吗氯贝胺的检测方法
阅读说明：本技术 吗氯贝胺的检测方法 (Detection method of moclobemide ) 是由 刘杏立 贾永娟 倪君君 于 2021-01-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供了吗氯贝胺的检测方法,包括：制备具有吗氯贝胺和内标物的至少三种浓度的标准溶液,标准溶液中的内标物的量相同；利用液相色谱仪在检测条件下检测每一种标准溶液,获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中吗氯贝胺的浓度和内标物的浓度,拟合吗氯贝胺的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物,涡旋混匀,顺次加入萃取剂,对第一上清液进行萃取,得到待测样品；利用液相色谱仪在检测条件下检测待测样品,获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果,得到待测样品中吗氯贝胺的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。(The invention provides a detection method of moclobemide, which comprises the following steps: preparing standard solutions having at least three concentrations of moclobemide and an internal standard, the internal standard being present in the standard solutions in the same amount; detecting each standard solution by using a liquid chromatograph under detection conditions to obtain a first detection result corresponding to the standard solution; fitting a standard curve equation of the moclobemide according to each first detection result, the concentration of the moclobemide in the standard solution and the concentration of the internal standard substance; taking a first supernatant after a sample to be treated is centrifuged; adding an internal standard substance into the first supernatant, uniformly mixing by vortex, sequentially adding an extracting agent, and extracting the first supernatant to obtain a sample to be detected; detecting the sample to be detected by using a liquid chromatograph under the detection condition to obtain a second detection result of the sample to be detected; and obtaining the concentration of the moclobemide in the sample to be detected based on the standard curve equation and the second detection result. The scheme can shorten the sample detection time.)
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及吗氯贝胺的检测方法。
背景技术
吗氯贝胺即4-氯-N-2-(4-吗啉基)乙基苯甲酰胺，为白色或类白色结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦。在甲醇、乙醇或三氯甲烷中易溶，在丙酮中溶解，在水中微溶。
目前，检测样品中吗氯贝胺含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而现有检测方法通常对待测样品进行较复杂的前处理，包括加入碱性溶液、高温氮气吹干等复杂操作，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。
发明内容
本发明提供了吗氯贝胺的检测方法，能够缩短样品检测时间。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了吗氯贝胺的检测方法，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有吗氯贝胺和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中吗氯贝胺的浓度和内标物的浓度，拟合吗氯贝胺的标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；
利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中吗氯贝胺的浓度。
优选地，为了更准确地检测出待测样品中吗氯贝胺的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为吡非尼酮。
需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆，萃取后选择为上层有机相。
具体地，系列浓度的标准溶液制备方式如下：
(1)标准储备液的配制
精确称取吗氯贝胺标准品置于容量瓶中，用含有0％-70％水的甲醇溶液进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。
(2)标准工作液的配制
取适量步骤(1)中的标准储备液，用含有0％-70％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有1000-30000ng/mL吗氯贝胺的标准工作液，并在-80℃条件下保存。
(3)内标储备液的配制
精确称取内标物吡非尼酮标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶的标线，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。
(4)内标工作液的配制
取适量步骤(3)中的内标储备液，用含有0％-70％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释，得到含吡非尼酮的内标工作液，并在-80℃保存。
(5)标准溶液的标定
分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作液置于离心管中，分别向各个离心管中加入含有0％-70％水的甲醇溶液，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀0.5-1min后，作为标准溶液。
为了保证吗氯贝胺充分溶解，同时为了降低标准储备液和标准工作液反复使用过程中的挥发，确保标准工作液的稳定性，选择含有0％-70％水的甲醇溶液进行溶解和稀释。
为了提高吡非尼酮的溶解性，选择甲醇进行溶解，同时为了降低内标工作液反复使用过程中的挥发，确保内标工作液的稳定性，所以吡非尼酮的稀释液为含有0％-70％水的甲醇溶液。
优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：反相C18色谱柱；
洗脱流动相中的水相包括：含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的水溶液；
洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；
柱温包括20-50℃；流速包括0.3-2.0mL/min。
具体地，色谱柱包括Phenomenex-C18色谱柱，长度为100mm、内径为4.6mm以及填料粒径为5μm的色谱柱；Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，长度为100mm、内径为4.6mm以及填料粒径为3.5μm的色谱柱；Waters XBridge C18，长度为150mm、内径为4.6mm以及填料粒径为5μm的色谱柱。
具体地，针对水相中的含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的水溶液的pH范围包括pH6.5至pH8，比如，pH6.5、pH6.7、pH7、pH7.3、pH7.5、pH7.7以及pH8，其中，洗脱流动相在pH6.7时，则可以含有10mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠的水溶液，如此能够保证目标物的色谱峰峰形较好。
针对柱温来说，20-50℃是指20℃至50℃范围内的任一温度值，比如，20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃以及50℃。
针对流速来说，0.3-2.0mL/min是指0.3mL/min至2.0mL/min范围内的任一流速，比如，0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min以及2.0mL/min。
优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：
洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括：72％:28％-82％:18％。
针对洗脱流动相中的水相与有机相的体积比来说，72％:28％-82％:18％是指72％:28％至82％:18％范围内的任一比例，比如，72％:28％、74％:26％、76％:24％、78％:22％、80％:20％以及82％:18％。
比如，水相的体积占洗脱流动相体积的77％，有机相的体积占洗脱流动相体积的23％；水相的体积占洗脱流动相体积的80％，有机相的体积占洗脱流动相体积的20％。
具体地，当水相在洗脱流动相中体积占比小于72％时，吗氯贝胺和内标物的分离度差，影响吗氯贝胺的检测准确性；当水相在洗脱流动相中体积占比大于82％时，吗氯贝胺出峰时间较晚，会增大吗氯贝胺的检测时间，因此，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比包括72％:28％-82％:18％。
优选地，所述检测条件中的紫外检测条件，包括：
所述液相色谱仪采用紫外检测器，检测波长：230-250nm。
针对紫外检测条件中的检测波长来说，230-250nm是指230nm至250nm范围内的任意值，比如，检测波长可以为230nm、235nm、240nm、245nm以及250nm。
优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中吗氯贝胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中吗氯贝胺的浓度与内标物的浓度的比值。
具体地，若吗氯贝胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的x值(即自变量)时，吗氯贝胺的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)。
若吗氯贝胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)时，吗氯贝胺的浓度与内标物的浓度的比值则为标准曲线方程的x值(即自变量)。
优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的第一上清液进行萃取的萃取剂包括：含有0％-40％甲基叔丁基醚的正己烷。
针对萃取剂来说，0％-40％是指0％至40％范围内的任一值，比如，萃取剂为含有0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％以及40％的甲基叔丁基醚的正己烷。
优选地，为了保证目标物的充分提取，所述第一上清液与所述萃取剂的体积比为1:5-1:15中的任一比例。
针对第一上清液和萃取剂的体积比来说，1:5-1:15是指1:5至1:15范围内的任一比例，比如，1:5、1:6、1:8、1:9、1:10、1:12以及1:15。
具体地，当第一上清液的体积为100μL，那么萃取剂的体积可以是500μL至1500μL范围内的任一值。
优选地，
所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：
向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合0.5-1min；
顺次加入萃取剂，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合8-12min，并在10000-14000rpm的转速下离心8-12min，移取离心后的第二上清液；
利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min，并在10000-14000rpm的转速下离心4-6min，取离心后的第三上清液作为待测样品。
具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可以涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入萃取剂，并涡旋混匀，进行萃取，以通过萃取剂对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于利用萃取剂萃取后目标物的含量较低，且萃取剂与液相色谱仪的检测系统所使用的溶液不兼容，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，复溶液与液相色谱仪的检测系统所使用的溶液相兼容，用该复溶液对萃取剂进行替换，并进行涡旋以使目标物在复溶液中分布均匀。
针对涡旋转速来说，1500-2500rpm是指1500rpm至2500rpm范围内的任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm、2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm以及2500rpm。
针对加入内标物之后的涡旋时间来说，0.5-1min是指0.5min至1min范围内的任一时间，比如，0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、0.9min以及1min。
针对加入萃取剂之后的涡旋时间和离心时间来说，8-12min是指8min至12min范围内的任一时间，比如，8min、9min、10min、11min以及12min。
针对离心转速来说，10000-14000rpm是指10000rpm至14000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm以及14000rpm。
针对加入复溶液之后的涡旋时间来说，0.5-1.5min是指0.5min至1.5min范围内的任一时间，比如，0.5min、0.6min、0.8min、1.0min、1.2min、1.4min以及1.5min。
针对加入复溶液之后的离心时间来说，4-6min是指4min至6min范围内的任一时间，比如，4min、4.5min、5min、5.5min以及6min。
优选地，所述复溶液包括：含有0％-70％水的甲醇溶液。
针对复溶液来说，0％-70％是指0％至70％范围内的任一值，比如，复溶液为含有0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％水的甲醇溶液。
本发明提供了吗氯贝胺的检测方法，通过液相色谱仪对含有不同浓度的吗氯贝胺的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物吡非尼酮，因此，基于各种浓度标准溶液中的吗氯贝胺的浓度、内标物的浓度和多个第一检测结果拟合得到吗氯贝胺的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和萃取剂进行萃取，可以降低杂质对样品检测的干扰，得到能够进行检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下对待测样品进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中吗氯贝胺的含量。由于无需在萃取之前加入碱性溶液、无需进行高温氮气吹干，前处理操作较为简单，因此能够缩短待测样品的检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的吗氯贝胺的检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的待测样品中的吗氯贝胺和内标物的色谱图；
图3是本发明一实施例提供的标准溶液中的吗氯贝胺和内标物的色谱图；
图4是本发明一实施例提供的吗氯贝胺的线性关系图；
图5是本发明一实施例提供的柱温20℃，流速1.0mL/min时的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的柱温50℃，流速1.0mL/min时的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.2mL/min时的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.3mL/min时的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.5mL/min时的色谱图；
图10是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.8mL/min时的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速1.5mL/min时的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速2.0mL/min时的色谱图；
图13是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为87％:13％时的色谱图；
图14是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为82％:18％时的色谱图；
图15是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为72％:28％时的色谱图；
图16是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为67％:33％时的色谱图；
图17是本发明一实施例提供的萃取剂为甲基叔丁基醚时的色谱图；
图18是本发明一实施例提供的萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图；
图19是本发明一实施例提供的萃取剂为二氯甲烷时的色谱图；
图20是本发明一实施例提供的萃取剂为含有50％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；
图21是本发明一实施例提供的萃取剂为含有40％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；
图22是本发明一实施例提供的萃取剂为含有20％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；
图23是本发明一实施例提供的萃取剂为含有10％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；
图24是本发明一实施例提供的萃取剂为正己烷时的色谱图；
图25是本发明一实施例提供的第一上清液和萃取剂的体积比为1:5时的色谱图；
图26是本发明一实施例提供的第一上清液和萃取剂的体积比为1:8时的色谱图；
图27是本发明一实施例提供的第一上清液和萃取剂的体积比为1:12时的色谱图；
图28是本发明一实施例提供的第一上清液和萃取剂的体积比为1:15时的色谱图；
图29是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18时的色谱图；
图30是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters XBridge C18时的色谱图；
图31是本发明一实施例提供的内标物为普萘洛尔时的色谱图；
图32是本发明一实施例提供的内标物为磺胺甲恶唑时的色谱图；
图33是本发明一实施例提供的检测波长为220nm时的色谱图；
图34是本发明一实施例提供的检测波长为230nm时的色谱图；
图35是本发明一实施例提供的检测波长为250nm时的色谱图；
图36是本发明一实施例提供的检测波长为260nm时的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，通常液相色谱仪对待测样品进行检测，待测样品采用抗生素氯霉素作为内标物，但是抗生素氯霉素与吗氯贝胺联合使用会导致定量不准，影响待测样品检测的准确性。
并且，待测样品需要至少500μL，从而使得用户的依从性较差。
并且，待测样品在前处理过程中，在加入萃取剂之前还需要加入碱性溶液(比如，氢氧化钠溶液、饱和碳酸钠溶液、饱和磷酸三钠溶液)，而且萃取后需要在高温水浴中进行氮气吹干，如此则增加了前处理过程的复杂性，增加了整个检测过程中所需的时间，而且分析时间较长，从而导致待测样品中吗氯贝胺整体的检测时间较长。
基于上述问题，本发明实施例提供了吗氯贝胺的检测方法，如图1所示，包括：
步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有吗氯贝胺和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
步骤102：利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中吗氯贝胺的浓度和内标物的浓度，拟合吗氯贝胺的标准曲线方程；
步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；
步骤106：利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中吗氯贝胺的浓度。
在本发明实施例中，通过液相色谱仪对含有不同浓度的吗氯贝胺的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物吡非尼酮，因此，基于各种浓度标准溶液中的吗氯贝胺的浓度、内标物的浓度和多个第一检测结果拟合得到吗氯贝胺的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和萃取剂进行萃取，可以降低杂质对样品检测的干扰，得到能够进行检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下对待测样品进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中吗氯贝胺的含量。由于无需在萃取之前加入碱性溶液、无需进行高温氮气吹干，前处理操作较为简单，因此能够缩短待测样品的检测时间。
下面通过以几个实施例对吗氯贝胺的检测方法进行详细说明。
实施例1：制备系列浓度的标准溶液
(a)标准储备液的配制
精确称取吗氯贝胺标准品1.47mg置于2mL容量瓶中，用含有30％水的甲醇溶液进行溶解，定容至2mL，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。
(b)标准工作液的配制
取适量步骤(a)中标准储备液，用含有30％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有1000-30000ng/mL吗氯贝胺的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
其中，不同浓度的标准工作液为含有吗氯贝胺：1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、6000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL、30000ng/mL的系列溶液。
(c)内标储备液的配制
取吡非尼酮标准品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇溶液进行溶解，并定容至10mL，得到含有1mg/mL吡非尼酮的内标储备液，并在-80℃条件下保存。
(d)内标工作液的配制
取适量步骤(c)中内标储备液，用含有30％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释，得到含10μg/mL吡非尼酮的内标工作液，并在-80℃保存。
(e)标准溶液的标定
用移液器移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μL、步骤(d)中的内标工作液10μL和80μL含有30％水的甲醇溶液分别置于1.5mL离心管中，并分别在转速为2000rpm下涡旋混匀1min，混合制成七种含有不同浓度吗氯贝胺标准品的标准溶液，并且七种标准溶液中的内标物的量相同。
需要说明的是，不同浓度的标准溶液无需按照处理待处理样品时的前处理进行操作，操作更简单，从而缩短了吗氯贝胺的整体检测时间。
实施例2：拟合标准曲线方程
利用液相色谱仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的吗氯贝胺的标准溶液的色谱图。
从上述吗氯贝胺的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中吗氯贝胺和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的吗氯贝胺的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述吗氯贝胺标准溶液中的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。
上述检测条件包括：
色谱柱：Phenomenex-C18，填料粒径5μm，内径为4.6mm，长度为100mm；
洗脱流动相中的水相包括：含有10mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠的水溶液；
洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为77％:23％，分析时间为6min；
柱温为40℃；流速为1.0mL/min，进样量为5μL。
紫外检测条件：
所述液相色谱仪采用UltiMate3000 Variable Wavelength Detector检测器，检测波长：240nm；响应时间：0.6s；采集频率：2Hz。
实施例3：待测样品的处理
3.1取待处理血液至少500μL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
3.2用移液枪移取10μL实施例1中的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，加入萃取剂(含有30％甲基叔丁基醚的正己烷)1000μL后，并在2000rpm的转速下涡旋混合10min后，再在12000rpm的转速下离心10min后，取第二上清液(上层有机相)900μL放入另一支1.5mL离心管中，利用氮气在常温(25℃)下将移取的第二上清液吹干，顺次加入100μL复溶液(含有30％水的甲醇溶液)，在2000rpm的转速下涡旋混合1min，并在12000rpm的转速下离心5min，取离心后的第三上清液作为待测样品。
实施例4：待测样品的检测
利用液相色谱仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中吗氯贝胺的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，将待测样品中的吗氯贝胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1'，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中吗氯贝胺的浓度与内标物的浓度的比值，由于待测样品中的内标物的浓度已知，由此可以计算得到待测样品中的吗氯贝胺的浓度。
实施例5：针对样本前处理和拟合标准曲线方程的说明
本申请例1：
(1)10μL内标工作液+100μL血清或血浆，得到混合液；
(2)加入1000μL萃取剂(含有30％甲基叔丁基醚的正己烷)混匀10min，并离心，得到第二上清液；
(3)取第二上清液900μL，于常温(25℃)下进行氮气吹干，顺次加入100μL复溶液(含有30％水的甲醇溶液)混匀1min，并离心，得到第三上清液作为待测样品。
对比例1：(反相高效液相色谱法测定血浆中吗氯贝胺浓度[J].中国医院药学杂志,2004,24(009):533-534.)
(1)10μL内标工作液+500μL血浆，得到混合液；
(2)顺次加入500μL饱和磷酸三钠溶液(pH为11.0)、5000μL二氯甲烷混匀20min，并离心，得到第二上清液；
(3)取第二上清液3000μL，于80℃水浴中用高纯度氮气吹干，顺次加入200μL复溶液(含有0.067M磷酸二氢钾缓冲溶液的乙腈溶液)混匀，得到第三上清液作为待测样品。
图2为本申请待测样品中吗氯贝胺和内标物的色谱图；图2的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.5；
详见图2，从本申请例1和对比例1可以看出，本发明的样本分析时间为6min，其中吗氯贝胺的保留时间约为5.2min，内标物吡非尼酮的保留时间约为4.4min，相较于对比例1的分析时间10min更短。而且本发明的样品使用量仅为对比例样本使用量的20％，更加符合科学伦理道德标准，使得待测人员依从性更高；相较于对比例1中加入饱和磷酸三钠溶液(pH为11.0)、和高温氮气吹干的前处理方式，本申请节省了饱和磷酸三钠溶液的配置时间，减少了试剂配制过程的误差，同时本申请使用溶剂的用量更少，对环境更友好；且无需进行高温氮气吹干，因此本申请的前处理操作更简单，耗费时间更短，因此缩短了对待测样品的检测时间。
对比例1中在拟合标准曲线方程时，还需要分别在10μL不同浓度的标准溶液中加入未含有吗氯贝胺的空白血浆0.5mL和10μL内标溶液，并按照上述对比例1中的前处理方式进行操作，以对标准溶液中的吗氯贝胺进行测定。
从实施例1和实施例2中可以看出，本实施例在拟合标准曲线方程时，无需加入未含有吗氯贝胺的空白血清或空白血浆，在无需对标准溶液进行前处理操作，简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。
实施例6：吗氯贝胺的检测方法的检测限和定量限
制备不同浓度的吗氯贝胺低浓度标准溶液，分别加入10μL内标工作液，加入10μL各个浓度的吗氯贝胺低浓度标准溶液和90μL空白样本(比如，未含有吗氯贝胺的血清或血浆)，从而制备得到不同浓度的样本，按本实施例3中的前处理及实施例2中的检测条件进行测定，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的混合液对浓度低的混合液产生影响。吗氯贝胺的检测限和定量限如下述所示，加标浓度见下述表1所示。
表1
加标浓度(ng/mL)
10
15
20
25
30
40
45
50
55
60
信噪比
1.5
2.0
4.2
4.5
4.6
5.1
7.6
9.8
10.0
12.1
其中，以信噪比(S/N)＝10.0作为定量限，以信噪比(S/N)＝4.2作为检测限。
吗氯贝胺
(1)检测限(LOD)：20ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：55ng/mL。
由本实施例可知，吗氯贝胺的检测限及定量限分别为20ng/mL和55ng/mL，灵敏度很高，对吗氯贝胺含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例7：吗氯贝胺的检测方法的线性方程的获得和线性关系
将实施例1中七种不同浓度的标准溶液利用液相色谱仪按照实施例2中的检测条件进行测定，得到各浓度的吗氯贝胺及内标物的色谱图，其中，标准溶液中的吗氯贝胺和内标物的色谱图如图3所示；吗氯贝胺的保留时间约为5.2min，内标物吡非尼酮的保留时间约为4.4min。
图3中的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.5。
确定各色谱峰峰面积，以吗氯贝胺的色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，标准溶液中吗氯贝胺的浓度与内标物色谱峰浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c；线性方程的测定结果见表2，线性方程图见图4。
表2
检测指标
线性范围
线性方程
相关系数
加权
吗氯贝胺-某实施例1
100-3000ng/mL
y2＝0.1937*x2-1.9815
0.9992
1/X<sup>2</sup>
表2为一次实施例中的线性关系数据，由表2可知，吗氯贝胺在100-3000ng/mL的线性范围内，相关系数R＞0.9900，线性关系良好。
实施例8：吗氯贝胺的检测方法的回收率和精密度
取实施例1中吗氯贝胺标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，吗氯贝胺的回收率和精密度如表3所示。吗氯贝胺在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为100.63％～102.33％，精密度为0.83％～1.96％。
表3
综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中吗氯贝胺浓度，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
由图2和图3可见，待测样品中的吗氯贝胺的保留时间与其标准溶液中的吗氯贝胺的保留时间一致，该方法以吡非尼酮为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
实施例9：针对流速和柱温的说明
图5至图12分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同。
图5为柱温20℃，流速1.0mL/min时的色谱图，图5的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.25；图5中保留时间约为4.7min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.25min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图6为柱温50℃，流速1.0mL/min时的色谱图，图6的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.25；图6中保留时间约为4.3min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.0min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图7为柱温40℃，流速0.2mL/min时的色谱图，图7的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为0.5；图7中无内标物和吗氯贝胺的色谱峰；
图8为柱温40℃，流速0.3mL/min时的色谱图，图8的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为0.5；图8中保留时间约为14.8min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为17.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图9为柱温40℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图9的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5；图9中保留时间约为8.9min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为10.4min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图10为柱温40℃，流速0.8mL/min时的色谱图，图10的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.5；图10中保留时间约为5.7min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为6.5min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图11为柱温40℃，流速1.5mL/min时的色谱图，图11的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.5；图11中保留时间约为3.0min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为3.4min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图12为柱温40℃，流速2.0mL/min时的色谱图，图12的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.5；图12中保留时间约为2.3min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.6min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰。
通过图2以及图5至图12可见，流速在1.0mL/min，柱温在20℃至50℃范围内时，吗氯贝胺的保留时间在4.3min至4.7min之间，内标物的保留时间均约为5.0min至5.25min，柱温对吗氯贝胺和内标物的保留时间影响较小，但是柱温较高则会影响色谱柱寿命，因此，对于吗氯贝胺和内标物检测时的柱温范围设置在20℃至50℃，以使目标物的保留时间相对最短。
由于流速小于0.3mL/min时会使得吗氯贝胺和内标物的保留时间增加，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性。而流速大于2.0mL/min时，内标物出峰较早，保留时间较短，存在受基质干扰的风险，同时流速过大会使柱压升高，超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆的损伤。
实施例10：针对洗脱流动相的说明
图13至图16分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应的平行试验，区别为洗脱流动相中的水相与有机相的体积比不同。
图13为洗脱流动相中水相与有机相体积比为87％:13％时的色谱图，图13的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为0.5；图13中保留时间约为17.5min的色谱峰为内标物的色谱峰，无吗氯贝胺的色谱峰；
图14为洗脱流动相中水相与有机相体积比为82％:18％时的色谱图，图14的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5；图14中保留时间约为8.0min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为10.4min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图15为洗脱流动相中水相与有机相体积比为72％:28％时的色谱图，图15的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.25；图15中保留时间约为3.2min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为3.5min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图16为洗脱流动相中水相与有机相体积比为67％:33％时的色谱图，图16的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.5；图16中保留时间约为2.5min的色谱峰为内标物和吗氯贝胺重合所得的色谱峰。
通过图2、图13至图16可见，水相在洗脱流动相中体积占比大于82％时，会使得吗氯贝胺的保留时间增大，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性；而水相在洗脱流动相中体积占比小于72％时，会导致吗氯贝胺和内标物的分离度较差，甚至重合，从而影响待测样品的检测准确性。
实施例11：针对萃取剂的说明
图17至图24对应的试验是与实施例3和实施例4相对应的平行试验，区别为萃取剂的不同。图17至图24中的横坐标的单位长度均为0.25，纵坐标的单位长度均为0.5。
图17是萃取剂为甲基叔丁基醚时的色谱图；图17中保留时间约为4.5min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.25min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图18是萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图；图18中保留时间约为4.5min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.25min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图19是萃取剂为二氯甲烷时的色谱图；图19中保留时间约为4.5min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.25min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图20是萃取剂为含有50％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；图20中保留时间约为4.4min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图21是萃取剂为含有40％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；图21中保留时间约为4.4min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图22是萃取剂为含有20％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；图22中保留时间约为4.4min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图23是萃取剂为含有10％甲基叔丁基醚的正己烷时的色谱图；图23中保留时间约为4.4min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图24是萃取剂为正己烷(即含有0％甲基叔丁基醚的正己烷)时的色谱图；图24中保留时间约为4.4min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰。
通过图2、图17至图24可见，萃取剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷以及含有50％甲基叔丁基醚的正己烷时，内标物的色谱峰受杂质峰影响，影响待测样品的检测准确性。当萃取剂为含有0％-40％甲基叔丁基醚的正己烷时，内标物的色谱峰和吗氯贝胺的色谱峰分离度良好，且无杂质干扰，因此含有0％-40％甲基叔丁基醚的正己烷均可以用于本实施例中的萃取剂。
实施例12：针对萃取剂的体积的说明
图25至图28对应的试验是与实施例3和实施例4相对应的平行试验，区别为萃取剂的体积的不同。图25至图28中的横坐标的单位长度均为0.25，纵坐标的单位长度均为0.5，图25至图28中保留时间约为4.4min的色谱峰均为内标物的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰均为吗氯贝胺的色谱峰。
图25是第一上清液和萃取剂的体积比为1:5时的色谱图；
图26是第一上清液和萃取剂的体积比为1:8时的色谱图；
图27是第一上清液和萃取剂的体积比为1:12时的色谱图；
图27是第一上清液和萃取剂的体积比为1:15时的色谱图。
通过图2、图25至图28可见，当第一上清液和萃取剂的体积比为1:5、1:8、1:12、1:15时，均能够充分提取待处理样品中的内标物和吗氯贝胺，因此在本发明实施例中第一上清液和萃取剂的体积比包括1:5-1:15。
实施例13：针对色谱柱的说明
图29和图30对应的试验是与实施例3和实施例4相对应的平行试验，主要区别为反相C18色谱柱的不同。图29和图30中的横坐标的单位长度均为0.5，纵坐标的单位长度均为0.25。
图29是色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18时的色谱图，其中，色谱柱内径为4.6mm、色谱柱柱长为100mm、填料粒径为3.5μm；图29中保留时间约为6.1min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为7.1min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图30是色谱柱为Waters XBridge C18时的色谱图，其中，色谱柱内径为4.6mm、色谱柱柱长为150mm、填料粒径为5.0μm；图30中保留时间约为7.2min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为8.1min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰。
通过图2、图29和图30可见，利用Phenomenex-C18、Agilent EclipsePlus C18和Waters XBridge C18色谱柱对待测样品进行检测得到的目标物的色谱峰未出现前沿和拖尾的情况，且峰宽也符合检测需求。
实施例14：针对内标物的说明
图31和图32对应的试验是与实施例3和实施例4相对应的平行试验，区别为内标物的不同。
图31是内标物为普萘洛尔时的色谱图，图31的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.25；图31中保留时间约为7.7min的色谱峰为内标物普萘洛尔的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰；
图32是内标物为磺胺甲恶唑时的色谱图，图32的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.5；图32中保留时间约为1.4min的色谱峰为内标物磺胺甲恶唑的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰为吗氯贝胺的色谱峰。
通过图31和图32可见，内标物为普萘洛尔时，普萘洛尔的色谱峰峰形异常，会影响待测样品的检测准确性；内标物为磺胺甲恶唑时，磺胺甲恶唑的保留时间较短，样品基线不平，磺胺甲恶唑的色谱峰易受杂质干扰，从而影响待测样品的检测准确性。
实施例15：针对检测波长的说明
图33至图36对应的试验是与实施例3和实施例4相对应的平行试验，区别为检测波长的不同。图33至图36中的横坐标的单位长度均为0.25，纵坐标的单位长度均为0.5；图33至图36中保留时间约为4.5min的色谱峰均为内标物普萘洛尔的色谱峰，保留时间约为5.2min的色谱峰均为吗氯贝胺的色谱峰。
图33是检测波长为220nm时的色谱图；
图34是检测波长为230nm时的色谱图
图35是检测波长为250nm时的色谱图；
图36是检测波长为260nm时的色谱图。
通过图2、图33至图36可见，当检测波长低于230nm时，吗氯贝胺的信号强度下降，会影响待测样品的检测灵敏度；同样，当检测波长大于250nm时，吗氯贝胺的信号强度下降，会影响待测样品的检测灵敏度。
需要说明的是，图2、图3、图5至图36中的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为信号强度(mAU)，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
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