具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药剂原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

如本文所用，术语“治疗”涵盖治疗受试者的疾病或病症的所有方式，其包括：抑制、缓解、减轻、改善、治愈疾病或病症的一种或多种症状。

本发明具体提供了ALDH1L2在制备用于肥胖受试者的结直肠癌的筛查、诊断、监测或预后的试剂或试剂盒中的应用。在一些实施方案中，所述试剂或试剂盒通过检测ALDH1L2基因表达产物的表达水平来判断所述受试者是否患有结直肠癌；优选地，所述诊断为辅助诊断；优选地，所述监测为治疗监测；优选地，所述预后为预后判断。在一些实施方案中，所述ALDH1L2基因表达产物为ALDH1L2蛋白。在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物或人；优选地，所述哺乳动物为猪、狗、猫、小鼠、大鼠或兔；更优选地，所述哺乳动物为小鼠。

为了阐明肥胖受试者的结直肠癌的分子机制，寻找特异性针对肥胖受试者结直肠癌的治疗靶点，本发明人在高脂饮食喂养的小鼠模型中接种结直肠癌细胞。与正常饮食喂养的小鼠相比，高脂饮食显著促进肿瘤生长。采用高通量、高灵敏度线性轨道离子阱色谱-质谱技术，分析与正常饮食相比较的高脂饮食和/或5-FU治疗所产生的结直肠癌细胞中蛋白质差异表达情况，发现共有差异蛋白质9种。对共有差异蛋白质进行IPA经典通路分析，发现其中ALDH1L2蛋白参与的重要代谢和信号通路数量最多，提示ALDH1L2是高脂条件下的结直肠癌的重要的调控靶点。进一步将ALDH1L2蛋白的质谱检测结果量化，并用western blot验证ALDH1L2蛋白表达水平，发现ALDH1L2蛋白在高脂饮食喂养的小鼠的结直肠癌细胞中表达显著升高，并且在经5-FU治疗后表达水平显著降低。另一方面，收集临床结直肠癌患者的肿瘤组织和肿瘤周围对应的正常组织分析ALDH1L2的表达差异，发现高甘油三酯水平的结直肠癌患者的肿瘤组织和正常组织的ALDH1L2表达差异显著，而正常甘油三酯水平的结直肠癌患者的肿瘤组织和正常组织的ALDH1L2表达差异较小。动物实验和临床研究均表明ALDH1L2蛋白与肥胖受试者的结直肠癌具有强相关性，并且这种与ALDH1L2的强相关性对于肥胖受试者的结直肠癌具有特异性，说明ALDH1L2是肥胖受试者的结直肠癌的特征蛋白，ALDH1L2是高脂条件下的结直肠癌的重要的调控靶点。因此ALDH1L2可以应用于肥胖受试者的结直肠癌的筛查、诊断、监测或预后。

为了进一步研究高脂对于结直肠癌的作用和影响，以及ALDH1L2在肥胖受试者的结直肠癌中所发挥的功能，本发明人进行了结直肠癌细胞体外培养等实验研究，结果表明一定浓度的脂肪酸不但能促进结直肠癌细胞增殖，而且能促进结直肠癌细胞的迁移，诱导ALDH1L2的表达增加，从另一个角度说明ALDH1L2与肥胖受试者的结直肠癌具有强相关性。

与正常生理条件下结直肠癌相比较，高脂条件下结直肠癌的发展以及结直肠癌细胞的生理特性和分子机制均有显著变化，表明肥胖受试者的结直肠癌与普通结直肠癌存在显著差异。

首先，高脂饮食小鼠的肿瘤体积显著大于正常饮食小鼠，说明高脂环境促进结直肠癌的发展。其次，肿瘤差异蛋白质组学分析和代谢途径网络分析表明，高脂饮食改变了结直肠癌的蛋白表达模式、代谢途径网络和信号通路。与正常饮食小鼠结直肠癌相比，高脂饮食小鼠结直肠癌中存在表达差异显著的一组肿瘤显著差异蛋白质，与这些肿瘤显著差异蛋白质重叠程度最高即相关性最高的代谢和信号通路依次为：氧化磷酸化、线粒体功能障碍、沉默信息调节因子同源蛋白(Sirtuin)信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号、芳香烃受体信号、丝氨酸和甘氨酸生物合成的超途径、脂肪酸β氧化I、Fcγ受体介导的巨噬细胞和单核细胞吞噬作用、RhoA信号和戊二酰辅酶A降解。

以上通路均与癌症的物质和能量代谢具有不同程度的相关性，尤其是氧化磷酸化、线粒体功能障碍等排序靠前的通路，为与癌症能量代谢重编程高度相关的通路，表明肥胖受试者的结直肠癌与普通结直肠癌在癌症的分子机制上具有显著差异。癌细胞能量代谢发生改变，从线粒体内的氧化磷酸化供能转变为依靠有氧糖酵解，即Warburg效应。线粒体活性氧增多、线粒体DNA突变和拷贝数改变以及线粒体凋亡异常等功能障碍与肿瘤发生发展密切相关。沉默信息调节因子同源蛋白属于烟酰胺(NAD+)依赖性Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，能使肿瘤抑制因子去乙酰化，促进肿瘤发生，影响肿瘤分期及患者预后。肌动蛋白聚合形成细胞骨架微丝，参与应力纤维、黏着斑和伪足等结构的形成，从而促进癌细胞的转移和入侵等；另外，肿瘤细胞内细胞骨架蛋白结构重组，由肌动蛋白组成的微丝可参与信号级联反应，与其他信号分子共同调控肿瘤的增殖和迁移。芳香烃受体在正常生理条件下过表达并结构性活化时，能抑制关键抑癌基因的表达与功能，干扰细胞周期、凋亡、细胞-基质相互作用、血管生成等生理或病理过程，促进癌症的发生、发展及转移，是潜在的致癌基因。快速增殖的癌症细胞必须产生子细胞所必需的蛋白质、脂类和核酸等；癌细胞中丝氨酸合成增加，并且丝氨酸合成途径中的第一个酶磷酸甘油酸脱氢酶的基因拷贝数增加，一些癌症可以通过上调丝氨酸合成获得生长优势。脂肪酸氧化途径在各种人类恶性肿瘤中失调，癌细胞可以在代谢应激下通过脂肪酸β-氧化来提供增殖等所需的ATP和NADPH；脂肪酸氧化还对与癌症相关的免疫细胞和其他宿主细胞进行了重新编程，这可能有助于免疫抑制和促进肿瘤的微环境。RhoA是Ras超家族中具有GTP酶活性的一种小G蛋白分子，RhoA在肿瘤组织的高表达与肿瘤的恶性程度密切相关；另外，RhoA通过信号通路参与细胞骨架，进而诱导细胞癌变及肿瘤细胞增殖、入侵、转移等多种生命活动。

再次，高脂条件不但可以促进结直肠癌细胞增殖，还具有促进结直肠癌细胞迁移的能力，表明肥胖受试者的结直肠癌可能更易于发生癌症的侵袭和转移。5-FU虽然能显著抑制高脂饮食条件下的肿瘤生长，但由高脂饮食引起的血糖和血脂增加在5-FU治疗后并无显著变化，诱导结直肠癌细胞增殖和迁移的高脂条件持续存在，该状况无法通过例如5-FU的传统癌症治疗药物得到缓解或改善。

另外，临床分析表明，高甘油三酯水平的结直肠癌患者的存活时间与正常甘油三酯水平的结直肠癌患者的存活时间相比显著降低，说明肥胖结直肠癌患者与普通结直肠癌患者相比存活时间较短，预后较差。

鉴于肥胖受试者的结直肠癌与普通结直肠癌之间的显著差异，目前用于治疗结直肠癌的手段和药物并不一定适用于肥胖受试者的结直肠癌，或者可能无法取得最佳治疗效果。因此有必要寻找特异性用于治疗肥胖受试者的结直肠癌的有效手段和药物。

本发明人在研究中意外发现，ALDH1L2蛋白为肥胖受试者的结直肠癌的特征蛋白，ALDH1L2为肥胖受试者的结直肠癌的关键调控靶点。

首先，通过肿瘤差异蛋白质组学分析找到了在高脂和/或5-FU治疗等不同体内环境条件下结直肠癌肿瘤中表达水平均发生显著变化的共有差异蛋白质9种，该9种共有差异蛋白质均为与肥胖受试者的结直肠癌高度相关的蛋白质。IPA经典通路分析表明其中的ALDH1L2参与的重要代谢和信号通路数量最多，提示ALDH1L2是肥胖受试者的结直肠癌的关键调控靶点。

IPA经典通路分析得出ALDH1L2参与的信号和代谢通路包括：芳香烃受体信号、异生素代谢信号、LPS/IL-1介导的RXR功能抑制、组胺降解、氧化乙醇降解III、脂肪酸α氧化、腐胺降解III、色氨酸降解X(哺乳动物，通过色胺)、乙醇降解IV、乙醇降解II、多巴胺降解、去甲肾上腺素和肾上腺素降解和血清素降解，这些通路均与癌症的发生发展、侵袭转移以及免疫抑制等具有不同程度的相关性。例如，芳香烃受体在正常生理条件下过表达并结构性活化时，能抑制关键抑癌基因的表达与功能，干扰细胞周期、凋亡、细胞-基质相互作用、血管生成等生理或病理过程，促进癌症的发生、发展及转移，是潜在的致癌基因。异生素代谢可以保护细胞免受DNA损伤，异生素代谢和DNA修复的改变可能会导致癌症发展；另外，异生素代谢与癌症的抗药性有关，异生素代谢相关酶在肿瘤细胞中的表达在肿瘤细胞存活以及药物的肿瘤特异性吸收、分布、代谢和排泄中起作用。类视黄醇X受体(RXR)是炎症反应的有效调节剂，并且在胚胎发育中具有重要作用，RXR表达或功能异常与多种肿瘤及其他疾病相关，RXR激活可以调控正常和恶性细胞的生长和分化。组胺与细胞恶性增殖有密切关系，临床观察发现，恶性实体瘤患者的内源性组胺水平明显低于正常人，且随病情发展下降，血液组胺水平也与患者的生存时间呈正相关。乙醇代谢的主要产物乙醛会损伤DNA，具有致癌作用，并且被列入了世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC)的2类致癌物清单中；人体中已经发现的乙醇代谢途径共有四条，包括三条氧化途径和一条非氧化途径，所有氧化途径都是先将乙醇氧化成乙醛；三条氧化途径的主要区别在于将乙醇氧化成乙醛所用的酶不同，最主要的途径就是用细胞质中的乙醇脱氢酶将乙醇氧化，称为乙醇降解途径II；其他两种氧化途径是内质网乙醇氧化系统，即乙醇降解途径III，以及过氧化物酶体中的过氧化氢酶，即乙醇降解途径IV。脂肪酸氧化途径在各种人类恶性肿瘤中失调，癌细胞可以在代谢应激下通过脂肪酸β-氧化来提供增殖等所需的ATP和NADPH；脂肪酸氧化还对与癌症相关的免疫细胞和其他宿主细胞进行了重新编程，这可能有助于免疫抑制和促进肿瘤的微环境。腐胺是细胞中多胺的一种，多胺含量过多会引起细胞发生癌变，大多数肿瘤细胞中多胺含量过高。在癌症中参与多胺代谢的相关酶失调会导致多胺在体内累积，当多胺水平增高时，多胺与代谢相关酶之间的相互作用会增强，影响酶的二、三级结构稳定性以及催化活性，使癌细胞的恶性程度升高，降低抗肿瘤免疫，从而促进肿瘤的发生和发展。芳香烃受体会被人体自身的代谢产物激活，比如色氨酸代谢物；色氨酸代谢产生的降解产物会促进癌细胞的移动性，并削弱免疫系统的抗肿瘤反应；色氨酸降解酶在多种癌症中表达，并与多种癌症的不良临床结局相关。多巴胺与其受体同肿瘤的发生密切相关；多巴胺通过D1型受体抑制人调节性T细胞CD8+的功能，而调节性T细胞是肿瘤逃逸宿主免疫系统的关键因子。肾上腺素和去甲肾上腺素会结合β2肾上腺素受体，激活特定的信号通路，提高IL-6的水平，促使癌细胞产生对抗癌药的耐受；去甲肾上腺素可促进神经肽Y的产生，神经肽能够招募巨噬细胞，并促进其分泌IL-6，激活肿瘤细胞STAT3通路，促进肿瘤发展。血清素是多种癌症的生长因子，参与癌细胞的迁移、转移和血管生成；在多种癌症中，血清素受体同样存在表达失调。

其次，将ALDH1L2蛋白的表达水平量化，发现高脂饮食条件下结直肠癌肿瘤中ALDH1L2蛋白的表达水平与正常饮食条件下相比显著升高，经过5-FU治疗后显著降低。另外，临床分析发现，正常甘油三酯水平的结直肠癌患者的肿瘤组织和该患者肿瘤附近正常组织的ALDH1L2蛋白表达水平差异较小，高甘油三酯水平的结直肠癌患者的肿瘤组织中ALDH1L2蛋白表达水平显著高于该患者肿瘤附近的正常组织。对ALDH1L2蛋白的量化分析进一步说明ALDH1L2蛋白与肥胖受试者的结直肠癌具有显著相关性，是肥胖受试者的结直肠癌的特征蛋白。

作为与肥胖受试者的结直肠癌显著相关的特征蛋白和关键调控靶点，ALDH1L2和ALDH1L2蛋白在特异性治疗肥胖受试者的结直肠癌中具有重要潜力。

本发明具体提供了ALDH1L2抑制剂在制备用于治疗肥胖受试者的结直肠癌的药物中的应用。在一些实施方案中，所述ALDH1L2抑制剂特异性抑制、下调或阻断ALDH1L2基因表达。在一些实施方案中，所述ALDH1L2抑制剂为特异性抑制、下调或阻断ALDH1L2基因表达的siRNA；优选地，所述siRNA选自如表1所示的siRNA1、siRNA2或siRNA3。

本发明人在研究中设计并筛选出特异性针对ALDH1L2的siRNA对结直肠癌细胞ALDH1L2的表达水平进行敲低，发现敲低后脂肪酸失去了促进结直肠癌细胞增殖和迁移的能力，另外，敲低后脂肪酸失去了诱导ALDH1L2表达升高的作用，表明特异性针对ALDH1L2的siRNA可显著抑制脂肪酸诱导的肿瘤细胞增殖和迁移，在治疗肥胖受试者的结直肠癌、改善肥胖结直肠癌患者的预后中具有重要作用。

本发明还提供了一种用于肥胖受试者的结直肠癌的筛查、诊断、监测或预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测ALDH1L2基因表达产物的表达水平的试剂。在一些实施方案中，所述ALDH1L2基因表达产物为ALDH1L2蛋白，所述受试者为哺乳动物或人；优选地，所述哺乳动物为猪、狗、猫、小鼠、大鼠或兔；更优选地，所述哺乳动物为小鼠；优选地，所述诊断为辅助诊断；优选地，所述监测为治疗监测；优选地，所述预后为预后判断。

本发明还提供了一种用于治疗肥胖受试者的结直肠癌的药物组合物，所述药物组合物包含ALDH1L2抑制剂以及药学上可接受的赋形剂或载体。优选地，所述ALDH1L2抑制剂特异性抑制、下调或阻断ALDH1L2基因表达。优选地，所述ALDH1L2抑制剂为特异性抑制、下调或阻断ALDH1L2基因表达的siRNA。更优选地，所述siRNA选自如表1所示的siRNA1、siRNA2或siRNA3。此外，所述药物组合物可进一步包含对于治疗结直肠癌有用的其他药物成分。

实验测试

测试1：高脂饮食对结直肠癌发展的作用和影响

为了阐明肥胖受试者的结直肠癌的分子机制，寻找特异性针对肥胖受试者的结直肠癌的潜在调控靶点，建立了高脂饮食喂养的小鼠模型，并接种结直肠癌细胞，研究了高脂饮食对结直肠癌生长的影响，进行了肿瘤差异蛋白质组学分析以及肿瘤相关代谢及信号通路分析。

如图1a所示，首先将小鼠分为高脂饮食(HFD)组和对照组，高脂饮食组采用高脂饮食喂养，对照组采用正常饮食喂养，喂养3个月后分别皮下接种小鼠结肠癌细胞CT26，接种后继续培养10天。10天后正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠各有一半开始采用5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗，另一半仅给予赋形剂作为对照，从而将接种肿瘤小鼠分为总共4组，即正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)、正常饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(5-FU)、高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD)和高脂饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(HFD+5-FU)。继续培养并记录肿瘤生长状况直至实验终点，对各组小鼠体重称重，采血测血糖，并采集血清测甘油三酯、总胆固醇。

高脂饮食小鼠皮下接种结直肠癌细胞后，相较于正常饮食小鼠，肿瘤生长明显加快。如图1b所示，高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD)的肿瘤明显大于正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)的肿瘤，且具有统计学意义，差异显著(P<0.01)。正常饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(5-FU)的肿瘤明显小于正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)的肿瘤，且具有统计学意义，差异显著(P<0.01)；高脂饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(HFD+5-FU)的肿瘤明显小于高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD)的肿瘤，且具有统计学意义，差异显著(P<0.001)，表明正常饮食接种肿瘤小鼠和高脂饮食接种肿瘤小鼠对5-FU的治疗都是敏感的。

实验终点时对各组小鼠测量体重，采血测血糖，并采集血清测甘油三酯、总胆固醇，发现相对于正常饮食小鼠，高脂饮食小鼠体重增加，血糖升高，甘油三酯和总胆固醇升高。图1c-图1f分别示出了正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)、正常饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(5-FU)、高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD)和高脂饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(HFD+5-FU)的血糖、体重、总胆固醇以及甘油三酯水平，其中高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD)的体重、总胆固醇和甘油三酯均明显高于正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)，且具有统计学意义，差异显著(体重P<0.001、总胆固醇P<0.05、甘油三酯P<0.001)，经过5-FU治疗的高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD+5-FU)的血糖、体重和甘油三酯仍然明显高于正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)，且具有统计学意义，差异显著(血糖P<0.05、体重P<0.001、甘油三酯P<0.001)，说明高脂饮食的结直肠癌小鼠的血糖血脂与正常饮食的结直肠癌小鼠相比具有显著差异，且在经过传统抗癌药物5-FU治疗后，结直肠癌小鼠由高脂饮食造成的高血糖高血脂的体内环境仍然存在。

提取肿瘤组织总蛋白进行肿瘤差异蛋白质组学以及肿瘤相关代谢及信号通路分析，具体操作如下：取各组小鼠的肿瘤组织加入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(RIPA缓冲液)并在液氮中冻融，用研磨棒反复研磨至没有明显的组织块，再补加裂解缓冲液至每100mg肿瘤组织1ml裂解缓冲液，随后置于4℃冰箱中裂解30分钟，期间混匀3次，随后在12000转下离心10min，取上清即为所需要的蛋白质；利用高通量、高灵敏度线性轨道离子阱色谱-质谱技术得到肿瘤组织蛋白质的高通量鉴定。将质谱检测数据中不同组别显著差异蛋白质进行统计，然后将分组数据导入IPA数据库，数据库可根据差异蛋白质信息分析出与其密切相关的代谢和信号通路。

肿瘤差异蛋白质统计结果如图2a-图2b所示，与正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)相比较，高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD)中共有98种蛋白质差异表达，其中53种蛋白表达上调、45种蛋白表达下调；正常饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(5-FU)中共有141种蛋白质差异表达，其中93种蛋白表达上调、48种蛋白表达下调；高脂饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(HFD+5-FU)中共有147种蛋白质差异表达，其中68种蛋白表达上调、79种蛋白表达下调。在高脂饮食接种肿瘤小鼠(HFD)、正常饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(5-FU)和高脂饮食接种肿瘤并5-FU治疗小鼠(HFD+5-FU)分别与正常饮食接种肿瘤小鼠(NC)相比较得到的HFD vs.NC、5-FUvs.NC和HFD+5-FU vs.NC三组差异蛋白质当中，三组各自独有的差异蛋白质分别为74种、82种和93种；HFD vs.NC和5-FU vs.NC、5-FU vs.NC和HFD+5-FU vs.NC以及HFD vs.NC和HFD+5-FU vs.NC两组共有的差异蛋白质分别为19种、49种和14种，而三组共有的差异蛋白质为9种。肿瘤差异蛋白质的统计结果表明高脂饮食和/或5-FU治疗均使结直肠癌的蛋白质表达模式发生了明显改变，经过差异蛋白质组间比较得到9种共有差异蛋白质在高脂饮食和/或5-FU治疗的结直肠癌不同体内环境下均差异表达，与肥胖受试者的结直肠癌相关性最强，为进一步筛选与肥胖受试者相关的结直肠癌的肿瘤生物标志物和关键调控靶点奠定了基础。

高脂饮食接种肿瘤小鼠与正常饮食接种肿瘤小鼠相比较(HFD vs.NC)的肿瘤差异蛋白质相关的代谢及信号通路分析结果如图2c所示，按照与肿瘤差异蛋白质数据集重叠程度由高至低排列依次为：氧化磷酸化、线粒体功能障碍、沉默信息调节因子2相关酶类(Sirtuin)信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号、芳香烃受体信号、丝氨酸和甘氨酸生物合成的超途径I、脂肪酸β氧化I、RhoA信号、Fcγ受体介导的巨噬细胞和单核细胞吞噬作用和戊二酰辅酶A降解。以上通路均与癌症的物质和能量代谢具有不同程度的相关性，尤其是氧化磷酸化、线粒体功能障碍等排序靠前的通路，为与癌症能量代谢重编程高度相关的通路，说明高脂饮食使结直肠癌的代谢和信号通路发生显著改变，肥胖受试者的结直肠癌在癌症的分子机制上与普通结直肠癌具有显著差异。

测试2：ALDH1L2蛋白是肥胖受试者的结直肠癌的特征蛋白

采用IPA经典信号通路功能分析在测试1中通过肿瘤差异蛋白质组学分析找到的与肥胖受试者的结直肠癌相关的9种共有差异蛋白质，发现其中ALDH1L2参与了多达13条重要代谢和信号通路，分别为芳香烃受体信号、异生素代谢信号、LPS/IL-1介导的RXR功能抑制、组胺降解、氧化乙醇降解III、脂肪酸α氧化、腐胺降解III、色氨酸降解X(哺乳动物，通过色胺)、乙醇降解IV、乙醇降解II、多巴胺降解、去甲肾上腺素和肾上腺素降解和血清素降解。ALDH1L2蛋白为9种共有蛋白质中参与重要代谢和信号通路最多的蛋白质，表明ALDH1L2可能是肥胖受试者的结直肠癌的关键调控靶点。

为了进一步研究ALDH1L2在肥胖受试者的结直肠癌中所起的作用，对ALDH1L2蛋白的质谱检测结果进行了相对量化，并且为了确保检测结果的准确性和一致性，使用优选ALDH1L2抗体(proteintech，抗体货号：21391-1-AP，抗体浓度：1:1000)对ALDH1L2的表达水平进行了Western blot验证。ALDH1L2蛋白质谱检测的相对量化结果如图3a所示，高脂饮食条件下的结直肠癌中ALDH1L2蛋白的表达水平明显高于正常饮食条件下的结直肠癌，且具有统计学意义，差异显著(P<0.05)；无论是高脂饮食还是正常饮食，经过5-FU治疗后结直肠癌中的ALDH1L2表达水平都明显降低，且具有统计学意义，差异显著(正常饮食P<0.05，高脂饮食P<0.01)。ALDH1L2蛋白表达水平的Western blot结果如图3b所示，验证了质谱相对量化结果中ALDH1L2蛋白表达水平差异及其变化规律，说明ALDH1L2蛋白是与肥胖受试者的结直肠癌显著相关的特征蛋白。

测试3：脂肪酸促进结直肠癌细胞的增殖和迁移以及ALDH1L2蛋白在结直肠癌细胞中的表达

为了进一步研究高脂对于结直肠癌的作用和影响，以及ALDH1L2在肥胖受试者的结直肠癌中所发挥的功能，利用细胞体外培养技术，选取棕榈酸(PA)和油酸(OA)研究了脂肪酸对CT26细胞的增殖和迁移的作用。CT26是以N-甲基-N-亚硝基氨基甲酸乙酯(NNMU)诱导形成的未分化结肠癌细胞株。油酸是最具有代表性的单不饱和脂肪酸，几乎存在于所有的天然油脂中；棕榈酸是加工食品中广泛使用的棕榈油中所含的一种饱和脂肪酸，与肥胖等一些慢性疾病患病风险有正相关性。如图4a所示，实验发现在25μM棕榈酸或油酸作用下，CT26细胞的增殖率均明显大于正常状态下CT26细胞(NC)的增殖率，且具有统计学意义，差异显著(P<0.01)，说明25μM棕榈酸或油酸对结肠癌细胞具有促进增殖的作用。选定该浓度研究脂肪酸对ALDH1L2蛋白的表达水平和CT26细胞迁移的影响，结果如图4b和图4c所示，发现该浓度下棕榈酸或油酸能诱导ALDH1L2表达增加，且能增加结直肠癌细胞的迁移。以上结果表明脂肪酸能够促进结直肠癌细胞的增殖和迁移以及ALDH1L2蛋白在结直肠癌细胞中的表达。

测试4：ALDH1L2-siRNA对结直肠癌细胞及脂肪酸作用的影响

根据ALDH1L2的基因序列设计了如表1所示的3对特异性针对ALDH1L2的siRNA引物，进行CT26细胞中ALDH1L2表达水平的敲低实验，用于研究ALDH1L2用于肥胖受试者的结直肠癌的靶向治疗的潜力。

表1中的siRNA为在哺乳动物细胞中能够增加传统RNA干扰的强度的叉状双链siRNA。采用Western blot研究表1中特异性针对ALDH1L2的siRNA对CT26细胞中ALDH1L2表达水平的敲低效果，结果如图5a所示，表1中的三种siRNA均能够明显降低CT26细胞中ALDH1L2的表达水平。敲低ALDH1L2后，再向CT26细胞培养基中加入25μM棕榈酸或油酸，研究敲低ALDH1L2表达水平对脂肪酸作用下结直肠癌细胞增殖和迁移的影响，结果分别如图5b和图5d所示。如图5b所示，使用三种特异性针对ALDH1L2的siRNA敲低ALDH1L2表达水平后，在棕榈酸或油酸作用下的结直肠癌细胞增殖率均明显降低，且具有统计学意义，差异显著。其中，在棕榈酸作用下三种特异性针对ALDH1L2的siRNA所产生的结直肠癌细胞增值率降低(P<0.01)；在油酸作用下si-ALDH1L2-1和si-ALDH1L2-2所产生的结直肠癌细胞增值率降低(P<0.05)，si-ALDH1L2-3所产生的结直肠癌细胞增值率降低(P<0.01)。如图5d所示，敲低ALDH1L2表达水平后再次对结直肠癌细胞的迁移能力进行分析，发现结直肠癌细胞迁移能力降低，并且添加棕榈酸和油酸也不会促进结直肠癌细胞的迁移增加。另外，如图5c所示，与未进行ALDH1L2敲低并添加棕榈酸(NC+PA)或油酸(NC+OA)培养结直肠癌细胞相比，使用特异性针对ALDH1L2的siRNA(S2)敲低正常培养的结直肠癌细胞(NC)中的ALDH1L2表达水平后，再加棕榈酸(S2+PA)或油酸(S2+OA)培养结直肠癌细胞，ALDH1L2蛋白的表达水平仍然受到抑制，表明用siRNA敲低ALDH1L2的表达水平后，脂肪酸不会诱导ALDH1L2表达升高。以上结果说明，特异性针对ALDH1L2的siRNA可以使脂肪酸失去对结直肠癌细胞的增殖和迁移的促进作用，干预ALDH1L2可以特异性地用于肥胖受试者的结直肠癌的精准治疗，改善肥胖结直肠癌患者的预后，并取得显著的治疗效果。

测试5：临床结直肠癌组织中ALDH1L2表达水平与预后的关系

收集滨州医学院烟台附属医院2014-2015年确诊结直肠癌、采取手术治疗并进行常规化疗的患者的回访资料，将结直肠癌患者分为高甘油三酯组和正常甘油三酯组，其中高甘油三酯组共15例患者，正常甘油三酯组共33例患者，统计患者存活时间并绘制生存曲线。结果如图6a所示，与正常甘油三酯组相比，高甘油三酯组(高TC)存活时间明显降低，并且具有统计学意义，差异显著(P＝0.0153)，表明与普通结直肠癌患者相比，肥胖结直肠癌患者存活时间较短，预后较差。

进一步收集临床结直肠癌患者临床组织和肿瘤周围对应的正常组织，同样分为高甘油三酯组和正常甘油三酯组，分别通过Western Blot检测ALDH1L2蛋白的表达水平。结果如图6b和图6c所示，对于正常甘油三酯水平的结直肠癌患者，肿瘤组织和正常组织ALDH1L2蛋白的表达水平差异较小(图6b)；而对于高甘油三酯水平的结直肠癌患者，肿瘤组织中ALDH1L2蛋白的表达水平显著高于正常组织中ALDH1L2蛋白的表达水平(图6c)。

临床数据表明，与普通结直肠癌相比，肥胖受试者的结直肠癌预后更差，并且ALDH1L2在肿瘤组织与正常组织之间的表达差异在肥胖结直肠癌患者中显著，而在普通结直肠癌患者中较小，表明ALDH1L2表达水平与结直肠癌患者预后相关，可以特异性地用于肥胖受试者的结直肠癌的精准治疗，改善肥胖结直肠癌患者的预后。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。