具体实施方式

本发明的I型胶原蛋白或弹性蛋白的产生促进剂或者它们的基因表达促进剂的有效成分为类菌胞素氨基酸或其盐。

类菌胞素氨基酸是已知由海藻、微型藻等藻类、海产品、霉菌类等生产的具有环己酮结构的氨基酸。本来是作为紫外线吸收物质而被发现的。如上所述，已知类菌胞素氨基酸具有紫外线吸收作用、成纤维细胞生长促进作用，但还不知道具有I型胶原蛋白、弹性蛋白的产生促进作用。

作为类菌胞素氨基酸，例如已知有以下的化合物。

作为本发明中使用的类菌胞素氨基酸或其盐，也可以贝类等海产品、霉菌类等中提取，但优选来自藻类，更优选来自蓝藻类、红藻类、褐藻类或绿藻类，来自藻类的类菌胞素氨基酸中包含上述化合物。

为了从藻类、贝类中提取类菌胞素氨基酸，可以使用水、乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇、乙腈等极性溶剂或它们的混合溶剂从藻类的干燥物或冷冻干燥物中提取。作为提取溶剂，优选为水－乙醇混液，更优选为水：乙醇＝1：9～9：1的混液。得到的提取物优选进一步通过利用活性炭吸附柱、树脂柱等来吸附类菌胞素氨基酸并利用水－乙醇混液进行洗脱而浓缩。也可以进一步通过高效液相色谱进行纯化。

另外，含有类菌胞素氨基酸的藻类提取物已被市售，可以使用该市售品。

作为类菌胞素氨基酸的盐，可举出盐酸盐等酸附加盐、钠盐、钾盐等碱金属盐。

类菌胞素氨基酸或其盐如后述实施例所示具有强大的I型胶原蛋白和弹性蛋白的产生促进作用。该优异的I型胶原蛋白和弹性蛋白的产生促进作用强大到无法由类菌胞素氨基酸的成纤维细胞生长促进作用预测的程度。

另外，类菌胞素氨基酸或其盐具有强烈促进I型胶原蛋白基因或弹性蛋白基因的表达的作用。因此，认为类菌胞素氨基酸的I型胶原蛋白或弹性蛋白的产生促进作用基于这些基因表达促进作用。

本发明的I型胶原蛋白或弹性蛋白的产生促进剂具有在生物体内的各种部位促进I型胶原蛋白或弹性蛋白的产生的作用。因此，出于关节痛、关节运动的改善剂、皮肤的弹力改善剂等目的，本发明的I型胶原蛋白或弹性蛋白的产生促进剂作为医药品、准药品、化妆品、特定保健用食品、功能性显示食品、功能性食品、美容食品、病人用食品等是有用的。

作为本发明的I型胶原蛋白或弹性蛋白的产生促进剂的给予方式，可举出口服给予、通过注射进行的给予、经皮给予等。在作为医药品、准药品、功能性显示食品等使用的情况下，优选为片剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂、锭剂等口服给予制剂；乳膏剂、软膏剂、乳液、化妆水等皮肤外用剂。另外，在特定保健用食品、功能性显示食品的情况下，也可以是与饮料、酸奶等通常的食品同样的形态。

在上述制剂中的类菌胞素氨基酸或其盐的配合量没有特别限定，优选为0.001～50质量％，更优选为0.001～30质量％。

在上述口服给予用制剂中，除类菌胞素氨基酸或其盐以外，还可以配合赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等。另外，在皮肤外用剂的情况下，除类菌胞素氨基酸或其盐以外，还可以配合各种油剂、色素、防腐剂、表面活性剂、增稠剂等。此外，也可以配合其它透明质酸产生促进剂。

实施例

接着，举出实施例对本发明进行进一步详细说明。

试验例1(表皮细胞毒性试验)

1)来自人正常皮肤的表皮细胞的培养条件

将来自人正常皮肤的表皮细胞使用HuMedia－KG2(表皮细胞专用培养基)，在CO₂培养箱(5％CO₂、37℃)内进行培养。每隔一天进行培养基更换。

2)细胞毒性试验

将正常人表皮细胞以2×10⁴个/100μL/well的浓度接种于96孔板，第二天，更换为包含各浓度样品(将10％设为最高浓度的10倍稀释系列， 8级浓度)的培养基(100μL/well)，培养24小时。在培养结束时利用相差显微镜观察细胞形态，去除培养基，用PBS清洗一次后，加入以10％的浓度添加了活细胞数测定试剂SF的培养基100μL，以37℃、5％CO₂孵育90分钟，其间每隔30分钟使用酶标仪测定样品的吸光度(测定波长： 450nm、对照波长：595nm)。细胞的增殖性(viability)作为60分钟后～ 0分钟后的O.D.值而算出。其后，作为将没有添加样品的试验区设为100％时的相对值，示出细胞存活力(Cell Viability)。各试验浓度以n＝3实施。

3)结果

作为样品，即使添加0.00001mg/mL～10mg/mL的类菌胞素氨基酸 (与日本特开2007－16004号公报同样地利用70％乙醇水溶液和活性炭柱从藻类进行提取分级而得的类菌胞素氨基酸干燥物)进行培养，也没有显示任何细胞毒性。

试验例2(成纤维细胞增殖试验)

1)培养条件

正常人成纤维细胞使用添加有10％FBS的D－MEM培养基在CO₂培养箱(5％CO₂、37℃)内进行培养。添加有10％FBS的D－MEM培养基是在D－MEM培养基445mL中加入FBS50mL和青霉素-链霉素溶液 (Penicillin-streptomycin solution)5mL而制备的。

2)细胞活化试验(WST－8测定)

将在增殖培养基中制备成5×10⁴个/mL的成纤维细胞每1孔(96孔板)接种100μL(5×10³个/100μL/1孔)。这是在第二天约50％汇合、即达到对数声场期的细胞数，是适于对被验物质对细胞增殖活性造成的影响进行解析的细胞数。接种后培养约24小时，更换为包含各浓度样品的增殖培养基100μL，进一步培养24小时。在培养结束时去除培养基，加入以10％的浓度添加了活细胞数测定试剂SF的培养基100μL，以37℃、 5％CO₂进行孵育(测定波长：450nm，对照波长：595nm)。添加后，在 30分钟、90分钟后利用酶标仪测定吸光度(测定：450nm)，由90分钟、 30分钟的值算出每1小时的吸光度变化量。各试验浓度以n＝5实施。

3)结果

类菌胞素氨基酸1mg/mL添加组中的活细胞数相对值为109±2.22％，与无添加组中的100±1.43％相比，高约10％，与无添加组相比，显著(p ＜0.05)增加。

[表1]

细胞存活力(％)

试验例3(基因表达试验)

使使用培养基为D－MEM(Sigma公司)+10％FBS(BWT公司)，以9.0×10⁴/孔(12孔板)接种人正常成纤维细胞(HDFn，Gibco公司)，固着后，替换为Starvation培养基(D－MEM(Sigma公司))24小时。其后，更换为将类菌胞素氨基酸在D―MEM中以成为0、10、25、30、 40和50μg/mL的方式制备的培养基，在3小时后回收细胞，使用RNA 提取试剂盒(ReliaPrep^TMRNAMiniprep Systems/目录号Z6012，Promega 公司)提取RNA后，合成cDNA(东洋纺，产品编号FSQ－301S)，利用实时RT－PCR(SYBR Fast qPCR Mix，目录号RR430B，Takara Bio公司)进行I型胶原蛋白基因和弹性蛋白基因的表达解析。

使用的引物如下。为了使基因表达标准化，利用核糖体蛋白侧柄亚基 (RibosomalProtein Lateral Stalk Subunit P0，RPLPO)基因的表达量进行了校正。

[表2]

其结果，如图1和图2所示，在弹性蛋白基因和I型胶原蛋白基因中，类菌胞素氨基酸浓度为30μg/mL时，特别是基因表达增强。

序列表

<110> 株式会社医择

<120> I型胶原蛋白或弹性蛋白的产生促进剂

<130> DOC0001

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于弹性蛋白基因设计的 DNA

<400> 1

aggtgtatac ccaggtggcg tgct 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于弹性蛋白基因设计的 DNA

<400> 2

caacccctgt ccctgttggg taac 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于I型胶原蛋白基因设计的 DNA

<400> 3

ctggtcccca aggcttccaa ggtc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于I型胶原蛋白基因设计的 DNA

<400> 4

ccatcatttc cacgagcacc agca 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于RPLPO基因设计的 DNA

<400> 5

ttcgacaatg gcagcatcta caa 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于RPLPO基因设计的 DNA

<400> 6

ctgcagacag acactggcaa ca 22