一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用
阅读说明：本技术 一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用 (White-eyebrow snake venom hemocoagulase characteristic polypeptide and application thereof in species identification of snake venom hemocoagulase for injection ) 是由 王聪聪 石峰 咸瑞卿 巩丽萍 杭宝建 迟连利 张群业 杜宏明 于 2020-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用,待测样品及特征肽对照品分别溶解制成供试品及对照品溶液,经二硫苏糖醇及碘乙酰胺还原烷基化处理；碳酸氢氨溶液稀释后,加入酶进行水解；酶解结束后,高速离心,取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析。采用酶解结合液相色谱-串联质谱-多反应监测(LC-MS/MS-MRM)方法,以三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3作为检测离子对提取离子流色谱图,对注射用白眉蛇毒血凝酶进行种属鉴别。该方法简便快捷,专属性强,填补了注射用白眉蛇毒血凝酶种属来源鉴定的空白,提高了质量控制水平。(The invention provides a white brow venom hemocoagulase characteristic polypeptide and application thereof in species identification of snake venom hemocoagulase for injection, wherein a sample to be detected and a characteristic peptide reference substance are respectively dissolved to prepare a test sample and a reference substance solution, and reduction alkylation treatment is carried out by dithiothreitol and iodoacetamide; diluting ammonium bicarbonate solution, and adding enzyme for hydrolysis; after enzymolysis, high-speed centrifugation is carried out, and supernate is taken and injected into a liquid chromatogram-mass spectrometer for analysis. The species identification of the injection white brow venom hemocoagulase is carried out by adopting an enzymolysis combined liquid chromatography-tandem mass spectrometry-multiple reaction monitoring (LC-MS/MS-MRM) method and taking three charges of 935.8 → 861.4 and 935.8 → 602.3 as detection ion pairs to extract an ion flow chromatogram. The method is simple, convenient and rapid, has strong specificity, fills the blank of identifying the source of the hemocoagulase of the white-eyebrow snake venom for injection, and improves the quality control level.)
技术领域
本发明涉及一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用，属于蛇毒血凝酶制品种属鉴定领域。
背景技术
蛇毒血凝酶类药物是一类来源于不同蛇种的止血药，其主要活性成分蛇毒类血凝酶是一种具有精氨酸酯酶和酰氨酶活性的丝氨酸蛋白酶，可在凝血过程中发挥重要作用，主要用于出血性疾病的治疗。目前国内获批上市的蛇毒血凝酶类药物主要有注射用白眉蛇毒血凝酶（邦亭）、注射用矛头蝮蛇血凝酶（巴曲亭）、注射用尖吻蝮蛇血凝酶“苏灵”、兆科药业(合肥)有限公司的蛇毒血凝酶注射液（速乐涓）。
现行蛇毒血凝酶类药物的质量标准主要利用生化反应、化学显色反应、液相色谱-肽图对照法或凝胶电泳法等进行鉴别，但这些方法均未对该类生化药物的种属来源进行鉴别，对于未知样品无法确实其种属来源。由于不同蛇种来源的血凝酶其结构不同，发挥作用机制不同，对应的药理作用也存在差异，因此有必要建立一种具有种属特异性的血凝酶类药物的鉴别检测方法，加强该类产品的质量控制，保障临床用药的安全性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用，本发明提供的特征多肽种属鉴别方法简便快捷，专属性强，填补了注射用蛇毒血凝酶质量标准的空白，大大提高了该类药物质量控制水平，有利于保证临床用药的安全性和有效性。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽，所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽的氨基酸序列为：LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR。
一种上述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用。
优选地，所述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用方法，包括以下步骤：
A：注射用蛇毒血凝酶及白眉蛇毒类凝血酶特征多肽对照品分别溶解制成供试品及对照品溶液；
B：分别取供试品溶液和对照品溶液，经二硫苏糖醇及碘乙酰胺还原烷基化处理；
C：还原烷基化结束后，经碳酸氢铵溶液稀释后，加入酶进行水解；
D：酶解结束后，高速离心，取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析；
E：在检测离子对的提取离子流色谱图中，若供试品溶液呈现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品含有氨基酸序列LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR，证明待测样品来源于白眉蝮蛇；反之，则为非白眉蝮蛇来源。
优选地，步骤E所述的检测离子对为三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3。
优选地，上述白眉蛇毒血凝酶特征多肽在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用方法，具体采用以下步骤：
（1）取白眉蛇毒血凝酶特征多肽“LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR” 10 mg，置10 mL量瓶中，用水溶解并定容，混匀，配置浓度为1 mg/ml的对照品储备液1；取10 μL对照品储备液1，用水溶解并定容至10ml，配置浓度为1 μg/ml对照品储备液2；取600 μL对照品储备液2，用25 mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至10 mL，制成60 ng/mL的对照品溶液；取待测样品50mg，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液500 μL溶解，即得供试品溶液；
（2）量取供试品溶液、对照品溶液各400μL，加入0.4 mol/L二硫苏糖醇溶液20 μL，混匀，60℃反应1 h，加入0.4 mol/L碘乙酰胺溶液40 μL，避光放置30 min，加入0.4 μg/μL 胰蛋白酶10 μL，37℃ 酶解1小时；90℃灭活10 min，取出放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析；
（3）在检测离子对的提取离子流色谱图中，若供试品溶液呈现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品含有氨基酸序列LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR，证明待测样品来源于白眉蝮蛇；反之，则为非白眉蝮蛇来源；
优选地，所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
色谱质谱条件：色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱50 mm×2.1 mm，1.7μm；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2mL/min，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A 10%→10%；
质谱条件采用电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压10 V；以三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3作为检测离子对，碰撞电压分别为45 V和40 V，去簇电压135 V。
本发明的有益效果：
（1）本发明利用NCBI和UniProt对已有蛇种蛋白库和毒液蛋白库进行整合后搜库比对，结合大量实验研究，寻找到了白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的特征多肽LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR，由于已知其它蛇种如矛头蝮蛇、蝰蛇和尖吻蝮蛇等蛇毒类凝血酶的氨基酸序列中均不含该段氨基酸序列，因此该特征多肽可用于专属性表征白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶。
（2）传统类凝血酶鉴定方法无法对种属进行鉴定，经本发明提供的特征多肽种属鉴别方法简便快捷，专属性强，填补了注射用白眉蛇毒血凝酶质量标准的空白，大大提高了该类药物质量控制水平，有利于保证临床用药的安全性和有效性。
附图说明
图1为白眉蝮蛇类凝血酶特征多肽的二级质谱图及碎片归属；
图2为白眉蝮蛇类凝血酶特征多肽的一级质谱图；
图3为空白溶液的提取离子色谱图；
图4为对照品溶液特征肽提取离子色谱图；
图5为注射用白眉蛇毒血凝酶特征肽提取离子色谱图；
图6为注射用矛头蝮蛇血凝酶特征肽提取离子色谱图。
具体实施方式
：
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
下述实施例中相关试剂试药及溶液的制备方法如下：
（1）试剂：胰蛋白酶（Sigma，批号SLBS8956），白眉蝮蛇蛇毒类血凝（锦州奥鸿药业，纯度为98.5%），盐酸胍（VETEC，批号WXBC4261V），三羟基氨基甲烷（沪市，批号20181206），二硫苏糖醇（BBI Life Sciences，批号D911BA0011），碘乙酰胺（BBI Life Sciences，批号B326BA1943），其它试剂均为分析纯。
（2）25 mmol/L碳酸氢铵溶液：称取79.06 mg 碳酸氢铵，加40 mL水溶解，即得。
（3）0.4 mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液：称取15.42 mg 二硫苏糖醇，加250 μL水溶解，即得。
（4）0.4 mol/L碘乙酰胺溶液（临用新制）：称取18.5 mg碘乙酰胺，加250 μL水溶解，即得。
（5）0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）：称取胰蛋白酶8.0 mg，加20 mL水溶解，即得。
实施例1 特征多肽的筛选和确定。
1.仪器设备
Thermo Fusion高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国），EASY-nLC 1000纳升液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国），CP225D电子天平（Sartorius，德国），Sigma 3-30 K冷冻离心机(Sigma, 德国)，密理博Milli-QAdvantage A10超纯水仪（Millipore，美国）。
2.色谱质谱条件
色谱条件：色谱柱：实验室自制0.2 mm × 3.5 cm（5 μm粒径）的 ReproSil-Pur C18-AQ Trap column脱盐富集，采用实验室自制75 μm × 25 cm（3 μm粒径）的 ReproSil-PurC18-AQ纳升分析柱分离。流动相A为2% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液；流动相B为98% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液。纳升分离泵流速为300 nL/min，梯度洗脱设置见表1。
质谱条件：采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.0 kV，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60,000，采集范围为350-1650。二级质谱采用IT作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。
3.数据采集
取白眉蝮蛇蛇毒类血凝5 mg，置10 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并定容；精密量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1小时，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20μL，避光放置30分钟，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37℃反应90分钟，90℃灭活10分钟；经C18固相萃取柱脱盐并转干，加水200 μL复溶，1200 rpm离心10 min，取上清液作为供试品溶液，采用纳升液相分离进样，利用高分辨质谱采集一级和二级质谱图。
4.搜库筛选及确定
使用NCBI和UniProt，对相关蛇蛋白库和毒液蛋白库进行整合，建立蛇及毒液数据库。通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种蛇毒类凝血酶蛋白的结果，并通过将白眉蝮蛇类凝血酶蛋白序列与其他物种的序列比对获得白眉蝮蛇相对于其他物种的特征性多肽序列，并使用Proteome Discoverer软件（2.2版）对质谱数据搜库，参照(1)8~25氨基酸、(2)尽量避免易发生人为修饰的肽段、(3)酶切时无漏切位点等原则，结合质谱响应和分离情况，确定“LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR”可作为白眉蝮蛇类凝血酶的特征多肽。检测结果显示特征多肽的分子量和二级质谱都与理论值相符，见图1和图2。
实施例2
1.仪器设备
SCIEX Triple Quad 6500三重四级杆质谱仪，CP225D电子天平（Sartorius，德国），Sigma 3-30 K冷冻离心机(Sigma, 德国)，密理博Milli-QAdvantage A10超纯水仪（Millipore，美国）。
2.色谱质谱条件
液相条件：色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50mm×2.1 mm，1.7μm）；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；进行梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A 10%→10%；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min。
质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压10 V；以三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3作为检测离子对，碰撞电压分别为45 V和40 V，去簇电压135 V。
3.溶液制备
（1）对照品溶液：取实施例1制备的氨基酸序列为“LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR”的白眉蛇毒血凝酶特征肽对照品 10 mg，置10 mL量瓶中，用水溶解并定容，混匀，配置浓度为1 mg/ml的对照品储备液1；取10 μL对照品储备液1，用水溶解并定容至10 ml，配置浓度为1μg/ml对照品储备液2；取600 μL对照品储备液2，用25 mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至10mL，制成60 ng/mL的对照品溶液；
（2）供试品溶液：取待测样品50 mg，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液500 μL溶解，即得供试品溶液；
（3）空白溶液：以25 mmol/L碳酸氢铵溶液作为试剂空白溶液。
4. 酶解处理
精密量取供试品溶液、对照品溶液和空白溶液各400 μL，加入0.4 mol/L二硫苏糖醇溶液20 μL，混匀，60℃反应1 h；加入0.4 mol/L碘乙酰胺溶液40 μL，避光放置30 min，加入0.4 μg/μL 胰蛋白酶10 μL，37℃ 反应1小时；90℃灭活10 min，取出放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析。
5.专属性
取供试品溶液、空白溶液和对照品溶液各2 μL，按2项下液相质谱条件进行液质分析，结果空白溶液在对照品溶液出峰位置没有干扰峰出现，供试品溶液在对照品溶液出峰位置有响应色谱峰出现，表明该方法专属性良好，见图3-图5。
6.检出限与定量限
取对照品溶液经酶解处理，分别稀释至浓度为3 ng/mL和9 ng/mL进样2 μL，以特征多肽三电荷935.8→861.4作为定量离子对进行检测。信噪比分别为3.1和9.8。因此检出限为3ng/mL，定量限为9 ng/mL。
7.精密度实验
取对照品溶液，连续重复进样6次，提取三电荷935.8→861.4离子对色谱图，6次进样的峰面积RSD为1.9%，仪器精密度良好。
8.稳定性实验
取供试品溶液，处理后置于8℃，分别于0、2、4、8、16及24小时后进样测定，提取三电荷935.8→861.4离子对色谱图，峰面积RSD为2.5%，表明待测溶液在8℃下24小时内稳定。
9.耐用性实验
取供试品和对照品溶液，保持其它条件不变，仅改变洗脱程序，如下：0→3 min，流动相A95%；3→8 min，流动相A 95%→10%；8.1→10 min，流动相A 10%→10%。改变洗脱程序后，供试品溶液在对照品溶液出峰位置仍有相应色谱峰出现，说明该方法不受洗脱程序影响，耐用性良好。
取供试品和对照品溶液，保持其它条件不变，仅改变色谱柱，使用ThermoAccucore C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，2.6μm），改变洗脱程序后，供试品溶液在对照品溶液出峰位置仍有相应色谱峰出，说明该方法不受色谱柱品牌影响，耐用性良好。
10.实验结果
按照3项下方法，分别对注射用白眉蛇毒血凝酶、注射用矛头蝮蛇血凝酶和注射用尖吻蝮蛇血凝酶及蛇毒血凝酶注射液（未标示蛇种）样品进行处理，按照2项下方法进行检测，结果见表5。
根据上文所述的蛇毒样品预处理方法以及分析方法，检测结果显示，以质荷比（m/z) 935.8→861.4和935.8→602.3为检测离子对，供试品的提取离子流色谱中，三批注射用白眉蛇毒血凝酶均呈现与特征多肽对照品色谱保留时间（2.75分钟）一致的色谱峰，而三批次注射用矛头蝮蛇血凝酶、一批注射用尖吻蝮蛇血凝酶及一批蛇毒血凝酶注射液在对照特征多肽色谱保留时间处均未提取到色谱峰。因此，三批标示为注射用白眉蛇毒血凝酶中均可以检测到特征多肽LDSPVSNSAHIAPLSLPSSAPSVGSVCR，确认来源于白眉蝮蛇，而三批次注射用矛头蝮蛇血凝酶、一批注射用尖吻蝮蛇血凝酶及一批蛇毒血凝酶注射液均未检测到该特征多肽，因此确认这5批蛇毒并非来源于白眉蝮蛇。
序列表
<110> 山东省食品药品检验研究院，山东大学，锦州奥鸿药业有限责任公司
<120> 一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 白眉蝮蛇(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Leu Asp Ser Pro Val Ser Asn Ser Ala His Pro Leu Ser Leu Pro Ser
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ser Val Gly Ser Val Cys Arg
20 25