凝血酶的制备方法
阅读说明：本技术 凝血酶的制备方法 (Process for preparing thrombin ) 是由 刘强 白卓娅 林锋 马海波 于 2021-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了属于生物医用工程技术领域的一种凝血酶的制备方法。该方法是使用PRP管抽取全血制成抗凝全血,在抗凝全血中加入钙盐使混合均匀,在混合物中加入埃洛石纳米管(HNTs)静置,静置让充分接触后混合物中形成凝块,通过离心使得凝块和埃洛石纳米管(HNTs)位于管底部,上部形成上清液,吸取上清液从而制得凝血酶溶液。本发明的制备工艺简单,制备的凝血酶活性高,用制备的凝血酶激活富血小板血浆(PRP)形成凝胶的用时短、凝胶体积大。(The invention discloses a preparation method of thrombin, belonging to the technical field of biomedical engineering. The method comprises the steps of extracting whole blood by using a PRP (platelet-rich plasma) tube to prepare anticoagulated whole blood, adding calcium salt into the anticoagulated whole blood to uniformly mix, adding Halloysite Nanotubes (HNTs) into a mixture to stand, standing to enable the mixture to be in full contact to form a clot, enabling the clot and the Halloysite Nanotubes (HNTs) to be located at the bottom of the tube through centrifugation, forming supernatant on the upper portion of the tube, and absorbing the supernatant to prepare thrombin solution. The preparation process is simple, the prepared thrombin has high activity, and the time for activating Platelet Rich Plasma (PRP) to form gel by the prepared thrombin is short and the gel volume is large.)
技术领域
本发明属于生物医用工程技术领域，尤其涉及一种凝血酶的制备方法。
背景技术
凝血酶是能够活化多种凝血因子并且可活化血小板的多功能丝氨酸蛋白酶。凝血酶可通过活化的因子X(Xa)对凝血酶原上两个位点的酶切而产生。因子Xa的活性可通过与活化的因子V(Va)结合而增强，因子V(Va)称作凝血酶原复合物。一旦形成凝血酶，凝血酶把纤维蛋白原通过蛋白水解而消化为纤维蛋白单体，启动凝血瀑布反应，从而启动了可导致凝块形成的反应级联而形成凝血块，这是伤口修复过程中最先发生的步骤。凝血酶还可作为伤口愈合所涉及细胞的化学吸引剂(chemo-attractant)发挥功能，对伤口修复过程中参与的细胞有化学趋向作用，所得纤维蛋白网络具有很多的功能，其包括：为胶原产生的纤维母细胞作为支架、增加吞噬作用、促进血管生成、结合生长因子。血小板被激活后，从非结合状态转化成与纤维蛋白网络结合状态。因此，凝血酶作为一种促凝剂，在止血过程中起了非常重要的作用。
可以从许多来源来制备凝血酶，这些来源包括：异源、同源异体和自体。其中，使用源自小牛血浆(Fetal bovine serum)的凝血酶用于人体治疗，会存在病原蛋白颗粒(prion)感染的危险性，甚至引起严重的免疫反应和致命的出血。如果使用同源异体(志愿者)的血浆制成的凝血酶，可能存在免疫排斥反应、病毒感染和其他副作用。
埃洛石纳米管(化学式为：Al2Si2O5(OH)4·nH2O，简称“HNTs”)是一种广泛存在的天然黏土纳米管，其为空心管状结构，管内径约为(10-40)nm，外径约为(40-70)nm，长度约为(500-1500)nm。HNTs具有超亲水性和独特的管状纳米结构，使HNTs与血液成分接触后，血液成分中的水就可以进入HNTs的空腔和夹层，HNTs通过静电作用力在其表面吸附血浆中的凝血蛋白，从而利于血小板与HNTs之间的吸附作用。目前，HNTs在生物医学领域研究引起了科学家们的关注，其具有良好的生物相容性，不但具有止血的特性，而且其表面所携带的负电荷，可以通过物理吸附和静电相互作用吸附带正电荷的溶菌酶。基于良好的生物相容性和生物安全性，在止血领域，如何使用HNTs研制一种具有较强止血功能的凝血酶，成为一个研究热点。
发明内容
针对现有技术中制备凝血酶的工序复杂、杂质偏高、止血效果不良等，本发明的目的是提供一种工艺简单，制备的凝血酶活性高、凝胶快的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明的一种凝血酶的制备方法，包含有下列步骤：
步骤a：选用真空PRP管，PRP管中含有分离胶和抗凝剂；
步骤b：使用PRP管抽取全血；
步骤c：使PRP管中全血与抗凝剂混合，制得抗凝全血；
步骤d：在抗凝全血中加入钙盐混合均匀；
步骤e：在步骤d的混合物中加入埃洛石纳米管混合后静置，静置充分接触后，混合物中形成凝块；
步骤f：将在步骤e得到的混合物进行离心，使得凝块和埃洛石纳米管位于管底部，上部形成上清液，吸取上清液制得凝血酶溶液。
优选的，步骤c1：将步骤c制得的抗凝全血进行离心，离心后PRP管中从下到上的组分依次为：红细胞、分离胶、白膜层和血浆；
步骤c2：收集步骤c1制得的上部血浆而制得的贫血小板血浆(PPP)；
步骤c3：完成步骤c2后，颠倒PRP管使白膜层悬浮在血浆中，制得富血小板血浆(PRP)，收集富血小板血浆；
步骤d：取步骤c2制得的贫血小板血浆和/或步骤c3收集的富血小板血浆，加入钙盐混合均匀；
步骤e：在步骤d的混合物中加入埃洛石纳米管混合后静置，静置充分接触后，混合物中形成凝块；
步骤f：将在步骤e得到的混合物进行离心，使得凝块和埃洛石纳米管位于管底部，上部形成上清液，吸取上清液制得凝血酶溶液。
优选的，步骤d：取步骤c2制得的贫血小板血浆，加入钙盐混合均匀；
步骤e：在步骤d的混合物中加入埃洛石纳米管混合后静置，静置充分接触后，混合物中形成凝块；
步骤f：将在步骤e制得的混合物进行离心，使得凝块和埃洛石纳米管位于管底部，上部形成上清液，吸取上清液制得凝血酶溶液。
优选的，步骤g：在步骤f制得的凝血酶溶液中加入富血小板血浆，将二者按照体积比为1～3：10进行混合，使形成凝胶。
优选的，步骤g：在步骤f制得的凝血酶溶液中加入步骤c3中的富血小板血浆，将二者按照体积比为1～3：10进行混合，使形成凝胶。
优选的，抗凝剂为柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠的浓度为0.1～0.12mol/L。
优选的，钙盐为氯化钙、碳酸钙、硫酸钙、葡萄糖酸钙中的任一种或者二种以上的混合物。
优选的，钙盐为浓度10％的氯化钙和/或浓度10％的葡萄糖酸钙的混合物。
优选的，钙盐与抗凝全血、贫血小板血浆和/或富血小板血浆的体积比为：1：3～7。
优选的，每毫升抗凝全血、贫血小板血浆和/或富血小板血浆中，埃洛石纳米管的质量为：0.25mg～2mg。
优选的，埃洛石纳米管经过纯化处理。
优选的，埃洛石纳米管的纯化处理，包含有下列步骤：
步骤①：将埃洛石纳米管配成水溶液，埃洛石纳米管的浓度5％-20％；
步骤②：在步骤①制得的埃洛石纳米管的水溶液中加入六偏磷酸钠，六偏磷酸钠的浓度为：0.02％～0.10％，搅拌2小时以上后静置20分钟～60分钟，水溶液形成分层；
步骤③：在步骤②制得的水溶液静置分层后，将底部的杂质和沉淀物过滤除去，收集上部的悬浮溶液；
步骤④：将步骤③收集的上部悬浮溶液进行离心滤水，将离心滤水后得到的埃洛石纳米管冷冻干燥。
优选的，在步骤④中对埃洛石纳米管冷冻干燥，冷冻干燥的温度为：-80℃～-20℃，时间为：12小时～24小时。
优选的，埃洛石纳米管的浓度为8％-15％，六偏磷酸钠的浓度为0.04％～0.08％。
优选的，全血为自体血液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明的制备工艺简单，制备的凝血酶活性高，用制备的凝血酶激活PRP形成凝胶的用时短、凝胶体积大。
附图说明
图1是用抗凝全血制备凝血酶的流程图；
图2是用抗凝全血离心后的贫血小板血浆、富血小板血浆制备凝血酶的流程图；
图3是凝胶的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步对本发明进行详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的凝血酶的制备方法，具体用实施例1和实施例2说明。
实施例1
本发明的凝血酶的制备方法，如图1所示。图1是利用抗凝全血制备凝血酶的流程图，具体包含有下列步骤：
步骤a：选用真空PRP管。PRP管包括管体和密封管体口的胶塞，管体内有分离胶、抗凝剂，并且PRP管预设为真空。
其中抗凝剂为柠檬酸盐，可选择柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠的浓度为：(0.1-0.12)mol/L。
步骤b：使用PRP管抽取全血的量为(8-10)ml。
步骤c：手持PRP管轻轻地反复颠倒，使全血与抗凝剂充分混合。可以用柠檬酸钠溶液作为抗凝剂时，制得抗凝全血则为柠檬酸抗凝全血。
步骤d：在抗凝全血中加入钙盐。
钙盐以固体形式的晶盐或溶液形式的盐溶液加到抗凝全血中，钙盐也可以粉末的形式与HNTs预先设置在PRP管中，或者作为附带溶液在使用之前加入到PRP管中。在室温下，将钙盐与抗凝全血按照体积比：1：(3-7)的比例进行混合。可选择将10％氯化钙或10％葡萄糖酸钙加入到抗凝全血中，慢慢倾斜PRP管后，左右或上下方向轻晃而混合充分，使钙离子与血液成分结合。
钙盐可选自于氯化钙、碳酸钙、硫酸钙、葡萄糖酸钙以及这些钙盐的混合物，可将其中的任一种或者二种以上的混合物制作钙盐，如将10％氯化钙和10％葡萄糖酸钙混合制作钙盐。由于抗凝全血中存在抗凝剂如柠檬酸盐，如果加入钙的量要比抗凝全血中剩余柠檬酸根络合钙的量多的话，这样剩余的没被络合的钙离子可以参与凝血级联反应，有助于产生凝血酶。
为了使血液成分凝固，通过步骤e在步骤d的混合物中加入埃洛石纳米管(HNTs)，充分混合后静置。在每毫升抗凝全血中，加入埃洛石纳米管的质量为：0.25mg-2mg。静置30分钟让充分接触后，混合物中形成凝块。
可以通过颠倒、摇动、晃动、搅拌或涡流的方式完成混合，混合可以一次，重复多次和周期性重复。混合后或者在混合过程中，抗凝全血与钙盐、埃洛石纳米管(HNTs)充分接触，静置一段时间后会形成凝块。例如，接触静置的时间可以10分钟到20分钟，接触静置的温度可在20℃-45℃，可以是室温，也可以高于室温，温度高于室温时更有利于加速形成凝块。
通过步骤f制得凝血酶溶液。将在步骤e得到的混合物进行离心，使得凝块和埃洛石纳米管(HNTs)位于试管底部，上部形成上清液，吸取上清液，制得凝血酶溶液。
为了分离凝块而得到上清液，可以通过离心使凝块、埃洛石纳米管(HNTs)、血块和其它任何残留的细胞成份沉淀到试管底部，上部形成上清液，含有凝血酶的上清液可以通过倒出或者用注射器吸取。例如可以通过1500g离心5分钟后，利用注射器或者吸管吸取含有凝血酶的上清液。为了保持制备凝血酶的活性，可以在低温下保存凝血酶溶液，如温度在(2-8)℃下保存。
实施例2
本发明的凝血酶的制备方法，如图2所示。图2是对实施例1中的步骤c制得的抗凝全血进行离心，制得贫血小板血浆(Platelet rich plasma，PPP)、富血小板血浆(Plateletpoor plasma，PRP)后，用PPP和PRP制备凝血酶，也可以用PPP或PRP之一制备凝血酶。具体包含有下列步骤：
根据实际需求，进一步可对步骤c中的PRP管中的抗凝全血进行离心。如下步骤：
步骤c1：将步骤c制得的抗凝全血进行离心，其中，离心后PRP管中从下到上的组分依次为：红细胞、分离胶、白膜层和血浆；
步骤c2：收集步骤c1制得的上部血浆而制得的贫血小板血浆(Platelet richplasma，PPP)；
步骤c3：完成步骤c2后，颠倒PRP管使白膜层悬浮在血浆中，制得富血小板血浆(Platelet poor plasma，PRP)，收集富血小板血浆；
步骤d：在PRP、PPP中加入钙盐。
可将浓度10％钙盐与PRP和/或PPP混合，按照体积比为：1：(3-7)进行混合即可；也可选择将浓度10％氯化钙和/或10％葡萄糖酸钙加入到PPP或PRP中，混合后钙盐占总体积：1/8-1/4即可。在室温下，混合后慢慢倾斜PRP管后，左右或上下方向轻晃而混合充分，使钙离子与血液成分结合。
为了进一步使血液成分凝固，通过步骤e在步骤d的钙盐混合物中加入埃洛石纳米管(HNTs)，混合后静置。充分接触后混合物中形成凝块。在每毫升PPP、PRP中，加入HNTs的质量为：0.25mg-2mg。静置30分钟让充分接触后，混合物中形成凝块。
同样可通过步骤f制得凝血酶溶液。将在步骤e得到的混合物进行离心，使得凝块和HNTs位于试管底部，上部形成上清液，吸取含有凝血酶的上清液，制得凝血酶溶液。
由于埃洛石纳米管(HNTs)是一种广泛存在的天然黏土纳米管，为空心管状结构，最外面的化学性能与二氧化硅(SiO2)相似，其内部管状表面的化学性能与三氧化二铝(Al2O3)相似。HNTs可以活化血浆中的第二因子和血小板以及一些其它成分产生凝血酶，但血液中的这些成分是一定的，如果加入HNTs的量过多，则会造成浪费。相反，如果加入HNTs的量过少，即使有足量的上清液，又会造成血液中的这些成分得不到充分活化。
虽然HNTs的生物相容性好、对细胞毒性很低，但是为了进一步提高制备出凝血酶的活性和纯度，在使用之前可以把HNTs纯化。
埃洛石纳米管(HNTs)的纯化处理方法，包含有下列步骤：
步骤①：将埃洛石纳米管配成水溶液，埃洛石纳米管的浓度5％-20％，优选埃洛石纳米管的浓度为8％-15％；
步骤②：在步骤①制得的埃洛石纳米管的水溶液中加入六偏磷酸钠，也可加入其它磷酸盐。其中，六偏磷酸钠的浓度为：0.02％-0.10％，优选六偏磷酸钠的浓度为0.04％-0.08％。搅拌2小时以上后，在室温下，静置20分钟-60分钟，水溶液形成分层；
步骤③：在步骤②制得的水溶液静置分层后，将底部的杂质和沉淀物通过过滤的方式除去，收集上部的悬浮溶液；
步骤④：将步骤③收集的上部悬浮溶液进行离心滤水，将离心滤水后得到的埃洛石纳米冷冻干燥形成微粒，以防止埃洛石纳米管凝结成块。
在步骤④中对埃洛石纳米管冷冻干燥，冷冻干燥的温度为：-80℃～-20℃，时间为：12小时-24小时。
由于凝血酶可以激活血小板，使其释放生长因子、细胞因子和趋化因子等，同时凝血酶又可以把PRP中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，从而形成凝胶。
为了将上述实施例1和实施例2制得的凝血酶进一步制成凝胶，具体包含有下列步骤：
可通过步骤g，将在步骤f制得的凝血酶溶液中加入PRP，使凝血酶溶液与PRP按照体积比为：(1-3)：10进行混合，使形成凝胶。这里的PRP可以是实施例2的PRP管中的抗凝全血经过离心后在上述步骤c3中收集的PRP，也可以是另外将PRP管中的抗凝全血通过离心收集所得。
凝血酶与血小板结合形成凝胶，其形状如图3所示。其中，用钙盐与HNTs作为试剂制成的凝血酶中加入PRP形成凝胶，凝胶如图3的(a)所示；用钙盐作为试剂制成的凝血酶中加入PRP形成凝胶，凝胶如图3的(b)所示。由于本发明是联用钙盐与埃洛石纳米管(HNTs)制备的凝血酶，凝血酶的活性高。在其他条件相同的情形下，用凝血酶激活PRP后形成凝胶，图(a)凝胶的体积明显大，且激活时间短。
以下列的实验操作来制备凝血酶及进一步制备凝胶，测试凝胶时所使用的实验条件。
实验(一)
实验温度：24℃，志愿者全血中血小板的浓度：233×109/L，离心制得PPP、PRP，PRP中血小板浓度为712×109/L。
方案1：把PPP和10％葡萄糖酸钙溶液按体积3：1混合均匀。
方案2：往试管中加入2ml的PPP和3mg纯化的HNTs混合均匀后，然后按(PPP+HNTs)和10％葡萄糖钙溶液体积比3：1混合均匀。
混合均匀后，在37℃下，静置，充分接触15分钟后，以1500g×5min离心。离心后用注射器抽取上清液，按PRP和自体凝血酶(ATS)体积比10：1和10：3立马激活PRP，记录PRP成凝胶的时间，把上清液放置一段时间，重复激活实验，并记录激活时间。实验结果如下：
1、凝血酶制备后即时激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
2、凝血酶制备后30min，激活PRP，使PRP成凝胶的如下。单位(秒)
3、凝血酶制备后60min，激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
4凝血酶制备后120min，激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
5、凝血酶制备后180min，激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
6、凝血酶制备后240min，激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
从以上实验结果可知，随着放置时间的增加，凝血酶的活性会下降，从而导致激活PRP成凝胶的时间变长。凝血酶制备180min后，方案1和方案2激活PRP，使PRP成凝胶的时间区别大，并且方案2激活PRP后形成的凝胶体积大。
实验(二)
实验温度：24℃，志愿者全血中血小板浓度：180×109/L，离心制得PPP、PRP，PRP中血小板浓度为305×109/L。
方案1：把PPP和10％氯化钙溶液按体积5：1混合均匀。
方案2：往试管中加入2ml的PPP和1mg纯化的HNTs混合均匀后，然后按(PPP+HNTs)和10％氯化钙体积比5：1混合均匀。
混合均匀后，在37℃下，静置。充分接触10分钟后，然后以1500g×5min离心。用注射器抽取上清液，按PRP和凝血酶体积比10：1和10：3立马激活PRP，记录PRP成凝胶的时间，把上清液放置一段时间，重复激活实验，并记录激活时间。实验结果如下：
1、凝血酶制备后即时激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
2、凝血酶制备后30min激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
3、凝血酶制备后60min激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
4、凝血酶制备后90min激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
5、凝血酶制备后120min激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
实验(三)
实验温度：25℃，志愿者全血中血小板浓度：220×109/L，离心制得PPP、PRP，PRP中血小板浓度为370×109/L。
方案1：把抗凝全血和10％葡萄糖酸钙溶液按体积4：1混合均匀。
方案2：往试管中加入2ml的PPP和2mg纯化的HNTs混合均匀后，然后按(抗凝全血+HNTs)和10％葡萄糖酸钙体积比4：1混合均匀。
混合均匀后，常温下，静置。充分接触10分钟后，然后以1500g×5min离心。用注射器抽取上清液，按PRP和自体凝血酶(ATS)体积比10：1和10：3立马激活PRP，记录PRP成凝胶的时间，把上清液放置一段时间，重复激活实验，并记录激活时间。实验结果如下：
1、凝血酶制备后即时激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
凝血酶刚制备后，使用体积比为10：3(PRP：ATS)，方案1所形成的凝胶体积大，只有少部分上清液；方案2所形成的凝胶体积更大，几乎没有上清液。
2、凝血酶制备后30min激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
凝血酶制备30min后，使用体积比为10：3(PRP：ATS)，方案1所形成的凝胶体积小，上清液多；方案2所形成的凝胶体积大，上清液少。
3、凝血酶制备后90min激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
4、凝血酶制备后150min激活PRP，使PRP成凝胶的时间如下。单位(秒)
综上：相比只用钙盐作为自体凝血酶(ATS)试剂，本发明用钙盐和埃洛石纳米管(HNTs)作为凝血酶制备试剂，制备的凝血酶活性高，在相同实验条件下激活PRP用时短且形成的凝块体积大。
本发明用钙盐与埃洛石纳米管(HNTs)作为试剂，没有被柠檬酸根络和多余的钙会启动凝血级联反应，产生凝血酶。管状结构使HNTs具有带负电荷的Si-O-Si外表面和带正电荷的Al-OH内表面。HNTs独特的管状结构和极大的长径比使得其有很大的比表面积和孔隙体积，从而使其外表面带有更多的负电荷，可以更好的活化血浆中的第二因子和其它物质转化成凝血酶。另外HNTs使用时是无水状态，并且HNTs具有超亲水性能和独特的管状纳米结构，使得HNTs与血液成分接触后，血液成分中的水就可以进入HNTs的空腔和夹层，另外HNTs有很大的孔隙体积和很大的长径比可产生毛细管作用，从而对自体血液成份有浓缩的作用。HNTs通过静电作用力在其表面吸附血浆中的凝血蛋白，从而利于血小板与HNTs之间的吸附作用，以及HNTs独特的管状纳米结构，使得其和血小板更容易接触，从而可以更好的活化血小板。HNTs可以通过活化血浆中的第二因子和血小板以及其它成分产生凝血酶，同时又可以浓缩血液成份，使制备的酶活性更高。凝血酶溶液和血液制品形成的纤维蛋白凝胶可以在外科手术中使用，如骨科手术中的切口、移植处和修复部位，凝胶可以封闭伤口处，从而帮助组织受伤部位的修复，帮助身体的快速愈合。
本发明中所用全血来可来自于志愿者，也可来自于病患本身。例如，可从病患的身体上抽取全血进行离心，利用离心后的PPP、PRP制备病患自体的凝血酶。为了提高使用效果，可以把凝血酶与PRP混合，使凝血酶进一步激活PRP中的血小板，使其释放生长因子、细胞因子和趋化因子等，同时自体凝血酶又可以把PRP中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，从而形成纤维蛋白凝胶。把制成的凝胶应用到伤口处，可以作为组织密封剂，又可以促进伤口的修复。凝血酶和PRP可在使用之前混合，也可以在伤口处混合。这样制成的自体凝血酶用品，不会有异体凝血酶的排斥性问题，也不会有受病毒感染的可能性。
对比用钙盐作为试剂制备凝血酶而言，本发明联用钙盐与埃洛石纳米管(HNTs)制备的凝血酶活性高。另外，在实验条件相同的情况下，用本发明的凝血酶激活PRP形成凝胶的体积大并且激活时间短。
以上仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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