用于制备凝血酶的方法
阅读说明：本技术 用于制备凝血酶的方法 (Process for the preparation of thrombin ) 是由 L·韦斯曼 D·塞拉 I·诺尔 江彩霞 安宝昌 于 2015-02-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及使用给定BaSO-4试剂作为凝血酶原的吸附剂,由凝血酶原来源生产凝血酶的方法,以及评估给定BaSO-4试剂用于制备凝血酶的适合性的方法。在至少一个实施例中,该方法包括使给定BaSO-4试剂的样品与凝血酶原来源接触,以获得BaSO-4吸附的凝血酶原,并且随后评估BaSO-4吸附的凝血酶原的促凝活性。在另一个实施例中,该方法包括相对于正常哺乳动物血浆的促凝活性评估的步骤。(The invention relates to the use of a given BaSO 4 Reagents as adsorbents for prothrombin, methods for producing thrombin from prothrombin sources, and evaluation of given BaSO 4 Reagents for use in a suitable method of preparing thrombin. In at least one embodiment, the method includes causing a given BaSO 4 Contacting a sample of the reagent with a source of prothrombin to obtain BaSO 4 Adsorbed prothrombin, and subsequent evaluation of BaSO 4 Procoagulant activity of the adsorbed prothrombin. In another embodiment, the method comprises the step of assessing procoagulant activity relative to normal mammalian plasma.)
本申请是申请日为2015年02月06日、申请号为201510064089.2、名称为“用于制备凝血酶的方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及凝血酶生产领域，并且更具体而言，涉及评估给定BaSO4试剂用作凝血酶制备中的凝血酶原吸附剂的适合性的方法。
背景技术
凝血酶是通过催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白而促进血液凝固的丝氨酸蛋白酶。凝血酶还负责活化血小板并且通过多重蛋白酶解反馈机制间接负责其自身生产和抑制的调节。凝血酶还涉及因子VIII、因子V、因子XI、因子XIII和蛋白质C的活化。凝血酶作为凝血因子而广泛用于临床应用中，通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白来止住伤口的出血。凝血酶是外科敷料的常见组分，并且已与纤维蛋白原及其他凝血蛋白质组合用于二组分止血系统诸如纤维蛋白胶、粘合剂和密封剂中。
凝血酶通过前体(酶原)凝血酶原的蛋白酶解活化而产生。为了产生凝血酶，凝血酶原必须在两个位点处被切割，生成中间产物。凝血酶原在体内转化为凝血酶通过凝血酶原酶复合物催化，所述凝血酶原酶复合物包括活化的因子X和因子V，并且在钙离子的存在下在带负电的磷脂膜上装配。
凝血酶可通过使凝血酶原来源(诸如血浆或血液级分)与固体吸附剂接触由凝血酶原进行制造，所述固体吸附剂能够吸附来自凝血酶原来源的凝血酶原，例如硫酸钡(BaSO4)。固体吸附剂通常使用洗涤溶液进行洗涤，以去除污染物诸如未结合的蛋白质，并且随后使用洗脱溶液由其洗脱凝血酶原。在另外的任选纯化和加工步骤后，洗脱的凝血酶原可通过使用活化剂例如钙离子活化而转化为凝血酶。
据报道当使用不同BaSO4试剂，诸如得自不同制造商的BaSO4试剂，或甚至由特定制造商生产的不同试剂批次时，在来自给定体积的凝血酶原来源的凝血酶得率中存在显著差异。
在报道中已提出凝血酶得率中的差异至少部分可归于通过不同BaSO4试剂的凝血酶原吸附中的变化，并且吸附能力是选择BaSO4试剂用于凝血酶原吸附的关键因素。Surgenor和Neortker(1952)陈述某些BaSO4试剂在吸附来自血浆的凝血酶原方面比其他试剂更有效，而Voss D.(1965)注意到当使用不同BaSO4试剂用于吸附凝血酶原复合物时，在吸附相同量的凝血酶原复合物所需的BaSO4量中发现显著差异，并且推测这是由于其晶体结构中的差异。然而，在本申请人的情况下，已测试了不同BaSO4批次的形态，并且未测定到显著差异。另外，一些离子例如Ca2+据报道促成对于不同BaSO4批次的不同吸附率，并且在本文情况下，在不同BaSO4批次中Ca2+的存在也没有显著不同。
凝血酶制造商尝试通过借助于试误法从多重不同BaSO4试剂中选择合适的BaSO4试剂来增加凝血酶得率。
发明内容
本发明在其一些实施例中涉及使用给定BaSO4试剂作为凝血酶原的吸附剂，由凝血酶原来源生产凝血酶的方法，以及通过下述评估给定BaSO4试剂用于制备凝血酶的适合性的方法：使给定BaSO4试剂与凝血酶原来源接触，以获得BaSO4吸附的凝血酶原，并且在一些实施例中，相对于正常哺乳动物血浆的促凝活性，评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性。
接触在本文中以其最广泛的含义使用，并且指任何类型的组合动作，所述组合动作例如使凝血酶原来源与BaSO4达到足够紧密的接近，使得在BaSO4和来源中的凝血酶原之间将发生结合相互作用。接触包括但不限于将来源混合、掺合和/或加入BaSO4内，或将BaSO4加入来源内。
在本发明中，惊讶地发现凝血酶原与一些BaSO4试剂接触触发转化成凝血酶(即凝血酶原转化成其中间体和/或凝血酶)。据发现这是在生产过程结束时妥协凝血酶得率的过早转化。
在本文描述的方法的一些实施例中，在凝血酶原转化成其中间体和/或凝血酶后出现促凝活性。此类中间体可在凝血酶原至凝血酶的蛋白酶解转化期间形成。中间体的非限制性例子是前凝血酶和间凝血酶(meizothrombin)。
本文描述的方法的一些实施例允许鉴定适合用作凝血酶原吸附剂的BaSO4试剂，优选在使用给定BaSO4试剂作为大规模凝血酶生产过程的一部分的吸附剂之前。
具体地，在一些实施例中，使给定BaSO4试剂的样品与凝血酶原来源接触，以由其吸附凝血酶原，获得BaSO4吸附的凝血酶原，并且随后评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性。通常，BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性越低，给定BaSO4试剂越适合用作凝血酶原吸附剂。在一些实施例中，给定BaSO4试剂用作制备凝血酶过程中的凝血酶原吸附剂的适合性通过BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于正常哺乳动物血浆例如正常人血浆的促凝活性指示。
正常哺乳动物血浆诸如人血浆是众所周知的预期用作各种凝血测试的校准血浆的合并或单一供体血浆制剂。
正常人血浆可以是通过下述获得的无菌血浆：合并例如来自八个或更多个健康成人的全血的液体部分(柠檬酸钾或柠檬酸钠或两者的溶液已加入其中)，并且使其暴露于紫外线以破坏细菌和病毒污染物。
正常人血浆可以是Unicalibrator凝血测试校准血浆00625。
至少在某些情况下，本文描述的方法消除了通过试误法选择合适BaSO4试剂的需要。
本文描述的方法的一些实施例是快速和易于使用的，并且潜在提供了时间和/或生产成本的节省。本文描述的方法的一些实施例允许增加来自给定凝血酶原来源的凝血酶得率。
本发明的方面和实施例在下文说明书和所附权利要求中描述。
根据本文描述的一些实施例的一个方面，本发明提供了使用给定BaSO4试剂作为凝血酶原的吸附剂，由凝血酶原来源制备凝血酶的方法，该方法包括：
a.提供给定BaSO4试剂和凝血酶原来源；
b.在允许来自凝血酶原来源的凝血酶原被给定BaSO4试剂吸附的条件下，使给定BaSO4试剂的样品和凝血酶原来源接触，从而获得BaSO4吸附的凝血酶原；以及
c.评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性，
其中当c.的评估通过比较BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性与正常哺乳动物血浆的促凝活性进行时，给定BaSO4试剂用于制备凝血酶的适合性通过BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于正常哺乳动物血浆的促凝活性指示。
根据进一步方面，本发明提供了使用给定BaSO4试剂作为凝血酶原的吸附剂，由凝血酶原来源制备凝血酶的方法，该方法包括上文的步骤a至c，并且还包括：
d.在允许凝血酶原吸附的条件下，使合适的BaSO4与凝血酶原来源接触；
e.使用洗脱缓冲液，从BaSO4吸附的凝血酶原中洗脱含凝血酶原级分；
f.对洗脱的级分实施允许凝血酶原转化成凝血酶的条件，从而获得凝血酶。
在一些实施例中，该方法包括在步骤“e”后收集洗脱的级分。
在一些实施例中，该方法基本上避免凝血酶原过早转化成凝血酶。“凝血酶原过早转化成凝血酶”意指凝血酶原在步骤“d”时转化成凝血酶。
通常，如本文公开的术语“洗脱”可与术语“解吸”互换使用。
在一个实施例中，在凝血酶制备中允许凝血酶原吸附至BaSO4的条件包括pH 7.4-8.6和/或浓度范围为约1％-22％(w/v)例如约1％的BaSO4。
在一个实施例中，在凝血酶制备期间的洗脱缓冲液包含钙螯合盐诸如浓度为3.0-4.4％(w/v)的柠檬酸钠和/或具有在6.3和7.4之间的pH。
在一个实施例中，允许凝血酶原转化成凝血酶的条件包括对凝血酶原实施活化剂诸如钙离子。
根据本文描述的一些实施例的进一步方面，本发明提供了评估给定BaSO4试剂用于由凝血酶原来源制备凝血酶的适合性的方法，该方法包括：
a.提供给定BaSO4试剂和凝血酶原来源；
b.在允许来自凝血酶原来源的凝血酶原吸附至给定BaSO4试剂的条件下，使给定BaSO4试剂的样品和凝血酶原来源接触，从而获得BaSO4吸附的凝血酶原；
c.评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性，
其中当c.的评估通过比较BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性与正常哺乳动物血浆的促凝活性进行时，给定BaSO4试剂用于制备凝血酶的适合性通过BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于正常哺乳动物血浆的促凝活性指示。
根据本发明的一些实施例的一个方面，本发明提供了使用给定BaSO4试剂作为凝血酶原吸附剂，由凝血酶原来源制备凝血酶的方法，该方法包括：
a.提供给定BaSO4试剂和凝血酶原来源；
b.在允许来自凝血酶原来源的凝血酶原被给定BaSO4试剂吸附的条件下，使给定BaSO4试剂的样品和凝血酶原来源接触，从而获得BaSO4吸附的凝血酶原；以及
c.评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性，在一些实施例中，给定BaSO4试剂用作制备凝血酶过程中的凝血酶原吸附剂的适合性通过BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于正常哺乳动物血浆的促凝活性指示。在一些实施例中，c.的评估通过比较BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性与正常哺乳动物血浆的促凝活性来进行。
根据本发明的一些实施例的进一步方面，本发明提供了用于评估给定BaSO4试剂用作由凝血酶原来源制备凝血酶中的凝血酶原吸附剂的适合性的方法，该方法包括：
a.提供给定BaSO4试剂和凝血酶原来源；
b.在允许来自凝血酶原来源的凝血酶原被给定BaSO4试剂吸附的条件下，使给定BaSO4试剂的样品和凝血酶原来源接触，从而获得BaSO4吸附的凝血酶原；以及
c.评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性。在一些实施例中，给定BaSO4试剂用作制备凝血酶过程中的凝血酶原吸附剂的适合性通过BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于正常哺乳动物血浆的促凝活性指示。在一些实施例中，c.的评估通过比较BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性与正常哺乳动物血浆的促凝活性来进行。
在本文公开的方法的一些实施例中，评估促凝活性包括执行促凝测定。
在本文公开的方法的一些实施例中，促凝测定包括功能测定，诸如选自凝血测定(诸如NAPTT测定、APTT测定、蛋白酶生色测定的功能测定或指示测定(诸如免疫测定)。
在一些实施例中，获得的洗脱物具有不小于0.8的NAPTT比的BaSO4试剂视为适用于制备凝血酶。
在一些实施例中，获得的洗脱物具有0.8或更小的NAPTT比或者立即在视觉上观察到凝块(凝块在钙添加后以及在凝血时间可在凝固剂测量机器中记录之前发生)的BaSO4试剂视为不适用于制备凝血酶。
在本文公开的方法的一些实施例中，凝血酶原来源选自血浆(诸如草酸盐血浆)或血浆级分。在一些此类实施例中，凝血酶原来源包括从哺乳动物(诸如人、马、牛和猪)中收获的血浆。在一些实施例中，凝血酶原来源包括猪血浆。在一些实施例中，凝血酶原来源是重组凝血酶原。在一些实施例中，对凝血酶原来源实施病毒灭活处理。例如，来源是溶剂/洗涤剂(SD)处理的血浆。
“溶剂洗涤剂(SD)病毒灭活处理”通常指通过破坏其脂质包膜而使有包膜病毒或脂质包被病毒灭活的过程。该处理可通过添加洗涤剂(诸如Triton X-45、Triton X-100或聚山梨酸酯80)和溶剂[诸如三(正丁基)磷酸酯(TnBP)、二或三烷基磷酸酯]来进行。用于灭活脂质包被病毒的溶剂-洗涤剂组合可以是本领域已知的任何溶剂-洗涤剂组合，诸如TnBP和Triton X-100；聚山梨酸酯80和胆酸钠以及其他组合。
所用的一种或多种溶剂/一种或多种洗涤剂浓度可以是本领域中常用的那些，例如如US5094960A、US4789545A中所进行的。所用的一种或多种溶剂/一种或多种洗涤剂浓度可以是>0.1％TnBP和>0.1％Triton X-100的组合。所用的一种或多种溶剂/一种或多种洗涤剂浓度可以是1％Triton X-100和0.3％TnBP的组合。然而，其他溶剂/洗涤剂组合和合适的条件将对本领域的任何技术人员显而易见。
在一个实施例中，0.5％Tween-80和0.15％TnBP用于SD处理。pH在7.4-8.6的范围内。使溶液在室温下温育1小时。
在一个实施例中，1％Tween-80和0.3％TnBP用于SD处理。pH在7.4-8.6的范围内。使溶液在室温下温育6小时。
在本文公开的方法的一些实施例中，使给定BaSO4试剂的样品和凝血酶原来源接触包括将约1％至约22％或约1％至约10％(w/v)BaSO4试剂加入凝血酶原来源(例如收获的血浆)中。在一些实施例中，加入约1％(w/v)BaSO4试剂。
在一些实施例中，允许来自凝血酶原来源的凝血酶原被给定BaSO4试剂吸附的条件包括pH 7.4-8.6。在一些实施例中，该条件包括例如在20℃-25℃范围内的室温。
凝血酶原通过BaSO4试剂的吸附可以成批模式或充满BaSO4的柱进行。
在一个实施例中，凝血酶原通过BaSO4的吸附以成批模式在室温下例如在25℃下以pH 7.4-8.6进行2小时。
在本文描述的方法的一些实施例中，评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性是吸附至BaSO4试剂时的BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性。
在一些实施例中，本文公开的方法还包括在“b”之后且在“c”之前，从BaSO4试剂中洗脱BaSO4吸附的凝血酶原中的至少一些；并且其中评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性是洗脱的BaSO4吸附的凝血酶原中的至少一些的促凝活性。在一些此类实施例中，从BaSO4试剂中洗脱BaSO4吸附的凝血酶原中的至少一些包括使BaSO4试剂与pH不小于6.0且不大于7.0的洗脱溶液接触。
在一些实施例中，洗脱溶液的pH不小于6.1，不小于6.2且甚至不小于6.3。在一些实施例中，洗脱溶液的pH不超过6.5，不超过6.6且甚至不超过6.7，或在约pH6.3和6.7之间。在一些实施例中，洗脱溶液的pH在6.3和7.4之间。
在一些实施例中，洗脱溶液包含螯合盐。在一些实施例中，洗脱溶液中的螯合盐浓度为约0.2％(w/v)至约4.4％(w/v)或约3.0％(w/v)至约4.4％(w/v)。在一些实施例中，螯合盐包含柠檬酸钠。在一些实施例中，洗脱溶液中的柠檬酸钠浓度为约0.2％(w/v)至约4.4％(w/v)或约3.0％(w/v)至约4.4％(w/v)。
在一些实施例中，给定BaSO4试剂是包含按(重量/重量)计至少75％(w/w)BaSO4的试剂，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％且甚至至少88％(w/w)BaSO4。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。此外，描述、材料、方法和实例仅是例示性的并且不预期是限制性的。类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明的实践中。
如本文所用，术语“给定BaSO4试剂”指来自指定供应商的指定批次的BaSO4试剂。不同的给定BaSO4试剂因此可以是由不同供应商提供的试剂，或由相同供应商提供的不同试剂批次。
如本文所用，术语“促凝活性”指促进血液凝固。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”及其语法变体应视为指定所述特征、整数、步骤或组分，但不排除一种或多种另外特征、整数、步骤、组分或其组的添加。这些术语涵盖术语“由…组成”和“基本上由…组成”。
如本文所用，不定冠词“一个”和“一种”意指“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”，除非上下文另有明确说明。
如本文所用，术语“约”指±10％。
附图说明
本发明的一些实施例在本文中参考附图进行描述。说明书连同附图使得本发明的一些实施例可如何实践对于本领域普通技术人员显而易见。附图用于例示性讨论的目的，并且不试图显示比本发明的基本理解所需更详细的实施例的结构细节。为清楚起见，附图中描绘的一些物体未按比例绘制。
在附图中：
图1显示了得自大规模的BaSO4吸附的凝血酶原样品的洗脱物的Western印迹分析，所述大规模的BaSO4吸附的凝血酶原样品在使用来自不同供应商的BaSO4试剂的凝血酶生产规模制造期间制备；
图2显示了得自猪血浆的洗脱物的Western印迹分析，所述猪血浆使用来自相同供应商的不同BaSO4试剂批次制备；
图3显示了得自猪血浆的洗脱物的Western印迹分析，所述猪血浆使用来自不同供应商的BaSO4试剂制备。
具体实施方式
本发明在其一些实施例中涉及使用给定BaSO4试剂作为凝血酶原的吸附剂，由凝血酶原来源制备凝血酶的方法，以及通过下述评估给定BaSO4试剂用于制备凝血酶的适合性的方法：使给定BaSO4试剂与凝血酶原来源接触，以获得BaSO4吸附的凝血酶原，并且在一些实施例中，相对于正常哺乳动物血浆的促凝活性，评估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性。
本文教导的原理、用途和具体实施可参考所附说明书得到更好理解。在精读说明书后，本领域技术人员能够实施本发明而无需过度努力或实验。
在详细说明至少一个实施例之前，应当理解本发明不一定在其应用中限制于下述说明书中所示的组分和/或方法的构建和排列的细节。本发明能够具有以各种方式实践或实施的其他实施例。本文采用的措辞和术语用于描述性目的且不应视为限制性的。
实例
材料和方法
材料
提供的是如下表1中所示的BaSO4试剂：
表1：BaSO4试剂
试剂名称
供应商
批号
A
1(药品级)
1
B1
2(药品级)
1
B2
2(药品级)
2
C
3(药品级)
1
D1
4(药品级)
1
D2
4(白色标准级)
1
氯化钠得自Sigma-Aldrich(目录号S1679，分析纯，按重量计至少99.0％)。
柠檬酸三钠二水合物得自Sigma-Aldrich(目录号S1804，分析纯，按重量计至少99.0％)。草酸盐猪血(包括0.25％(w/w)草酸盐溶液)得自Kibbutz Lahav(Israel)的屠宰场。
BaSO4吸附的凝血酶原在凝血酶的大规模生产期间获得(在本文中也称为大规模样品)，其中用于吸附凝血酶原的BaSO4选自上表1中限定的BaSO4试剂A、B1之一。
得自Sigma-Aldrich(目录号P8074，BioXtra，聚乙二醇脱水山梨糖醇单油酸酯)。
三正丁基磷酸酯(TnBP)得自Merck-Millipore(目录号100002，药品级)。
滤器1.2μm得自Sartorius Stedim India Pvt Ltd.(Bangalore,India)(目录号2 300)，并且滤器0.45+0.2μm得自Sartorius Stedim India Pvt Ltd.(目录号300)。
对于凝胶电泳，预铸的聚丙烯酰胺凝胶得自Bio-Rad Laboratories Inc.(微型凝胶4-20％得自目录号：456-1096)。
绵羊抗人凝血酶得自Affinity Biologicals Inc.(Canada)(目录号SAHT-IG)
抗绵羊IgG碱性磷酸酶缀合物得自Sigma-Aldrich(目录号A-5187)。
实例1：溶剂/洗涤剂(SD)病毒灭活血浆的制备
在冰上递送草酸盐猪血。将血液以5,000g(5440rpm)的相对离心力(rcf)和4℃的温度离心15分钟。收集包含血浆的上清液，分成等分试样(300-500ml)且冷冻贮存于-30℃下直至需要时。
对于SD处理血浆(“SD血浆”)的制备，将冷冻贮存的血浆的等分试样在37℃下解冻大约1小时，然后经过1.2μm滤器，随后经过0.45+0.2μm滤器。在pH 7.4-8.6下，加入0.5％Tween-80和0.15％(v/v)TnBP用于SD处理。将溶液在室温下搅拌1小时，并且pH监控在7.4-8.6下。
实例2：由猪SD血浆制备实验室规模的BaSO4吸附的凝血酶原洗脱物
使上文实例1中所述的SD血浆作为凝血酶原来源与表1中列出的给定BaSO4试剂的样品接触。
具体地，对于表1中列出的六种BaSO4试剂中的每一种：
(i)将BaSO4(1％w/v)试剂的样品加入一单位SD血浆中。
(ii)使用磁力搅拌器将SD血浆/BaSO4试剂混合物在25℃下搅拌2小时(pH 7.4-8.6)，允许SD血浆中的凝血酶原被BaSO4试剂吸附。
(iii)将混合物以5,000g(5,440rpm)在4℃下离心15分钟。
(iv)将上清液和沉淀物(包括BaSO4吸附的凝血酶原)分离，并且将每种沉淀物分开贮存于-80℃下直至需要时。
(v)在使用之前，将沉淀物在室温(20-25℃)下解冻15分钟。
(vi)将沉淀物以1:1.4比的BaSO4：洗涤缓冲液(w/w)重悬于洗涤缓冲液(78mMNaCl pH 6.9-7.1)中，并且使用滚管机(tube roller)在室温下混合15分钟。
(vii)随后将在洗涤缓冲液中的沉淀物以5,000g(5,440rpm)在4℃下离心15分钟，并且收集上清液且贮存于-80℃下直至需要时。将该步骤重复两次(即总共进行三次洗涤)。
(viii)在洗涤步骤后，将洗涤的沉淀物(包含BaSO4吸附的凝血酶原)以1:1.4比的BaSO4：洗脱缓冲液(w/w)重悬于洗脱缓冲液(3％柠檬酸钠pH 6.3-6.7)中，并且使用滚管机混合15分钟。
(ix)随后将沉淀物/洗脱缓冲液以5,000g(5,440rpm)在4℃下离心15分钟。将含凝血酶原洗脱物收集到置于冰上的干净容器内，并且将洗脱步骤重复四次(即，总共执行五个洗脱循环)。
(x)将来自五个洗脱循环的洗脱物(含有解吸的凝血酶原)合并成单一洗脱物，通过0.2μm PVDF滤器过滤且在干净的容器中贮存于-80℃下，直至通过NAPTT或Western印迹进行测试时。
实例3：由猪SD血浆制备大规模的BaSO4吸附的凝血酶原洗脱物
由猪血浆制备冷冻的凝血酶原吸附的BaSO4的大规模样品)。
使用的BaSO4试剂是如表1中限定的A和B1。
SD使用1％Tween-80和0.3％TnBP用于SD处理进行。pH在7.4-8.6的范围内。使溶液与SD一起在24-26℃下温育6小时。
在大规模样品中，步骤v代替实验室规模样品中的相应步骤，并且将样品加工直到步骤x。
实例4：洗脱物的凝血酶原和凝血酶含量的Western印迹分析
使用Biuret方法执行如上文实例2和3中所述获得的洗脱物各自(每种洗脱物对应于表1的六种BaSO4试剂之一)中的总蛋白质测量，以便计算用于Western印迹测定的装载体积，并且验证残留未结合的蛋白质及其他污染物通过洗涤步骤(vi和vii)去除。
为了获得来自洗脱物中每一种的蛋白质的更好分辨，使用SDS-PAGE梯度微型预铸凝胶(4％-20％)在还原条件下分离来自洗脱物样品的蛋白质。将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维膜上。使用绵羊抗人凝血酶和二抗、与碱性磷酸酶缀合的抗绵羊IgG执行Western印迹。
发现一些BaSO4吸附的凝血酶原样品包含凝血酶(参见下文“结果”部分)。
实例5：洗脱物的促凝活性
使用非活化部分凝血活酶时间(NAPTT)测定，评估由猪SD血浆制备的八种洗脱物(如实例2中的6种和如实例3中的2种)中每一种的促凝活性，基本上如Ph.Eur.(2.6.22)中所述。简言之且如本领域普通技术人员已知的，NAPTT测定包括将磷脂(兔脑磷脂)和钙离子(如CaCl2)同时加入测试的洗脱物或吸附的BaSO4吸附的凝血酶原样品以及正常人血浆对照[Unicalibrator凝血测试校准血浆00625](其固有地含有凝血酶原)，钙离子通过将凝血酶原转化为凝血酶而起始测试样品中的凝血。凝血酶通过将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白而引起凝块形成。凝血时间使用凝血计(ST ART4 Stago机器)进行测量。
更具体而言，将45μl人血浆加入四个测试孔各自中。对于对照样品，将45μl TBS/白蛋白缓冲液加入两个对照孔各自中，并且将45μl稀释的测试样品加入两个另外的对照孔各自中。随后将45μl兔脑磷脂0.02％溶液加入四个测试孔各自中，随后通过轻轻摇动和在37℃下温育1分钟来混合孔的内容物。通过将45μl 0.025M CaCl2(先前在37℃下温育)加入所有孔内起始反应，并且测量凝血时间。NAPTT比计算为测试样品的凝血时间(以秒计)除以正常人血浆对照的凝血时间。
发现在其中鉴定活性凝血酶的洗脱物中(实例4)，凝血时间基本上短于正常人血浆对照的凝血时间。发现在一些洗脱物中凝血是立即的。发现在一些洗脱物中凝血时间超过450秒。
发现起因于BaSO4 B1和B2的洗脱物在过程结束时获得凝血酶的高得率。
结果指示NAPTT测定可用于鉴定用于凝血酶生产的合适BaSO4试剂。
实例6：由猪SD血浆制备BaSO4吸附的凝血酶原
对于表1中的六种BaSO4试剂中的每一种重复上文步骤(i)-(ii)。
使用非活化部分凝血活酶时间(NAPTT)测定，评估由猪SD血浆制备的吸附的BaSO4吸附的凝血酶原样品的促凝活性。
结果
Western印迹分析
使用BaSO4试剂A和B1(表1)的洗脱物(实例3)的Western印迹分析呈现于图1中。
泳道编号代表下述：
1–MW梯
2–人凝血酶原标准
3–使用BaSO4试剂A获得的大规模洗脱物
4–使用BaSO4试剂B1获得的大规模洗脱物
5–人前凝血酶2标准
6–人α凝血酶标准
在图1中，在使用BaSO4试剂B1获得的大规模洗脱物(泳道4)中，对应于凝血酶原的条带是清晰可见的。
在图1中，在使用BaSO4试剂A获得的大规模洗脱物(泳道3)中，对应于凝血酶原的条带是几乎看不见的。对应于凝血酶原中间体蛋白质以及α凝血酶的其他条带是显而易见的。
使用BaSO4试剂A、B1和B2(表1)得自猪SD血浆的洗脱物(实例2)的Western印迹分析呈现于图2中。
泳道编号代表下述：
1–MW梯
2–人凝血酶原标准
3–使用BaSO4试剂A获得的洗脱物
4–使用BaSO4试剂B1获得的洗脱物
5–使用BaSO4试剂B2获得的洗脱物
6–人α凝血酶标准
图2中呈现的结果显示使用由相同供应商供应的不同BaSO4批次获得的洗脱物(B1-泳道4，B2-泳道5)展示相似的条带模式。使用BaSO4试剂A获得的洗脱物(泳道3)作为参考运行。
使用BaSO4试剂A、B2、D2、D1和C得自猪SD血浆的洗脱物(实例2)的Western印迹分析呈现于图3中。
泳道编号代表下述：
1–MW梯
2–人凝血酶原标准
3–使用BaSO4试剂A获得的洗脱物
4–使用BaSO4试剂B2获得的洗脱物
5–使用BaSO4试剂D2获得的洗脱物
6–使用BaSO4试剂D1获得的洗脱物
7–使用BaSO4试剂C获得的洗脱物
8–人前凝血酶2标准
9–人α凝血酶标准
图3中呈现的结果显示使用药品级BaSO4得自猪SD血浆的洗脱物(C-泳道7，D1-泳道6)显示相似的条带模式，包括对应于凝血酶原和中间体的条带。该条带模式类似于使用BaSO4试剂A获得的洗脱物(泳道3)的条带模式。用白色标准级BaSO4获得的洗脱物(“D2”-泳道5)显示对应于凝血酶原的弱得多的条带以及对应于中间体和α凝血酶的更强烈的条带。使用试剂B2获得的洗脱物(泳道4)显示最强烈的凝血酶原条带和对应于中间体的最弱条带。
NAPPT测定结果
表2：NAPTT测定结果概括
使用BaSO4试剂A、B1、B2、C、D1和D2获得的大规模和实验室规模洗脱物的NAPTT测定结果呈现于表2中。
结果显示与凝血酶原来源无关，通过Western印迹显示具有很少或无凝血酶的BaSO4试剂B1和B2引起比对照血浆更慢的凝血。
结果还显示与凝血酶原来源无关，通过Western印迹显示具有显著凝血酶含量的BaSO4试剂A显示比对照血浆更快的凝血。
包括使用不同BaSO4试剂得自血浆的BaSO4吸附的凝血酶原的洗脱物使用Western印迹就蛋白质组成进行分析，并且使用NAPTT就促凝活性进行分析。
Western印迹分析结果(图1)显示在来自使用BaSO4试剂A和B获得的样品的洗脱物(分别为泳道3和4)之间的结合模式差异。该结果提出使用试剂A获得的样品中的凝血酶原已经历至凝血酶的部分转化。
在NAPTT凝血测定中，当测试使用BaSO4试剂A获得的洗脱物时立即形成凝块，而在使用试剂B获得的洗脱物中，即使在450秒后也未观察到凝血。应当指出的是如事实上观察到的，正常人血浆预期在NAPTT测定中在约200-300秒内产生凝块，如表2中可见。
各种不同的BaSO4试剂用于从猪SD血浆中分离凝血酶原且用于生产凝血酶。药品级BaSO4试剂A、C和D1获得不满意的结果，如同更低级的BaSO4试剂A和D2一样，而一些药品级的BaSO4试剂B1和B2提供优良结果。
结果显示使用的具体BaSO4试剂显著影响BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性和凝血酶得率。
还显示凝血酶原中的至少一些转化为凝血酶和/或凝血酶中间体。实验结果显示促凝测定可如本文描述的用于定性测定给定BaSO4试剂是否适合用作凝血酶原吸附剂和在过程结束时产生增加得率的凝血酶。
应当理解，为清晰起见，在分开实施例的上下文中描述的本发明的某些特征，也可在单个实施例中组合提供。相反，为简便起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征还可分开地或以任何合适的亚组合或如本发明的任何其他所述实施例中合适地提供。在各个实施例的上下文中所述的某些特征不应视为这些实施例的基本特征，除非实施例如果没有这些元件将是不起作用的。
尽管本发明已与其具体实施例结合进行描述，但显而易见的是许多替代形式、修饰和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，预期涵盖属于所附权利要求的范围内的所有此类替代形式、修饰和变化。
本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为此类参考文献可用作本发明的现有技术的承认。
实例7：在从BaSO4试剂中洗脱凝血酶原后的凝血酶原活化
由BaSO4 A和B1洗脱的凝血酶原(如下表中限定的)如下进行活化：
试剂名称
供应商
批号
A
1(药品级)
1
B
2(药品级)
1
将洗脱的凝血酶原溶液与CaCl2(6g/升)和甘氨酸(10g/升)混合，并且调整pH。接下来，将溶液通过0.22μM滤器过滤，并且在20-25℃下温育8小时，随后在2-8℃下温育最高至72小时。与使用BaSO4 A作为吸附剂获得的凝血酶得率相比较，使用BaSO4B1作为吸附剂获得的得率高约9倍。
实例证实在大规模凝血酶制造之前选择合适的BaSO4试剂是有利的，以便使凝血酶得率达到最大。
本申请还包括以下项目。
1.一种使用给定BaSO4试剂作为凝血酶原的吸附剂，由凝血酶原来源制备凝血酶的方法，所述方法包括：
a.提供所述给定BaSO4试剂和所述凝血酶原来源；
b.在允许来自所述凝血酶原来源的凝血酶原被所述给定BaSO4试剂吸附的条件下，使所述给定BaSO4试剂的样品和所述凝血酶原来源接触，从而获得BaSO4吸附的凝血酶原；以及
c.评估所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性，
其中当c.的评估通过比较所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性与正常哺乳动物血浆的促凝活性进行时，所述给定BaSO4试剂用于制备凝血酶的适合性通过所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于所述正常哺乳动物血浆的促凝活性指示。
2.一种使用给定BaSO4试剂作为凝血酶原的吸附剂，由凝血酶原来源制备凝血酶的方法，所述方法包括项目1所述的步骤“a”至“c”，并且还包括：
d.在允许凝血酶原吸附的条件下，使合适的BaSO4与凝血酶原来源接触；
e.使用洗脱缓冲液，从所述BaSO4吸附的凝血酶原中洗脱含凝血酶原级分；
f.对所洗脱的级分实施允许凝血酶原转化成凝血酶的条件，从而获得凝血酶。
3.一种用于评估给定BaSO4试剂用作由凝血酶原来源制备凝血酶中的凝血酶原吸附剂的适合性的方法，所述方法包括：
a.提供所述给定BaSO4试剂和凝血酶原来源；
b.在允许来自所述凝血酶原来源的凝血酶原被所述给定BaSO4试剂吸附的条件下，使所述给定BaSO4试剂的样品和所述凝血酶原来源接触，从而获得BaSO4吸附的凝血酶原；以及
c.评估所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性，
其中当c.的评估通过比较所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性与正常哺乳动物血浆的促凝活性进行时，所述给定BaSO4试剂用作制备凝血酶过程中的凝血酶原吸附剂的适合性通过所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于所述正常哺乳动物血浆的促凝活性指示。
4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中评估促凝活性包括执行促凝测定。
5.根据项目4所述的方法，其中所述促凝测定包括功能测定。
6.根据项目5所述的方法，其中所述功能测定是凝血测定。
7.根据项目6所述的方法，其中所述凝血测定选自NAPTT测定、APTT测定和蛋白酶生色测定。
8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中所述凝血酶原来源选自血浆或血浆级分。
9.根据项目8所述的方法，其中所述血浆包括草酸盐血浆。
10.根据项目1至9中任一项所述的方法，其中所述凝血酶原来源包括从哺乳动物中收获的血浆。
11.根据项目10所述的方法，其中所述哺乳动物选自人、马、牛和猪。
12.根据项目1至11中任一项所述的方法，其中允许来自所述凝血酶原来源的凝血酶原被所述给定BaSO4试剂吸附的所述条件包括pH 7.4-8.6。
13.根据项目9至12中任一项所述的方法，其中使所述给定BaSO4试剂的样品和所述凝血酶原来源接触包括将约1％(w/v)BaSO4试剂加入所收获的血浆中，所述收获的血浆为所述凝血酶原来源。
14.根据项目1至13中任一项所述的方法，其中评估所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性是吸附至所述BaSO4试剂时的所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性。
15.根据项目1至13中任一项所述的方法，还包括：
在“b”之后且在“c”之前，从所述BaSO4试剂中洗脱所述BaSO4吸附的凝血酶原中的至少一些；并且
其中评估所述BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性是所洗脱的BaSO4吸附的凝血酶原中的至少一些的促凝活性。
16.根据项目15所述的方法，其中从所述BaSO4吸附的凝血酶原中洗脱含凝血酶原级分包括使用在约6.3和7.4的pH下的钙螯合盐。
17.根据项目16所述的方法，其中所述螯合盐包含柠檬酸钠。
18.根据项目17所述的方法，其中所述柠檬酸钠的浓度为约3％(w/v)至约4.4％(w/v)。
19.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中所述凝血酶原来源包括猪血浆。
20.根据项目1至19中任一项所述的方法，其中当评估多于一种BaSO4试剂时，选择合适的BaSO4试剂用于吸附凝血酶原。
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