甘露葡萄糖醛酸多（寡）糖及其硫酸化衍生物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用
阅读说明：本技术 甘露葡萄糖醛酸多（寡）糖及其硫酸化衍生物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 (Application of mannoglucuronosyl polysaccharide (oligo) saccharide and sulfated derivative thereof in preparation of medicine for treating osteoporosis ) 是由 金维华 方秋福 毛根祥 暴一众 张文静 袁航 翁莹政 于 2021-02-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种甘露葡萄糖醛酸多糖或寡糖及其硫酸化衍生物在制备预防或治疗骨质疏松症的药物中的应用。本发明提供的甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物具有极强的抑制破骨细胞分化,可以用于治疗骨质疏松症,毒副作用小,安全有效。(The invention provides application of a mannoglucuronic acid polysaccharide or oligosaccharide and a sulfated derivative thereof in preparing a medicament for preventing or treating osteoporosis. The mannuronic acid poly (oligo) saccharide and the sulfated derivative thereof provided by the invention have extremely strong effect of inhibiting osteoclast differentiation, can be used for treating osteoporosis, have small toxic and side effects, and are safe and effective.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物在制备预防或治疗骨质疏松症的药物中的应用。
背景技术
骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种钙质由骨骼往血液净移动的矿物质流失(demineralization)现象,其特征是骨量低，骨组织退化和骨结构破坏。骨质疏松的机制是骨吸收与骨形成之间的不平衡。目前骨质疏松的治疗药物主要包括骨矿化促进剂、骨吸收抑制药、骨形成促进剂、其他机制类药物和中药。骨吸收抑制剂的主要作用是抑制破骨细胞的分化成熟，减少骨吸收，主要作用于破骨细胞。目前主要应用的骨吸收抑制剂有双膦盐类、降钙素和雌激素。目前应用最为广泛的抗骨质疏松药物，双膦酸盐是焦磷酸盐类似物，其主要通过抑制破骨细胞介导的骨吸收而起作用。它们的特点是与骨骼的亲和力高，骨架内的半衰期长。然而双膦酸盐药物具有严重的不良反应，包括颌骨坏死，胃肠道副作用，肾功能衰竭。鉴于上述描述，亟待一种更加安全、更加有效的药物的出现。
发明内容
为了获得一种更加安全、更加有效的治疗骨质疏松症的药物，本发明提供一种甘露葡萄糖醛酸多糖或寡糖及其硫酸化衍生物在制备预防或治疗骨质疏松症的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种如式(I)或(II)所示的甘露葡萄糖醛酸多糖或寡糖及其硫酸化衍生物制备预防或治疗骨质疏松症的药物中的应用，
式(I)中，各个R’各自独立为H、Na或K中的一种或二种以上，各个R各自独立为H或SO3 -，n为0-40之间的整数；
式(II)中，各个R1各自独立为H、Na或K中的一种或二种以上，各个R2各自独立为H或SO3 -，m为0-40之间的整数。
进一步，所述甘露葡萄糖醛酸多糖或寡糖及其硫酸化衍生物为式(I)所示化合物，式(I)中，各个R’皆为H，n为0、1、2、3或40；优选R为的SO3 -个数为0-15，R为SO3 -的个数为0时，意味着R全部为H。
优选地，式(I)中n为0、1、2，所有R和R’皆为H。特别优选n为0或2。
进一步，所述预防或治疗骨质疏松症的药物为含有式(I)或(II)所示的甘露葡萄糖醛酸多糖或寡糖或硫酸化衍生物和药学可接受的载体和/或赋形剂的组合物。
具体地，所述药学可接受的载体为海藻酸钠微球、脂质体等，所述赋形剂为甘露醇、硬脂酸镁、淀粉、环糊精等。所述预防或治疗骨质疏松症的药物的剂型为注射剂、口服制剂或局部给药制剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物具有极强的抑制破骨细胞分化，可以用于治疗骨质疏松症，毒副作用小，安全有效。
附图说明
图1寡糖的制备过程中酒精洗脱液的凝胶色谱图；
图2甘露葡萄糖醛酸寡糖F1-F4的ESI-MS和HPLC图；a为甘露葡萄糖醛酸二糖(G2)；b为甘露葡萄糖醛酸四糖(G4)；c为甘露葡萄糖醛酸六糖(G6)；d为甘露葡萄糖醛酸八糖(G8)。
图3 Gn的氢谱。
图4 Gn的碳谱。
图5 Gn的二维HMBC谱图。
图6 Gn的二维HSQC谱图。
图7 Gn的二维HHCOSY谱图。
图8 Gn的GPC-HPLC谱图。
图9硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G2S1的ESI-MS图
图10硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G2S2的ESI-MS图
图11硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G4S1的ESI-MS图
图12硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G4S2的ESI-MS图
图13硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G4S3的ESI-MS图
图14硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G6S1的ESI-MS图
图15硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G6S2的ESI-MS图
图16硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G6S3的ESI-MS图
图17部分甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7细胞活性图(A)和形态图(B)
图18部分甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7分化的抑制作用
图19 G2、G4、G6对RAW264.7细胞分化相关基因表达的影响(左：1Day右：3Day)
图20 G2抑制RAW264.7细胞分化相关蛋白表达情况
图21 G4抑制RAW264.7细胞分化相关蛋白表达情况
图22 G6抑制RAW264.7细胞分化相关蛋白表达情况
图23不同聚合度甘露葡萄糖醛酸寡糖处理24h后RAW264.7细胞蛋白表达情况
具体实施方式
下面用实施例对本发明进行具体说明，不过本发明并不只限于以下实施案例范围。
实施例1甘露葡萄糖醛酸寡糖的制备
将1kg干海带采用30L蒸馏水100℃下提取3小时，提取液经过过滤，除杂，浓缩后，加乙醇至终浓度为75％沉淀，静置12小时后收集沉淀，沉到经真空干燥得到海带多糖10g。将150g海带多糖样品溶于2.5L质量浓度为4％的硫酸溶液中(料液比为60mg/mL)加热回流5小时，用氢氧化钡固体中和至PH＝6-7，离心，取上清液浓缩至原始体积的五分之一，浓缩液上活性炭柱层析，首先用蒸馏水平衡，然后用100mL 50％-90％乙醇梯度洗脱，将50％-90％乙醇洗脱液浓缩至20mL，蒸去乙醇，直接以碳酸氢铵为流动相上Bio-gel P4柱层析，分离得到六个组分(图1所示)，对上面收集得到的样品进行ESI-MS和HPLC分析(图2所示)。结果进一步确认寡糖的结构。结果显示，F1-F4分别为甘露葡萄糖醛酸八糖(G8)，六糖(G6)，四糖(G4)和二糖(G2)。其结构均符合下图所示的结构式：
其中F1为甘露葡萄糖醛酸八糖(G8)，式中n1＝3，R1为H或者NH4 +；
F2为甘露葡萄糖醛酸六糖(G6)，式中n1＝2，R1为H或者NH4 +；
F3为甘露葡萄糖醛酸四糖(G4)，式中n1＝1，R1为H或者NH4 +；
F4为甘露葡萄糖醛酸二糖(G2)，式中n1＝0，R1为H或者NH4 +；
实施例2甘露葡萄糖醛酸多糖的制备
将实施例1中的得到海带多糖150g溶于2.5L质量浓度为4％的硫酸溶液中(料液比为60mg/mL)加热回流4小时，用固体氢氧化钡中和至PH＝6-7，离心，上清液浓缩至100ml，浓缩液上DEAE Sepharose Fast Flow分离，分别采用2L水洗，2L 0.2M氯化钠水溶液和2L 2M氯化钠水溶液洗脱，2M氯化钠水溶液浓缩至100ml，通过500Da透析袋透析，浓缩至50ml，冷冻干燥制备得到甘露葡萄糖醛酸多糖Gn(7.0kDa)，将Gn进行1H-NMR，13C-NMR，二维NMR和GPC-HPLC(图3-图8所示)。结果进一步确认甘露葡萄糖醛酸多糖的结构。其结构均符合下图所示的结构式：
其中Gn为甘露葡萄糖醛酸多糖，式中n1≈40，R1为H；
实施例3硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G2S1的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖二糖G2(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入3.30g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G2S1。质谱(如下图9)结果显示G2S1为GlcAMan(SO3H)3-6。
实施例4硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G2S2的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖二糖G2(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入1.80g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G2S2。质谱(如下图10)结果显示G2S2为GlcAMan(SO3H)1-3。
实施例5硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G4S1的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖四糖G4(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入3.54g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G4S1。质谱(如下图11)结果显示G4S1为GlcA2Man2(SO3H)8-11。
实施例6硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G4S2的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖四糖G4(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入2.19g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G4S2。质谱(如下图12)结果显示G4S2为GlcA2Man2(SO3H)5-9。
实施例7硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G4S3的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖四糖G4(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入0.93g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G4S3。质谱(如下图13)结果显示G4S3为GlcA2Man2(SO3H)1-5。
实施例8硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G6S1的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖六糖G6(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入2.85g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G6S1。质谱(如下图14)结果显示G6S1为GlcA3Man3(SO3H)8-15。
实施例9硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G6S2的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖六糖G6(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入2.09g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G6S2。质谱(如下图15)结果显示G6S2为GlcA3Man3(SO3H)4-10。
实施例10硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖G6S3的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖六糖G6(1g)在氮气保护条件下溶于20mLDMF(0.05g/ml)中，再加入1.17g三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，2M氢氧化钠中和，Sephadex G10脱盐。将洗脱液浓缩，以0.2M碳酸氢铵为流动相，Bio-gel P4分离纯化，浓缩，冷冻干燥得到G6S3。质谱(如下图16)结果显示G6S3为GlcA3Man3(SO3H)1-6。
实施例11甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7细胞活性及形态的影响
本研究将上述实施例1-10中的甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物用于检测对RAW264.7细胞活性及形态的影响，共设置了5个不同浓度处理RAW264.7细胞48h，随后采用MTT法检测RAW264.7细胞活力。结果如图17所示，部分甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7细胞活性及形态无明显影响。
实施例12甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7细胞分化的影响
通过TRAP染色实验来检测经过不同甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物处理后RAW264.7细胞分化为破骨细胞的程度，结果如图18所示。其中，G2和G6对破骨细胞分化均有浓度依赖的抑制作用，硫酸化G6对OC抑制作用较低，G6S1在高浓度时对破骨细胞分化有抑制效果，与非硫酸化寡糖相比，硫酸化寡糖抑制破骨细胞分化的效果不明显，因此得出结论，非硫酸化的寡糖具有更好的抑制破骨细胞分化的能力。
实施例13甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7细胞分化过程中特异性表达基因的影响
选择G2、G4、G6用于探究不同聚合度对RAW264.7细胞分化过程中特异性表达基因的影响，上述药物处理1天和3天后，提取总RNA进行荧光定量PCR检测，如图19所示，G2、G4、G6对RAW264.7分化过程中Trap、c-Fos、NFATc1、DC-Stamp、ATP60基因的表达均有浓度依赖性抑制。同时，在相同浓度下，不同聚合度寡糖对RAW264.7基因表达的抑制作用不同。
实施例14甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7细胞分化过程中短期蛋白表达的影响
将RAW264.7细胞在6孔板最初培养24h后，将α-MEM完全培养基换成无血清培养基进行饥饿处理6h；随后用浓度为50μg/mL的不同聚合度寡糖处理2h，然后更换含有终浓度为50ng/mL的RANKL的培养基分别处理0min、5min、15min、30min，提取RAW264.7细胞总蛋白进行Western Blot实验，如下图20-22所示，在5min时，RANKL以最大水平刺激IκB的磷酸化，然后在15-30分钟内P-IκB退化，不同聚合度寡糖处理均可延缓RANKL诱导的IκB磷酸化，说明寡糖能够抑制转录因子NF-κB的激活。同时，G4处理后ikkα和ERK1/2的磷酸化被缓解。
实施例15甘露葡萄糖醛酸多(寡)糖及其硫酸化衍生物对RAW264.7细胞分化过程中24h蛋白表达的影响
将RAW264.7细胞在6孔板最初培养24h后，更换含有50ng/mL RANKL和不同聚合度甘露糖葡萄糖醛酸寡糖的α-MEM完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养24h，提取RAW264.7细胞总蛋白进行Western Blot实验。如下图23所示，RAW264.7细胞在RANKL刺激后，IRF-8的表达显著下降，而加入药物G4、G6后，IRF-8的表达量上升，同时甘露糖葡萄糖醛酸寡糖寡糖处理后均能够抑制AKT磷酸化，进而抑制NFATc1蛋白的表达，最终抑制破骨细胞的分化。
破骨细胞的过度分化或功能的过度发挥在骨质疏松症和类风湿性关节炎等骨病发病机理中的关键作用。在本专利研究中，我们研究了G2、G4、G6甘露葡萄糖醛酸寡糖能否在体外减弱或抑制由核因子κB受体活化因子配体(RANKL)刺激的破骨细胞形成及其涉及的分子机制，通过Trap染色实验我们发现，G2、G6均能够抑制破骨细胞的分化，然而硫酸化G2、G6对破骨细胞分化抑制效果不明显；我们通过q-PCR及Western Blot实验探究其分子机制，发现G2、G4、G6均能够浓度依赖性抑制破骨细胞分化过程中相关特异性表达基因的表达，如Trap、NFATc1、c-Fos、DC-Stamp、ATP60；Western-Blot实验验证了G2、G4、G6均能够通过抑制NF-κB信号通路中IkB的磷酸化\AKT磷酸化和抑制细胞分化过程中IRF-8因子的降解从而抑制NFATc1蛋白的表达,最终抑制RAW264.7细胞分化成破骨细胞。
以上描述了本发明的具体实施例，然并非用以限定本发明，本领域技术人员对在此公开的实施方案课进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
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