麻类植物提取化合物Cannabiorcol在制备抗肿瘤药物上的用途
阅读说明：本技术 麻类植物提取化合物Cannabiorcol在制备抗肿瘤药物上的用途 (Application of Cannabicol extracted from hemp plant in preparing antitumor drug ) 是由 林志灿 张靖 单世斌 张婷 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种麻类植物提取化合物Cannabiorcol在制备抗肿瘤药物上的新用途,本发明发现化合物Cannabiorcol能在体外抑制肿瘤细胞增殖,通过CKK8细胞增殖毒性实验、细胞划痕实验、细胞克隆集落形成法检测,发现该化合物能显著抑制肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549的增殖、迁移和克隆形成,具备开发抗肿瘤药的潜力。(The invention discloses a new application of a compound Cannabioorcol extracted from a hemp plant in preparing an anti-tumor medicament, and finds that the compound Cannabioorcol can inhibit the proliferation of tumor cells in vitro, and the compound can obviously inhibit the proliferation, migration and clone formation of liver cancer cells HepG2 and lung cancer cells A549 through the detection of a CKK8 cell proliferation toxicity experiment, a cell scratch experiment and a cell clone colony forming method, and has the potential of developing anti-tumor medicaments.)
技术领域
本发明属于天然产物化学和药理学技术领域，具体涉及麻类植物提取化 合物Cannabiorcol在制备抗肿瘤药物上的用途。
背景技术
医学上麻类植物的提取物经常被用来辅助某些癌症、艾滋病的治疗，用 来增进食欲、减轻疼痛，缓解青光眼和癫痫、偏头痛等神经症状，治疗情绪 不稳，减轻化疗病人的恶心症状等。
麻类植物是化学型复杂的植物，主要是因其自身含有许多天然化学成分。 截至1980年，从大麻植株中分离出来的化合物共有432种，到1995年增加 至483种，2005年增加至490种。据统计，至今从大麻植株中分离得到的化 合物共有700多种，分为植物大麻素和非大麻素两大类，已报道的植物大麻 素有120种。
不同的生活习惯和环境因素等原因导致癌症的发生率逐渐偏高。很多恶 性肿瘤发现时已是晚期，一旦发现就很难治愈，所以对于大麻中活性成分的 分离具有很重要的意义。对“内源性大麻素”系统认识的进步预示着基于大 麻的药物可能具有治疗晚期癌症的潜力。目前已有多个从大麻中分离获得的 大麻素被证明对肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤有显著抑制效 果。比如：Δ9-THC、Δ8-THC、CBD、CBG、CBC等。大麻素化合物抗肿瘤作用一 般通过4种途径实现：1、通过直接抑制肿瘤细胞增殖，从而抑制肿瘤生长； 2、大麻素可以抑制肿瘤转移；3、通过促进肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤生长；4、 关闭肿瘤细胞发出的促进血管发生的信号，切断肿瘤生长所需的营养来源。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供了一种麻类植物提取化合物Cannabiorcol在制备抗肿瘤药物上的新用途。化合物Cannabiorcol分子式为 C17H18O2，分子量为254.13，结构式如式1所示：
本发明提供了麻类植物提取化合物Cannabiorcol在制备抗肿瘤药物上的 用途。
为了更好的实现本发明，所述肿瘤为肝癌或肺癌。
为了更好的实现本发明，所述抗肿瘤药物包括活性成分和药学上可接受 的辅料，所述活性成分包括麻类植物提取化合物Cannabiorcol。
为了更好的实现本发明，所述抗肿瘤药物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本发明分离纯化Cannabiorcol的方法，包括如下步骤：
(1)对麻类植物花序依次进行二氧化碳超临界萃取，得到粗提物浸膏；
(2)将粗提物浸膏用石油醚充分溶解，上正相硅胶柱层析进行等梯度洗 脱，得目标化合物一级组分；
(3)取一级组分上D101大孔吸附树脂柱层析进行梯度洗脱，得目标化 合物二级组分；
(4)取二级组分上压正相硅胶柱层析进行梯度洗脱，得目标化合物三级 组分；
(5)取三级组分上中压反相硅胶柱层析进行梯度洗脱，得目标化合物四 级组分
(6)取四级组分上制备型HPLC高压反相色谱进行梯度洗脱，得化合物Cannabiorcol。
为了更好的实现本发明，制备步骤中，步骤(1)二氧化碳超临界萃取条 件为：P萃取釜＝30MPa，T萃取釜＝45℃；P分离釜I＝8MPa，T分离釜I＝45℃；P分离釜II＝6MPa， T分离釜II＝35℃；加入物料重量20％的乙醇作为携带剂。
为了更好的实现本发明，制备步骤中，步骤(2)所述正相硅胶柱层析洗 脱体系为正己烷/乙酸乙酯＝98:2等梯度洗脱；步骤(3)所述D101大孔吸附 树脂柱层析洗脱体系为乙醇/水30％～100％梯度洗；步骤(4)所述压正相硅胶 柱层析洗脱体系为二氯甲烷/乙酸乙酯；步骤(5)所述中压反相硅胶柱层析 洗脱体系为甲醇/水梯度洗脱；步骤(6)制备型HPLC高压反相色谱洗脱体系 为52％乙腈/水等梯度洗脱。
本发明发现化合物Cannabiorcol能在体外抑制肿瘤细胞增殖，CKK8细胞 增殖毒性实验表明，该化合物在浓度为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL时分 别对肝癌细胞HepG2抑制率约40.94％、87.78％、81.74％；对肺癌细胞A549抑 制率约48.99％、84.19％、85.22％，且抑制效果比同浓度顺铂更佳。
同时，细胞划痕实验实验表明，该化合物在浓度为5μg/mL、10μg/mL、 20μg/mL时作用24h，对肝癌细胞HepG2划痕修复率约48.08％、16.48％、2.27％； 对肺癌细胞A549抑制率44.9％、17.89％、7.69％；增加作用时间至48h，对肝 癌细胞HepG2划痕修复率约57.69％、17.85％、3.41％；对肺癌细胞A549抑制 率约43.88％、16.84％、10.58％。
同时，细胞克隆集落形成实验表明，该化合物在浓度为5μg/mL、10μ g/mL、20μg/mL时对肝癌细胞HepG2克隆形成率约38.30％、2.13％、1.06％， 对肺癌细胞A549克隆形成率约88.46％、9.62％、3.85％。上述实验表明该化 合物具备开发抗肿瘤药的潜力。
本发明的有益效果是：本发明发现化合物Cannabiorcol能在体外抑制肿 瘤细胞增殖，通过CKK8细胞增殖毒性实验、细胞划痕实验、细胞克隆集落形 成法检测，发现该化合物能显著抑制肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549的增殖、 迁移和克隆形成，具备开发抗肿瘤药的潜力。
附图说明
图1为式I所示化合物对HepG2肿瘤细胞存活性能的影响；
图2为式I所示化合物对A549肿瘤细胞存活性能的影响；
图3为式I所示化合物对HepG2肿瘤细胞迁移性能的影响；
图4为式I所示化合物对A549肿瘤细胞迁移性能的影响；
图5为式I所示化合物对HepG2肿瘤细胞增殖的影响；
图6为式I所示化合物对A549肿瘤细胞增殖的影响；
图7为式I所示化合物对HepG2肿瘤细胞半抑制浓度(IC50值)的测定；
图8为式I所示化合物对A549肿瘤细胞半抑制浓度(IC50值)的测定；
图9为单体化合物Cannabiorcol经HPLC紫外分析纯度的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不 限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和 惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1
分离纯化化合物的Cannabiorcol的方法，包括如下步骤：
(1)对大麻花序依次进行二氧化碳超临界萃取，二氧化碳超临界萃取条 件为：P萃取釜＝30MPa，T萃取釜＝45℃；P分离釜I＝8MPa，T分离釜I＝45℃；P分离釜II＝6MPa， T分离釜II＝35℃；加入物料重量20％的乙醇作为携带剂，得到粗提物浸膏；
(2)将粗提物浸膏用石油醚充分溶解，上正相硅胶柱层析进行等梯度洗 脱，洗脱体系为正己烷/乙酸乙酯＝98:2等梯度洗脱，得目标化合物一级组分；
(3)取一级组分上D101大孔吸附树脂柱层析进行梯度洗脱，洗脱体系 为乙醇/水30％～100％梯度洗，得目标化合物二级组分；
(4)取二级组分上压正相硅胶柱层析进行梯度洗脱，洗脱体系为二氯甲 烷/乙酸乙酯，得目标化合物三级组分；
(5)取三级组分上中压反相硅胶柱层析进行梯度洗脱，洗脱体系为甲醇 /水梯度洗脱，得目标化合物四级组分
(6)取四级组分上制备型HPLC高压反相色谱进行梯度洗脱，洗脱体系 为52％乙腈/水等梯度洗脱，得目标化合物，经质谱及核磁共振等分析，所得 目标化合物为化合物Cannabiorcol。
实施例1制备的单体化合物Cannabiorcol经HPLC紫外分析纯度如下表1 和图9：纯度高，稳定性好，且具备良好的生物活性。
表1
从表1和图1可知：实施例方法制备的单体化合物Cannabiorcol，具有 纯度高，稳定性好，且具备良好的生物活性。
实施例2
化合物Cannabiorcol的抗肿瘤活性鉴定：
1.CKK8细胞增殖毒性检测法：
CCK8比色法检测式I所示化合物对肿瘤细胞存活性能的影响
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬 液，细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞)，以 每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板，37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液，实验时用培养液 稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后，实验组分别加入工作浓度为10 μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的式I所示化合物溶液100μL，空白对照 组加入培养液100μL，阳性对照组加入同样浓度的抗肿瘤药物顺铂(DDP) 溶液100μL，将96孔板继续放置培养箱中24h后用CCK8试剂检测细胞存活 率，实验重复3次取平均值。
结果如图1所示，随着式I所示化合物浓度的升高，人肝癌细胞(HepG2) 的存活率越低，即式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)存活性能的抑制作 用越强。
人肺癌细胞(A549)存活性能实验方法同人肝癌细胞(HepG2)，结果如 图2所示，随着浓度的升高，人肺癌细胞(A549)的存活率越低，即式I所 示化合物对人肺癌细胞(A549)存活性能的抑制作用越强。
2.肿瘤细胞迁移：
细胞划痕实验检测式I所示化合物对肿瘤细胞迁移性能的影响：
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬 液，细胞密度约200000个/mL，以每孔1mL细胞悬液将细胞接种于24孔板， 37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所 示化合物溶液，实验时用培养液稀释至所需工作浓度。待细胞贴壁后弃培养 液，用200μL的枪头沿着孔中央作直划痕，用PBS轻轻洗去划痕产生的细胞 团，实验组分别加入工作浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的式I所 示化合物培养液1mL，空白对照组加入培养液1mL，拍照并记录0h、12h、 24h、48h各孔的划痕宽度并计算每孔平均值，最后计算平均划痕修复率，实 验重复3次取平均值，组间使用T-test分析差异显著性，P＜0.05有统计学 意义。
划痕修复率(％)＝(0小时划痕面积-Nh划痕面积)/0小时划痕面积*100
结果如图3所示，与对照组相比，随着不同浓度式I所示化合物作用细 胞时间增加，人肝癌细胞(HepG2)的划痕修复率越低，即式I所示化合物对 人肝癌细胞(HepG2)迁移性能的抑制作用越强。
人肺癌细胞(A549)迁移性能实验方法同人肝癌细胞(HepG2)。结果如 图4所示，与对照组相比，随着不同浓度式I所示化合物作用细胞时间增加， 人肺癌细胞(A549)的划痕修复率越低，即式I所示化合物对人肺癌细胞(A549) 迁移性能的抑制作用越强。
3.细胞克隆集落形成法：
细胞克隆形成实验检测式I所示化合物对肿瘤细胞增殖的影响
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬 液，细胞密度约117个/mL(即每1mL培养液中约含117个细胞)，以每孔3mL 细胞悬液将细胞接种于6孔板，37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以DMSO为溶 剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液，实验时用培养液稀释至所需工 作浓度。6孔板弃培养液后，实验组分别加入工作浓度为5μg/mL、10μg/mL、 20μg/mL的式I所示化合物溶液3mL，空白对照组加入培养液3mL，将6 孔板继续放置培养箱中，每2-3天更换新鲜的培养液或含药物的培养液，持 续培养两周左右，持续观察细胞形态，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时， 终止培养。弃培养液，用PBS小心浸洗2次，加入4％多聚甲醛(PFA)1mL 固定细胞30min。弃PFA后每孔加入1mL0.1％的结晶紫染色30min，超纯水 洗去染色液，6孔板晾干后拍照(图5)并计算克隆形成率。
结果如图5所示，随着浓度的升高，人肝癌细胞(HepG2)的克隆形成率 越低，即式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)增殖性能的抑制作用越强。
人肺癌细胞(A549)增殖实验方法同人肝癌细胞(HepG2)。结果如图6 所示，随着浓度的升高，人肺癌细胞(A549)的克隆形成率越低，即式I所 示化合物对人肺癌细胞(A549)增殖性能的抑制作用越强。
4.式I所示化合物对肿瘤细胞24小时半抑制浓度(IC50值)的测定
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬 液，细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞)，以 每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板，37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液，实验时用培养液 稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后，实验组分别加入工作浓度为1.857 μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL的 式I所示化合物溶液100μL，空白对照组加入培养液100μL，阳性对照组 加入浓度为10μg/mL的抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)溶液100μL，将96孔板 继续放置培养箱中24h后用CCK8试剂检测细胞存活率，实验重复3次取平 均值。通过GraphPad Prism软件绘制剂量抑制曲线，并计算出式I所示化合 物对肿瘤细胞的IC50值。如图7所示，式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2) 的抑制率随着浓度的增加曲线逐渐变得平缓，且随着浓度的升高，肿瘤细胞 抑制率升高，呈现递增关系。
人肺癌细胞(A549)24小时半抑制浓度(IC50值)实验方法同人肝癌细胞 (HepG2)。如图8所示，式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)的抑制率随 着浓度的增加曲线逐渐变得平缓，且随着浓度的升高，肿瘤细胞抑制率升高， 呈现递增关系。
抗肿瘤细胞增殖实验结果：采用肿瘤细胞存活率、克隆集落形成率、肿 瘤细胞迁移率作为指标，发现随着式1所示化合物浓度的增加，肿瘤细胞存 活率、克隆集落形成率、肿瘤细胞迁移率降低，呈现递减关系，且与对照组 有显著性差异，表明式1所示化合物随着浓度的增加抗肿瘤细胞增殖活性逐 渐增强，说明了肿瘤细胞增殖与式1所示化合物浓度有关，表明化合物具有 很强的抗肿瘤细胞增殖活性。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知 了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所 述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本 发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用 在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。