加入10mL超纯水，涡旋混匀，4℃提取30min，9000r/min离心2min，取4mL上层提取液，加入等量的80％乙醇水(体积比)溶液，4℃条件下以9000r/min离心10min，取上清液过0.45μm水相滤膜，待测。

采用上述建立好的方法进行测定，结果见表4。

表4苏州洞庭东茶鲜叶中游离氨基酸测定结果

实施例2：

茶叶鲜样取自苏州洞庭西山

样品制备

取茶鲜叶搅碎并混合均匀，称取0.1g，加入10mL超纯水，涡旋混匀，4℃提取30min，9000r/min离心2min，取4mL上层提取液，加入等量的80％乙醇水(体积比)溶液，4℃条件下以9000r/min离心10min，取上清液过0.45μm水相滤膜，待测。

采用上述建立好的方法进行测定，结果见表5。

表5茶鲜叶中游离氨基酸测定结果

对比例1：

茶叶鲜样取自苏州洞庭东山

样品制备

取茶鲜叶搅碎并混合均匀，称取0.1g，加入10mL超纯水，涡旋混匀，4℃提取30min，9000r/min离心2min，取4mL上层提取液，4℃条件下以9000r/min离心10min，取上清液过0.45μm水相滤膜，待测。

采用上述建立好的方法进行测定，测试回收率如图2所示。