二恶英在抑制细胞迁移中的应用
阅读说明：本技术 二恶英在抑制细胞迁移中的应用 (Application of dioxin in inhibiting cell migration ) 是由 赵斌 刘奕耘 谢群慧 徐丽 陈旸升 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及二恶英在抑制细胞迁移中的应用,具体地,本发明涉及二恶英或含有二恶英的药物组合物在制备抑制胶质瘤细胞迁移的药物中的用途。本发明首次发现特定浓度的TCDD可抑制胶质母细胞瘤细胞系U87的迁移,为胶质母细胞瘤的治疗提供了一种新的选择。(The invention relates to application of dioxin in inhibition of cell migration, in particular to application of dioxin or a pharmaceutical composition containing dioxin in preparation of drugs for inhibiting glioma cell migration. The invention discovers that TCDD with a specific concentration can inhibit the migration of a glioblastoma cell line U87 for the first time, and provides a new choice for the treatment of glioblastoma.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地，本发明涉及癌症治疗相关技术。本发明主要包括二恶英在抑制细胞迁移中的应用，特别地公开了TCDD在抑制胶质母细胞瘤细胞迁移中的应用。
背景技术
在所有癌症相关的病例研究中，脑和中枢神经系统肿瘤是导致癌症相关死亡的第三大原因。在脑部肿瘤中，星形细胞瘤发病率较高，占原发性中枢神经系统肿瘤的15.1％，占原发性中枢神经系统恶性肿瘤的46.1％。其中胶质母细胞瘤最为常见，属于一种具有极高侵袭性的原发性胶质瘤，也是世界卫生组织(WHO)肿瘤恶性程度分类中的第IV级肿瘤。
胶质母细胞瘤的综合治疗包括手术、放疗、全身治疗(化疗、靶向治疗)和支持治疗等，但总体预后仍然很差，长期生存率很低。本领域仍需更多用于胶质母细胞瘤的治疗手段。
发明内容
研究显示胶质母细胞瘤存在弥漫性生长，除颅内短距离迁移外，也发现了肿瘤细胞向颅外转移的情况。因此，抑制胶质母细胞瘤的迁移运动可能对治疗肿瘤，降低术后复发风险和提高疾病预后是有益的。
二恶英是多氯二苯并-p-二恶英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs)的通用名称，包括2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英(TCDD)等。TCDD曾被认为具有致癌作用，被国际卫生组织(WHO)划分为一类致癌物。但近年来TCDD的致癌性受到了质疑，并且发现其对肿瘤的发生发展具有复杂的调控作用。
本发明发现低浓度TCDD可抑制胶质母细胞瘤细胞系U87的迁移，为胶质母细胞瘤的治疗提供了一种新的选择。
因此，在一个方面，本发明提供二恶英或含有二恶英的药物组合物在制备抑制胶质瘤细胞迁移的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述胶质瘤细胞为星形细胞瘤细胞。
在一些实施方案中，所述胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤细胞。在一些实施方案中，所述胶质母细胞瘤细胞为来自受试者的细胞或胶质母细胞瘤细胞系。在一些实施方案中，所述受试者患有胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述胶质母细胞瘤细胞系为胶质母细胞瘤细胞系U87。
在一些实施方案中，所述二恶英的浓度为10-12～10-9M，例如10-12M～10-11M、10-12M～10-10M、10-12～10-9M、10-11M～10-10M、10-11M～10-9M或10-10M～10-9M。
在另一个方面，本发明提供二恶英或含有二恶英的药物组合物在制备抗胶质瘤的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述药物用于抑制胶质瘤生长、转移和/或侵袭。
在一些实施方案中，所述胶质瘤为星形细胞瘤。在一些实施方案中，所述胶质瘤为胶质母细胞瘤。
在另一个方面，本发明提供一种抑制胶质瘤细胞迁移的方法，其包括将细胞与有效量的二恶英或含有二恶英的药物组合物接触的步骤。
在一些实施方案中，所述胶质瘤细胞为星形细胞瘤细胞。
在一些实施方案中，所述胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤细胞。在一些实施方案中，所述胶质母细胞瘤细胞为来自受试者的细胞或胶质母细胞瘤细胞系。在一些实施方案中，所述受试者患有胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述胶质母细胞瘤细胞系为胶质母细胞瘤细胞系U87。
在一些实施方案中，所述二恶英的浓度为10-12～10-9M，例如10-12M～10-11M、10-12M～10-10M、10-12～10-9M、10-11M～10-10M、10-11M～10-9M或10-10M～10-9M。
在一些实施方案中，所述方法在体内进行。
在一些实施方案中，所述方法在体外进行。
在另一个方面，本发明提供一种抗胶质瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的二恶英或含有二恶英的药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，所述药物用于抑制胶质瘤生长、转移和/或侵袭。
在一些实施方案中，所述胶质瘤为星形细胞瘤。在一些实施方案中，所述胶质瘤为胶质母细胞瘤。
本发明所述药物组合物中还含有药学可接受的载体以及任选的其它治疗剂。
在一些实施方案中，所述其它治疗剂选自替莫唑胺、贝伐单抗、洛莫司汀、卡莫司汀、卡铂、丙卡巴嗪和长春新碱。
在本发明任一方面中所述的二恶英选自氯化二苯并对二恶英类化合物、氯化二苯并呋喃类化合物、非邻位取代多氯联苯类和单邻位取代多氯联苯。
在一些实施方案中，所述氯化二苯并对二恶英类化合物为2,3,7,8-TCDD、1,2,3,7,8-PeCDD、1,2,3,4,7,8-HxCDD、1,2,3,6,7,8-HxCDD、1,2,3,7,8,9-HxCDD、1,2,3,4,6,7,8-HpCDD或OCDD。
在一些实施方案中，所述氯化二苯并呋喃类化合物为2,3,7,8-TCDF、1,2,3,7,8-PeCDF、2,3,4,7,8-PeCDF、1,2,3,4,7,8-HxCDF、1,2,3,6,7,8-HxCDF、1,2,3,7,8,9-HxCDF、2,3,4,6,7,8-HxCDF、1,2,3,4,6,7,8-HpCDF、1,2,3,4,7,8,9-HpCDF或OCDF。
在一些实施方案中，所述非邻位取代多氯联苯类为3,3',4,4'-tetraCB(PCB 77)、3,4,4',5-tetraCB(PCB 81)、3,3',4,4',5-pentaCB(PCB 126)或3,3',4,4',5,5'-hexaCB(PCB 169)。
在一些实施方案中，所述单邻位取代多氯联苯为2,3,3',4,4'-pentaCB(PCB105)、2,3,4,4',5-pentaCB(PCB 114)、2,3',4,4',5-pentaCB(PCB 118)、2',3,4,4',5-pentaCB(PCB 123)、2,3,3',4,4',5-hexaCB(PCB 156)、2,3,3',4,4',5'-hexaCB(PCB157)、2,3',4,4',5,5'-hexaCB(PCB 167)或2,3,3',4,4',5,5'-heptaCB(PCB 189)。
在一些实施方案中，所述二恶英为TCDD。
术语定义
本发明中可能使用的分子生物学、微生物学以及重组DNA技术属于本领域已知技术。这些技术已在文献中被充分解释。详见，例如：Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloing：A Laboratory Mannual,(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach VolumesI&II,D.N.Glover ed.1985；Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait ed.1984；NucleicAcid Hybridization,B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1985；Transcription andTranslation,B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984；Animal Cell Culture,R.I.Freshney,ed.1986；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,1986；BPerbal,A PracticalGuide To Molecular Cloning,1984.基于此，对本文中出现的术语定义如下。
如在说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。
如本文中使用的，术语“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂等。
如本文所用，术语“个体”或“受试者”是哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。
如本文中使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫系统的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
对受试者给予的药物的量取决于所述疾病或病况的类型和严重程度以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受度，还取决于制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔等因素。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素来确定适当的剂量。
如本文中所使用的，术语“胶质瘤”、“神经胶质瘤”是指源自神经上皮的肿瘤，按病理学分类主要包括星形细胞瘤、少枝胶质瘤、室管膜瘤及间变型(恶性)室管膜瘤、混合性胶质瘤和脉络丛瘤等。而“胶质母细胞瘤”为星形细胞瘤中恶性程度最高的胶质瘤。
附图说明
图1显示10-12～10-9M TCDD处理U87细胞24h和48h内酶标仪检测细胞样品吸光值变化。
图2显示划痕实验评估TCDD对U87细胞迁移能力影响结果。其中，图2A显示经10-10MTCDD处理细胞36h后，细胞间划痕的面积大于对照组，表明细胞的迁移距离减少，细胞的迁移能力下降；图2B显示经10-10M TCDD处理后，U87细胞的迁移距离减少了18.5％，表明TCDD可以有效地抑制细胞迁移。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
U87细胞购自中国医学科学院细胞资源中心。
TCDD购自Wellington Laboratory。
CCK8试剂盒购自Sangon Biotech公司(上海)。
显微镜：CKX41(Olympus日本)。
照相机：600D(Canon日本)。
NanoDrop分光光度计：2000/2000c(Thermo美国)。
酶标仪：Tecan 2000pro(Tecan瑞士)。
实施例1TCDD对胶质母细胞瘤的毒性效应探究
将U87细胞以1×105个/mL的浓度接种到96孔板中，每孔100mL细胞悬液。过夜培养等待细胞贴壁。取出96孔板，吸净原有培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次。实验设背景对照组，溶剂对照组和药物处理组。对应的在每孔加入低血清培养基(血清浓度为1％，背景对照孔中无细胞)、含溶剂二甲基亚砜(DMSO)或不同浓度TCDD的低血清培养基，保持溶剂的体积为0.1％。将加药后的96孔板放入培养箱继续培养24h或48h。到达培养终点时间后，按试剂盒说明书中所写，向每孔加入10μL CCK8试剂，并再次将孔板放入培养箱中孵育1h后，用酶标仪读取吸光值。
由图1可见，采用10-12～10-9M TCDD处理U87细胞48h内没有引起吸光值的明显变化，对细胞增殖和活力无影响。因此该浓度及处理时间下TCDD无细胞毒性，可用于后续实验的使用。
实施例2.TCDD抑制U87细胞迁移
采用划痕实验评估细胞的迁移能力。在6孔板底部用记号笔横向划3条直线来定位划痕。将细胞以4×105个/mL的密度接种2mL于6孔板中，过夜培养等待细胞贴壁。细胞完全覆盖孔板底部后，用1mL移液枪头尖部划伤细胞单层，形成划痕。选择划痕与马克笔划线的交界处作为拍照位置。用磷酸盐缓冲液洗涤去除漂浮细胞，然后加入含溶剂DMSO或TCDD的低血清培养基。图像于划痕后0-48h采用数码相机在倒置显微镜下采集。共进行三次独立重复实验，每个独立实验中每个浓度组均有3个重复孔，且每个孔包含3条划痕，并拍摄12张图像进行计数和量化。细胞迁移距离通过将划痕缩小面积除以划痕长度计算得出，并使用Image Pro Plus 6.0软件进行分析。代表性划痕图像上的比例尺为0.05mm。
如图2A所示，TCDD处理细胞36h后，细胞间划痕的面积大于对照组，表明细胞的迁移距离减少，细胞的迁移能力下降。根据图2B的统计数据显示，经10-10M TCDD处理后，U87细胞的迁移距离减少了18.5％。表明TCDD可以有效地抑制细胞迁移。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。