生物活性多肽及其应用
阅读说明：本技术 生物活性多肽及其应用 (Bioactive polypeptide and application thereof ) 是由 沈陈超 濮云飞 雷相和 赵启超 郑蔚 于 2021-02-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及蛋白领域,特别涉及生物活性多肽及其应用。本发明提供的生物活性多肽KLQP具有较好的抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复的活性；一方面可以提高细胞的抗氧化能力,抵抗自由基的氧化损伤,增强机体抵抗外源刺激的能力；另一方面,能够促进细胞抵抗环境不利因素的能力,从而增强机体抵抗衰老的能力；最后,能提高组织在发生损伤后的自我修复能力；上述有益效果,对开发具有抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复功能的食品、保健品、药物、化妆品或医疗器械具有十分重要的意义。(The invention relates to the field of protein, in particular to bioactive polypeptide and application thereof. The bioactive polypeptide KLQP provided by the invention has good activities of resisting oxidation and aging and promoting tissue damage repair; on one hand, the antioxidant capacity of cells can be improved, the oxidative damage of free radicals can be resisted, and the capacity of resisting exogenous stimulation of an organism can be enhanced; on the other hand, the cell can be promoted to resist environmental adverse factors, so that the aging resistance of the body is enhanced; finally, the self-repairing capacity of the damaged tissues can be improved; the beneficial effects are of great significance to the development of foods, health products, medicines, cosmetics or medical appliances with the functions of resisting oxidation and aging and promoting the tissue damage repair.)
技术领域
本发明涉及蛋白领域，特别涉及生物活性多肽及其应用。
背景技术
近年来随着经济的发展和生活水平的提高，人们越来越注重自身健康和保养自己的皮肤，一直以来，美容和抗衰老制剂以及相关衍生的美容化妆品、保健品、食品都备受市场青睐。
自从生活活性多肽物质被发现，特别是已经验证与皮肤组织细胞生理活动相关的活性多肽，人们对多肽的研究和应用不断深入，证实了其在美容、护肤保健、抗衰老等领域具有积极的作用和重要的价值。
生活活性多肽的有效性和分子量的大小显著相关，分子量较大的蛋白质和多肽难以渗透皮肤组织或被人体直接吸收，从而无法真正发挥作用。而分子量在100-1000Da之间的寡肽，具备高渗透性、高生物活性、低免疫源性等特点，能渗透角质层、真皮层、粘膜层等人体屏障被人体所吸收，起到美容、抗衰老、促进损伤修复等功效。
衰老是一种自然现象，且与细胞凋亡、抗氧化水平、器官组织自我修复能力等有关。抗衰老多肽作为近年来新兴的抗衰老剂，研究人员利用细胞模型、模式生物等，发现其在抗氧化功能及自由基的清除、抵抗细胞凋亡、加快器官组织修复及屏障结构与功能的重建等方面起显著作用，以延缓衰老。
发明内容
有鉴于此，本发明针对自然界的一些多肽进行筛选和改进，提供一类多肽能显著提升细胞抗衰亡能力和抗氧化功能，同时能促进伤口愈合。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一类多肽，所述多肽具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有90％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述多肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列至少有95％同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述多肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列至少有98％同源性的氨基酸序列。
在上述基础上，本发明还提供了编码所述多肽的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列。
本发明还提供了所述多肽的制备方法，包括化学合成或通过基因工程的方法合成。
更重要的是，本发明还提供了所述多肽在制备抗氧化、抗衰老的食品、药物或化妆品中的应用。
本发明还提供了所述多肽在制备促进组织损伤修复的药品、化妆品或医疗器械中的应用。
基于上述研究，本发明还提供了药品，包括所述多肽以及药学上可接受的辅料。
此外，本发明还提供了食品，包括所述多肽以及食品中可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了化妆品，包括所述多肽以及化妆品中可接受的助剂。
本发明还提供了医疗器械，包括所述多肽以及可接受的载体。
本发明提供的生物活性多肽KLQP具有较好的抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复的活性；一方面可以提高细胞的抗氧化能力，抵抗自由基的氧化损伤，增强机体抵抗外源刺激的能力；另一方面，能够促进细胞抵抗环境不利因素的能力，从而增强机体抵抗衰老的能力；最后，能提高组织在发生损伤后的自我修复能力；上述有益效果，对开发具有抗氧化、抗衰老、促进组织损伤修复功能的食品、保健品、药物、化妆品或医疗器械具有十分重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同多肽浓度对细胞存活率的影响；
图2示不同多肽浓度对相对细胞活性的影响；
图3示小鼠创面损伤愈合效果。
具体实施方式
本发明公开了生物活性多肽及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明第一方面，提供一种生物活性多肽KLQP，其氨基酸序列为Lys-Leu-Gln-Pro。
本发明第二方面，提供了编码所述生物活性多肽KLQP的核苷酸片段，其序列为：AAGCTGCAGCCC。
本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽KLQP的制备方法，可以直接通过化学合成制备，也可以通过基因工程的方法人工合成。
本发明的第四方面，提供了所述生物活性多天KLQP在制备具有抗氧化功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽KLQP在制备同时具有抗衰老功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
本发明第六方面，提供了所述生物活性多肽KLQP在制备具有促进组织损伤修复功能的药品、化妆品、医疗器械中的应用。
具体而言，本发明的生物活性多肽KLQP可以用于制备减少自由基对皮肤伤害、抗氧化、抗衰老的化妆品，制备具有抗氧化和/或抗衰老的药物，制备具有促进促织损伤修复功能的医疗器械、化妆品、药物；并且本发明的生物活性多肽KLQP通过胃肠道消化或吸收后仍具有生物活性，因此可以用于制备食品、保健品，以及口服的具有抗氧化和/或抗衰老的药物。
本发明第七方面，提供了一种抗氧化、抗衰老、促进促织修复功能的生物活性多肽KLQP或所述的生物活性多肽KLQP的衍生物；所述的抗氧化、抗衰老、促进促织损伤修复功能的产品包括食品、保健品、药物、化妆品或医疗器械；所述生物活性多肽KLQP的衍生物，是指在生物活性多肽KLQP的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰得到的多肽衍生物。
本发明发现了一种生物活性多肽，能显著提升细胞抗衰亡能力和抗氧化功能，同时能促进组织损伤修复。
本发明提供的生物活性多肽及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1活性多肽的人工合成：
1、称取Wang树脂3g于150mL的反应器中，分别加入三倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)和一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃30min，脱去树脂上的Fmoc保护基团，脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤3次然后抽干。
2、称取脯氨酸Pro适量和1-羟基苯并三唑(HOBT)于离心管中，加入20mL的DMF将其溶解，然后加入3mL的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)震荡摇匀1min，30℃反应1h。
3、1小时后用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐：DIEA:DIC＝1:1:2，v:v:v)。
4、分别加入三倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)和一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃30min，脱去树枝上的Fmoc保护基团，脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤3次然后抽干。
5、称取第二个氨基酸适量和1-羟基苯并三唑(HOBT)于离心管中，加入20mL的DMF将其溶解，然后加入3mL的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)震荡摇匀1min，30℃反应1h。
6、待完全反应后，用DMF洗涤树脂3次并抽干，反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃30min，脱去树枝上的Fmoc保护基团，脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤3次然后抽干。
7、按照5-6的步骤依次连接上氨基酸Gln、Leu和Lys。
8、待最后一个氨基酸连接完成后，脱去保护，DMF洗涤三次抽干。然后用切割液(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95:2.5:2.5，v：v：v)将多肽从树脂上切割下来。
至此，完成生物活性多肽KLQP的人工合成。
实施例2抗氧化测试：
细胞实验：
1、将Hacat细胞接种到含10％FBS 1640培养基的6cm细胞培养皿中，当细胞密度达到80％时，进行细胞传代；
2、Hacat细胞采用胰酶消化计数，使用含血清浓度为10％的1640培养基稀释成2×104/ml。在96孔板中，每孔接种90μL。
3.实验分为7组，其中1组空白对照组(不添加挂氧化氢和生物活性肽KLQP)，设置生物活性多肽KLQP浓度梯度组6组，分别为0nM、0.125nM、0.25nM、0.5nM、1nM和2nM与细胞进行孵育，总体积为100μL.
4.18h后，每孔加入10ul浓度为1.5Mm过氧化氢溶液，培养基中继续孵育18h后，显微镜进行拍照和台盼蓝染色后进行细胞活细胞和死细胞计数。
细胞存活率测定：细胞存活率＝存活细胞数量/总细胞数量×100％。计量资料的结果均表示为均值±标准差，采用组间t检验。统计所有软件为SPSS17.0，P＜0.05，具有显著性差异。
结果：如图1、表1所示。
表1不同多肽浓度添加细胞存活率
存活率(％)
空白对照组
96.77±1.78
0nM
2.63±1.52
0.125nM
3.63±1.56
0.25nM
11.13±1.45**
0.5nM
13.03±2.03**
1nM
17.70±2.56***
2nM
27.23±4.59***
注：t检验，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001(与0nM组比较)
由图1、表1可以看出，当生物活性多肽KLQP添加浓度为0.25nM以上时，细胞的存活率与不添加生物活性多肽KLQP的组别相比具有显著差异，2nM添加组较0nM添加组细胞存活率提升24.6％，且随着生物活性多肽KLQP浓度的升高，细胞存活率也随之升高。
实施例3抗衰老测试：
细胞抗凋亡实验：
1、将Hacat细胞接种到含10％FBS 1640培养基的6cm细胞培养皿中，当细胞密度达到80％时，换成无血清培养基培养。
2、Hacat细胞再无血清培养基培养24h后，胰酶消化计数，使用含0.25％FBS 1640培养基稀释成2×104/ml。在96孔板中，每孔接种90uL。
3.设置多肽浓度梯度分别为0nM、0.125nM、0.25nM、0.5nM、1nM和2nM与细胞进行孵育，总体积为100μL。
4.测试采用CCK-8试剂盒，具体可参见Hao Y(Hao Y，2019)、Cai Y(Cai Y，2019)等方法；48h后，每孔加入10ul CCK-8反应液，培养基中继续孵育3h后，测定波长＝450nm处每孔的吸光度值。
5.以0nM处的吸光度值为标准设定为100％，计算其他各浓度处理条件下吸光度值。计量资料的结果均表示为均值±标准差，采用组间t检验。统计所有软件为SPSS17.0，P＜0.05，具有显著性差异。
表2不同多肽浓度下相对细胞活性
相对细胞活性(％)
0nM
99.99±11.77
0.125nM
107.84±7.46
0.25nM
114.57±6.96
0.5nM
118.86±4.56
1nM
122.01±2.04**
2nM
119.85±0.79**
注：t检验，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001(与0nM组比较)
由图2可以看出，当生物活性多肽KLQP的添加浓度达到1nM以上时，细胞的相对活性为122％，较0nM添加组相对细胞活性提高22.02％，且随着生物活性多肽KLQP浓度的升高，细胞相对活性也随之提高。
实施例4测试对皮肤的修复功能：
创面愈合测试：
动物实验：选择体重为25-30g的健康雌性昆明小鼠90只，分为3组，每组30只，各组之间无统计学差异，直到实验结束没有小鼠死亡。
对照组设置2组，对照组1:空白对照组(不造模)；对照组2：生理盐水-康复新液对照组(造模)；实验组3：采用1nM的多肽修复液(KLQP)。
小鼠创面损伤：小鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠(0.1ml/20g)麻醉小鼠。然后将小鼠背部毛剃除干净，并用碘伏消毒，最后在小鼠背部两侧用凿孔器凿出两个大小对称的孔，约8mm×8mm大小。术后将小鼠放在加热器旁待其醒后放回饲养室正常饲养。
效果测试：全程皮肤切除当天即进行治疗。每天涂抹两次，每孔每次点滴上样约20μL。实验组3小鼠背部左侧涂生理盐水，右侧多肽修复液(1nM)；对照组2小鼠背部左侧涂生理盐水，右侧康复新液。每隔3天给小鼠背部创伤拍照，计算创伤修复率。
创面愈合率测定：每隔一天用游标卡尺测量小鼠创面的大小，计算创面的愈合率，创面愈合率＝(治疗前创面大小-治疗后创面大小)/治疗前创面大小×100％。
计量资料的结果均表示为均值±标准差，采用组间t检验。统计所有软件为SPSS17.0，P＜0.05，具有显著性差异。
结果：涂抹第3天和第7天，与生理盐水对照组相比，治疗组创面面积均有不同程度的缩小。结果如表3所示：
表3各组不同时间创面愈合率
第3天创面愈合率(％)
第7天创面愈合率(％)
对照组1
N.D
N.D
对照组2(左侧-生理盐水)
18±1.23
41±1.12
对照组2(右侧-康复新液体)
25±0.77*
68±0.96*
实验组3(左侧-生理盐水)
19±1.12
39±1.07
实验组3(右侧-多肽修复液)
29±0.77*
79±0.96**
注：t检验，*：P＜0.05,**：P＜0.01(与生理盐水处理比较)；N.D：not detect
可见，相比较生理盐水处理组，实验组3多肽修复液对创面愈合具有明显的促进效果，修复效果与康复新液效果相当。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江华缔药业集团医药开发有限公司
<120> 生物活性多肽及其应用
<130> MP2037232
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Leu Gln Pro
1
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagctgcagc cc 12
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