具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在肝癌组织中的SNX5的基因或其蛋白的表达显著高于相应的癌旁组织和正常组织中的SNX5的基因或其蛋白的表达，并且，申请人还发现，SNX5在肝癌组织中表达增高，过表达SNX5可促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，基因沉默SNX5的表达可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。并且Kaplan–Meier法分析SNX5的表达与肝癌患者预后的关系提示高表达SNX5患者预后较差(p＝0.015)，而且，SNX5高表达患者与血管侵袭和肝内转移密切相关。因此，SNX5可作为肝癌预后的生物标志物之一，SNX5基因或其蛋白可用作(i)检测肝癌发生肝内转移和/或肺转移风险；和/或(ii)用作判断肝癌患者预后和生存期的标志物。并且，申请人还意外的发现，体内外功能实验显示SNX5能促进肝癌细胞增殖和转移，SNX5基因或其蛋白的抑制剂(例如干扰SNX5的表达)可有效(a)抑制肝癌细胞的转移；和/或(b)提高肝癌细胞对化疗药物(如sorafenib和Erlotinb)的敏感性，SNX5基因或其蛋白的抑制剂可与化疗药物联用，并且对肝癌的治疗有显著的协同效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

SNX

SNXs(Sorting Nexin)蛋白家族是是近年来发现的一类调控真核细胞内吞过程的家族，在哺乳动物中具有33个成员，该蛋白家族的显著特征是都具有吞噬细胞氧化酶同源性(PX domain)结构域。除PX结构域外，SNXs蛋白家族还可能具有BAR、SH、GAP、FERM、RGS、MIT及一些需要继续探索的未知结构域。由于SNXs蛋白家族所含的结构域不同，家族内成员的功能不完全相同。SNXs蛋白主要依靠PX结构域和BAR结构域发挥生物学功能，主要包括大分子物质的跨膜运输(细胞内吞、外排)、蛋白分选、降解以及细胞内膜间的循环等。目前研究发现，肿瘤细胞的无限增殖能力与内吞介导的受体下调缺陷密切相关，SNXs蛋白家族成员在介导细胞内吞的过程中发挥重要作用，因此，SNXs蛋白家族与多种肿瘤的发生发展密切相关。SNX1作为SNXs家族第一个被发现的成员，研究发现，SNX1表达在结肠癌组织中明显降低，敲低SNX1的表达能明显增加EGFR的磷酸化水平促进结肠癌细胞增殖。基因敲除SNX10可通过激活mTOR信号通路促进结肠癌的发生，SNX10也可通过分子伴侣介导的自噬(CMA)降解p21影响结肠癌的进展。SNX9通过调控RhoA和Cdc42 GTPases的活性促进乳腺癌细胞转移。

因此，所有的这些研究表明SNXs蛋白家族成员与肿瘤的增殖和转移密切相关，主要作用机制可能包括干扰受体内吞、内吞途径中的关键蛋白缺失、逃逸泛素介导的降解途径及内吞过程中肌动蛋白重塑失调等。

肝细胞癌

肝细胞癌在所有肿瘤中发病率排名第六，肝细胞癌每年新发病例将近80万。目前肝细胞癌的治疗手段有很多种，包括手术切除、肝脏移植、肿瘤消融、经动脉肿瘤栓塞术、系统性治疗等，但中晚期肝细胞癌患者从治疗中获得的受益较低，生存期较短，预后差。

目前尚无很好的肝细胞癌的治疗方法。

在本发明中，肝细胞癌组织分级指TNM分期，包括Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅳ期。

肝内转移

在本发明中，所述肝内转移指(1)门静脉瘤栓；(2)在原发肿瘤所在肝叶以外的其他肝叶上的肿瘤；(3)同一肝叶中在原发肿瘤周围的肿瘤，其有多个卫星结节并且其周围有肝组织；或者周围的微小孤立肿瘤，其组织学上与原发肿瘤相似或分化程度更低。

肺转移

在本发明中，所述肺转移指原发性干细胞癌经血液或淋巴液转移到肺脏组织。

样品

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

参比值

如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较SNX5白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。

在本发明中，所述参比值指截断值(cut-off值)，指肝细胞癌细胞或组织中的SNX5的相对表达水平，优选相对表达水平为0.043(荧光定量PCR)或3.5(免疫组化)。

非肝细胞癌的样品

如本文所用，术语“非肝细胞癌样品”包括但不限于未患有肝细胞癌的人群，肝细胞癌患者的非肝细胞癌组织。

SNX5蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“SNX5蛋白”、“SNX5多肽”可互换使用，都指具有SNX5氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的SNX5蛋白。此外，该术语还包括全长的SNX5及其片段。本发明所指的SNX5蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

SNX5是SNXs蛋白家族成员之一，位于人染色体20p11.23，编码一种相对分子质量大约50KD的蛋白，具有PX结构域和BAR结构域。PX结构域是一种磷脂结合结构域，其主要的结合靶点是PI3P。这是一种广泛的分布于内涵体膜上的磷脂，SNXs通过PX结构域与磷脂的结合定位到内涵体表面，从而发挥对内涵体转运多样的调节。目前认为BAR结构的功能与感知细胞膜的弯曲度有关，它能与高度弯曲的细胞膜相结合，从而使整个蛋白定位于细胞器上，并同时将脂质体改装成高度弯曲的脂质管，协助运输中间产物，并具有改造细胞膜的能力。研究发现SNX5定位于早期内体，EGF刺激后SNX5被招募到细胞膜上，PtdIns(3,4)P2也被短暂的招募到细胞膜上，表明SNX5不仅能影响内吞过程，也能调控磷脂酰肌醇信号通路。

目前关于SNX5在肿瘤中报道较少。有研究表明，SNX5在甲状腺乳头状癌中高表达，SNX5基因敲除的小鼠，表现出更快的增殖潜能和对TSH的敏感性，并激活MAPK和AKT通路导致甲状腺转移性肿瘤的发生，这些结果表明甲状腺细胞需要SNX5减轻TSH驱动的肿瘤信号。

在本发明中，术语“SNX5基因”、“SNX5多核苷酸”可互换使用，都指具有SNX5核苷酸序列的核酸序列。

人SNX5基因的基因组全长27395bp(NCBI GenBank登录号为Gene ID:27131)，其转录产物mRNA序列全长2341bp(NCBI GenBank登录号为NM_014426.4)。

需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了SNX5的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的SNX5核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的SNX5多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人SNX5多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，SNX5多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含SNX5编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗SNX5的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人SNX5多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人SNX5基因产物或片段。较佳地，指那些能与人SNX5基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人SNX5蛋白的分子，也包括那些并不影响人SNX5蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人SNX5基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人SNX5基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人SNX5蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人SNX5蛋白功能的抗体以及不影响人SNX5蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人SNX5基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人SNX5基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人SNX5蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人SNX5蛋白。由于SNX5蛋白存在胞外区，因此在胞外区脱落并进入血液的情况下，这些可溶性的SNX5胞外区就可成为血清检测的靶对象。

检测方法

利用SNX5存在于肝癌细胞或组织中，且与肝癌的危险度密切相关这一特点，本发明还提供了检测肝癌的方法。

在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测SNX5的高通量二代测序法以及Sanger测序、荧光定量PCR(qPCR)、原位免疫荧光法(FISH)和免疫组化等。

检测试剂盒

基于SNX5与肝癌的相关性，即SNX5存在于肝癌组织中，因此SNX5可以作为肝癌的一种诊断标志物。

本发明还提供了一种(i)检测肝癌的组织分级；和/或(ii)检测肝癌发生肝内转移风险；和/或(iii)判断肝癌患者预后和生存期的试剂盒，它含有检测SNX5基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测(i)检测肝癌的组织分级；和/或(ii)检测肝癌发生肝内转移风险；和/或(iii)判断肝癌患者预后和生存期。

其中，所述的标签或说明书注明以下内容：

(a)当检测对象的肝癌细胞或组织中SNX5表达量E1与一般肝细胞或组织的SNX5表达量E2之比≥1.5，则提示该检测对象肝癌发生肝内转移风险的几率高于一般人群；

(b)当检测对象的肝癌细胞或组织中SNX5表达量E1与一般肝细胞或组织的SNX5表达量E2之比≥1.5，则提示该检测对象的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群；

其中，所述的E2是一般人群的一般肝细胞或组织的SNX5的表达量。

检测方法和试剂盒

本发明涉及定量和定位检测人SNX5蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人SNX5蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)肝癌的组织分级；和/或肝癌发生转移风险；和/或肝癌患者预后和生存期。

一种检测样品中是否存在SNX5蛋白的方法是利用SNX5蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与SNX5蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SNX5蛋白。

SNX5蛋白或其多核苷酸可用于SNX5蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗SNX5的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的SNX5蛋白。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，在肝癌组织中的SNX5的基因或其蛋白的表达显著高于相应的癌旁组织和正常组织中的SNX5的基因或其蛋白的表达，并且，SNX5在肝癌组织中表达增高，过表达SNX5可促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，基因沉默SNX5的表达可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。并且Kaplan–Meier法分析SNX5的表达与肝癌患者预后的关系提示高表达SNX5患者预后较差(p＝0.015)，而且，SNX5高表达患者与血管侵袭和肝内转移密切相关。因此，SNX5可作为肝癌预后的生物标志物之一，SNX5基因或其蛋白可用作(i)检测肝癌发生肝内转移和/或肺转移风险；和/或(ii)用作判断肝癌患者预后和生存期的标志物。

(2)本发明首次发现，体内外功能实验显示SNX5能促进肝癌细胞增殖和转移，SNX5基因或其蛋白的抑制剂(例如干扰SNX5的表达)可有效(a)抑制肝癌细胞的转移；和/或(b)提高肝癌细胞对化疗药物(如sorafenib和Erlotinb)的敏感性。

(3)本发明首次发现，SNX5基因或其蛋白的抑制剂可与化疗药物联用，并且对肝癌的治疗有显著的协同效果。

(4)本发明首次发现，SNX5在肝癌患者组织样品中高表达提示患者预后差。

(5)本发明首次发现，SNX5促进肝癌细胞的转移潜能，SNX5促进肝癌细胞的肝癌细胞肝内转移和肺转移。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

通用方法

1.细胞培养

本项发明中的细胞实验均在37℃、5％CO₂和饱和湿度(70％～75％)条件的培养箱中培养。培养液为包含有浓度100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素，加上10％胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基(DMEM)培液。当细胞生长至融合度为90％的时候，用胰酶消化液将其消化下来进行传代或者处理。

2.RNA抽提

1)取出细胞培养皿中融合度90％以上的细胞，丢弃细胞培养皿中的培液，用1×的PBS清洗两遍，充分吸尽残余的PBS后，加入2ml的TRIzol溶液，充分吹打至贴壁的细胞重悬于TRIzol溶液中，用1毫升的墙头吸取0.5毫升的TRIzol溶液放入1.5毫升的EP管中。剩余的1.5毫升TRIzol溶液放入负80度保存。

2)将0.5毫升含有细胞的TRIzol溶液于室温下静置5分钟，然后加入100ul的氯仿溶液，用力震荡15秒，再次室温下静置2～3分钟后，将混合液置于4℃离心机，12000g高速离心15分钟。

3)在高速离心15分钟后，可以观察到EP管中的液体分为三层，分别为下层的蛋白有机相，中间的DNA固相以及上层的RNA水相。用枪头轻轻吸取上层的RNA水相至新的EP管中

4)在含有RNA水相的EP管中加入0.5毫升的异丙醇，小心吹打混匀后，于常温下静置10分钟，接着再次将混合液体放入4℃离心机，12000g高速离心10分钟，此时可以观察到EP管底部有白色RNA沉淀。

5)将液体弃去，用枪头将剩余的液体小心洗净后打开盖子，晾干，待白色沉淀变透明后，加入20ul左右的DEPC水，并用枪头吹匀溶解，用实验室内部的NanoDrop机器测定其浓度后，取1ug的RNA进行逆转录为cDNA,其余的RNA置于负80度保存。

3.逆转录

从日本的TaKaRa公司购买用于做逆转录的试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)。20uL的RNA逆转录体系为：5×PrimeScript Buffer4μL，PrimeScript RT Enzyme MixΙ1μL，Random 6mers(100μM)1μL，Oligo dT Primer(50μM)1μL，总的RNA1μg，最后加入DEPC H₂O补齐至20μL。配好总管后加入PCR仪中，程序为：37℃下运行15分钟；85℃下运行5秒，最后置于4度。

4.荧光定量PCR

实时定量PCR的体系为总体积20ul,然后各成分体积为SYBR Premix Ex Taq^TMSolutions(2×)10μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4μL，Primer R0.8μL，Primer F0.8μL，ddH₂O 6μL，最后加入cDNA2μL。每个样品设置三孔重复，配制好总管后，加入96孔板中，将96孔板放于ABI 7500定量PCR仪上运行。其运行温度程序以及循环数为：首先95℃30秒，然后再经过40个{95℃，5秒，60℃，30s}的循环。实验结束后，以GAPDH为内参在7500software软件中以CT值变化分析表达mRNA表达量的变化。

5.蛋白质抽提

1)先配置好蛋白裂解液(总体积1mL的裂解液中包含有880ul的基础裂解液、100ul的10×磷酸酶抑制剂溶液以及20μL 50×蛋白酶抑制剂溶液)从细胞培养箱中拿出含有细胞的培养皿，舍弃培液，用已经预冷的1×的PBS洗净残余的血清，再用枪头充分吸尽1×的PBS后根据培养皿中不同的细胞数量加入适量的已经配置好的蛋白裂解液，轻轻用刮刀将细胞刮下来，放入1.5mL的EP管中置于冰上裂解40分钟。

2)40分钟后将含有蛋白裂解液的EP管放入4℃离心机，以12000g的转速离心15分钟。

3)取出离心完毕的EP管，吸取其上清液放入新的EP管中，此步骤在冰上操作。

4)接下来测量蛋白浓度，在新的EP管中加入200ul的BCA，20ul的1×PBS，4ul的CuSO₄，最后再加入5ul离心完毕的蛋白裂解液，使用酶标仪在570nm波长处测量吸光度值。完毕后用标准曲线计算所测蛋白浓度。

5)最后从剩余蛋白裂解液上清中按照蛋白裂解液：5×loading buffer：10×DTT＝7:2:1的比例吸取裂解液并加入相应的5×loading buffer和DTT。

6.构建SNX5过表达质粒

1)提取肝癌细胞RNA(步骤同前)

2)将RNA逆转录为cDNA(方法同前)

3)Rpn10基因扩增

从NCBI官网上下载SNX5的CDS序列，在设计SNX5的克隆引物时引入Bam HI/EcoR I酶切位点，以上一步提取的cDNA为模板，用PCR仪扩增SNX5的CDS区，按照如下扩增体系加样：

PCR仪中的温度程序为：

3)纯化回收扩增的DNA产物片段并酶切连接：

配制好1％的琼脂糖凝胶：将3mg的琼脂粉加入到30ml 0.5×TBE缓冲液中，放入微波炉中加热煮沸，冷却到55～60℃左右的时候，用移液枪加入DNA的染料溴化乙锭。充分的混匀后倒入已经插好梳子的配胶槽中，半个小时候冷却凝固完毕，小心拔出梳子，将胶块放入电泳槽里。按照扩增DNA片段：DNA Marker＝5：1的比例加入到胶块的孔中，电压调至120V，待Marker分至合适的位置，用紫外灯辅助观察，小心切下扩增产物DNA条带，放于1.5ml的EP管中，按照天根公司DNA纯化回收试剂盒的说明书，回收DNA产物。回收完毕，按照如下体系分别用MiuI/EcoRI两种高保真的酶酶切pWPXL和PCR扩增产物。

酶切完毕后按照天根公司DNA纯化回收试剂盒回收PCR扩增产物的酶切产物，而将pWPXL的酶切产物再次按照酶切产物：DNA Marker＝1:6的比例加入配好的电泳胶块中，完毕后紫外灯下切割所需条带，用天根公司DNA纯化回收试剂盒按照说明书回收。测量好浓度后，按照10μl的连接体系连接：pWPXL的酶切产物和PCR扩增产物的酶切产物的摩尔质量之比为1:7，1μl T4连接酶，1μl的缓冲液，剩下用ddH₂O补齐到10μl。22℃水浴锅中连接4小时，65℃灭活10分钟，冰上冷却。

4)转化，挑单克隆菌

①取一高压灭菌过的EP管加入50ul大肠杆菌Ecoli DH5α感受态和10ul的连接产物，充分混匀后放置在冰上半小时。

②42℃水浴锅中90秒，冰上2～3分钟。

③加入200ul SOCS培养基，然后在摇床上150rpm摇1h。

④将混合液均匀涂抹在具有氨苄抗性的细菌培养板上。倒置在37℃恒温箱中过夜。

⑤第二天后观察培养皿中菌落的生长情况，用灭菌后的小Tip头挑取单个菌落，放于5ml具有氨苄抗性的液态LB溶液中，放于37℃摇床，250rpm过夜。

5)质粒的提取

①将吸附柱CP3中加入500ul的平衡液BL，然后放入收集管中，12000rpm离心1分钟，倒尽废液后，重新放入收集管里。

②将过夜摇床上的菌液放入离心管中12000rpm离心1分钟，完毕后倒尽上清，留下菌液。

③在留有菌液的离心管中加入250ul的的P1溶液，放在震荡器上使菌液重悬。

④加入250ul的P2溶液，温和的上下颠转6～8下至浑浊的菌液变的清亮。

⑤加入350ul的P3溶液，加入后立即温和的上下颠转防止形成局部沉淀。

⑥放入离心机中12000rpm离心1分钟，离心完毕，吸取上清放入CP3中，室温静置2分钟。

⑦将CP3放入收集管中于离心机中12000rpm离心1分钟，离心完毕弃去收集管中的液体。

⑧在CP3中加入600ul的PW溶液，12000rpm离心1分钟，离完，弃去收集管中的废液。

⑨重复操作⑧。

⑩将CP3放回收集管中，12000rpm离心2分钟。完毕后打开盖子室温下晾干。

晾干完毕在CP3中滴入50ul的ddH2O,室温下静置2分钟后，放入干净的EP管中，12000rpm离心2分钟。测浓度，-20℃保存。

6)酶切鉴定和测序

运用MiuI/EcoRI两种酶进行酶切鉴定和琼脂糖凝胶电泳，对于酶切条带正确的质粒，送至英潍捷基生物有限公司来测序。测序结果比对运用SnapGene软件，扩增序列正确的质粒，并在-80℃保存甘油菌，保存的方法为500ul 50％甘油加上500μl测序正确的菌液。

7.蛋白电泳及蛋白质印迹试验

1)配好玻璃板，按照配方配制好10％的聚丙烯酰胺凝胶分离胶溶液，充分混匀后将分离胶溶液倒入配置好的两块玻璃板之间，迅速在分离胶溶液上面倒入蒸馏水，压平分离胶，并减少空气对分离胶凝固的抑制作用，室温静置半个小时左右待凝固；

2)待下层分离胶凝固，水与胶面出现明显的隔离线，倒尽蒸馏水，倒置在滤纸晾干，按照前文所说浓缩胶的配置比例配制5％的浓缩胶，充分混匀后迅速倒入玻璃夹板之间，随即插入所需孔径的梳子，室温下静置半小时；

3)两层胶均凝固后，放入加入电泳液的电泳槽中，小心拔出梳子，根据蛋白样品的浓度，和不同蛋白质在细胞中的分度，计算上样量，上样完毕后加入1×上样缓冲液(loading buffer)补齐；

4)打开电泳仪电源，恒压80V半小时，至蛋白样品跑至分离胶，调整电压为120V，恒压1个半小时；

5)转膜：配制转膜液(配制比例为1L的转膜液中20×转膜液：甲醇：蒸馏水＝50mL：200mL：750mL)置于四度冷却，将电泳完毕的胶块和硝酸纤维素膜放入转膜夹中，在置于冰上的转膜槽中恒流220mA，湿转50分钟；

6)转膜完毕，将硝酸纤维素膜放入5％的新鲜配置好的脱脂牛奶中，摇床慢摇一个半小时封闭；

7)封闭完毕后，将膜放入干净PBST溶液(1L 1×PBS中加入1mL的0.1％Tween 20)脱去残余牛奶，洗净；

8)按照抗体说明书将抗体用封闭液稀释至合适的比例，将膜4℃冰箱中过夜孵育；

9)第二天用干净PBST溶液洗膜三次，每次十分钟，洗膜完毕，用5％的脱脂牛奶溶液按照抗体说明书稀释辣根过氧化物酶标记的二抗(鼠抗或者兔抗)，在室温下孵育一个半小时；

10)孵育二抗完毕，用PBST溶液洗膜，每次十分钟，共三次；

11)发光：在发光仪上，用Super Signal化学发光底物，按照不同的抗体的曝光强度，调整适宜的曝光时间，并保存照片，分析条带。

12)用蛋白洗脱液洗脱抗体后，以β-actin作为上样内参，用5％的脱脂牛奶溶液稀释β-actin抗体，比例为1：10000，PBST溶液洗膜三次，每次10分钟，洗膜完毕用SuperSignal化学发光底物曝光。

8.病毒包装

1)第一步，在6cm皿中接种密度适中的293T细胞，让其第二天生长融合度达到90％左右。

2)在24孔板中，分别在两孔中加入500ul的DMEM溶液，按照如下比例配制好Lipofectamine^TM 2000和质粒的混合液。一孔中加入混合质粒，另一孔中加入Lipofectamine^TM 2000，5分钟后，将两孔中含有混合质粒和Lipofectamine^TM2000的DMEM溶液混合，室温下静置20分钟。

3)将6cm皿中的293T细胞培液换为无血清的DMEM溶液，然后将质粒和Lipofectamine^TM 2000的混合液小心加入293T细胞中(注意不要用力，防止将293T细胞吹落)。

4)37℃恒温培养箱中放置6小时，然后换为含血清DMEM溶液。

5)48小时后用0.45um的滤器回收病毒。-80℃冰箱保存。

9.慢病毒感染

第一步，接种密度适中的人肝细胞癌细胞至6cm皿中，置于37℃培养箱中培养过夜，使其第二天细胞融合度可以达到50％左右。第二步，第二天从-80℃冰箱中取出所需病毒液，待其融化后，按照细胞培养液：病毒液＝1：1的比例加入接有人肝细胞癌细胞的培养皿中，加入polybrene(Sigma-Aldrich)，使其终浓度达到1‰，6～8小时后换液。

10.克隆形成实验

1)取出37℃恒温培养箱中生长的肝细胞癌细胞系，胰酶消化完毕后，计数方法同CCK8实验，根据不同的肝细胞癌细胞的生长速度，在无菌的六孔板培养皿中每孔接种1000～3000个细胞，三孔重复，放回37℃恒温培养箱

2)每隔三天换一次培养液，在培养约2周后观察六孔板中的细胞克隆大小，待大小合适，密度适中时终止培养。

3)弃去培液，用1×PBS清洗2遍，洗去残余的培液后，加入10％的中性福尔马林溶液室温下固定1小时，倒去福尔马林溶液，加入2ml Giemsa染色液染色一小时。回收染色液，用蒸馏水小心洗去多余的Giemsa染色液，室温下倒置晾干。用扫描仪扫描完毕后，Image J软件统计克隆形成的数目。

11.细胞迁移与侵袭实验

迁移实验：细胞消化计数，方法同迁移实验，无血清DMEM重悬细胞800rpm、5min洗两次，尽可能去掉多余的血清，无血清培养基液重悬细胞并计数，取1×10⁵个细胞置入200μL的无血清培养基中，混匀缓慢滴入小室，下室提前加入600μL完全培养基，镜下观察细胞是否铺均匀，37℃孵箱中培养12h。

侵袭实验：Matrigel基质胶提前一天在4℃解冻，用预冷的无血清培养基养基按1:10稀释Matrigel基质胶(所有接触融化的Matrigel胶的物品均应在冰盒中操作，且tip头，EP管应在4℃预冷)，混匀后取20μL均匀涂抹于Transwell小室底部微孔薄膜上，37℃孵箱内30min使小室膜上的胶凝固，薄膜上的微孔被胶堵住，凝固后将小室置于Transwell实验专用的24孔培养板中(预加入600μL完全培养基)。细胞消化计数，方法同迁移实验，无血清DMEM重悬细胞800rpm、5min洗两次，尽可能去掉多余的血清，无血清培养基液重悬细胞并计数，取1×10⁵个细胞置入200μL的无血清培养基中，混匀缓慢滴入小室，下室提前加入600μL完全培养基，镜下观察细胞是否铺均匀，37℃孵箱中培养24h。

12.细胞增殖实验(CCK8 assay)

1)取出37℃恒温培养箱中的培养的肝细胞癌细胞系，用胰酶消化后，吸取10ul的培液加10ul的台盼蓝溶液，充分混匀后，吸取10ul加入计数板中计数，由于不同的肝细胞癌细胞系生长速度不同，于96孔板中接种不同密度的细胞数，范围为800～3000个细胞/每孔，每排三孔，共接种7排，用于七天的测量。

2)第二天，将第一排的三孔细胞中分别加入10μl的CCK8溶液，2小时后在酶标仪中选取450nm波长，测量其吸光度值。

3)第三天，重复步骤二，连续测量七天吸光度值，隔天换液，根据吸光度值绘制生长曲线。

13.裸鼠肝原位接种实验

取生长状态良好的细胞，用2.5g/L的含EDTA胰酶进行消化细胞，制成单细胞悬液并计数，将细胞按照2×10⁶细胞溶于25μl无血清培养基与25μl Matrigel(按照体积比1:1)混合，放置冰上操作，Balb/c裸小鼠麻醉后，打开腹腔，肝脏内直接注射细胞悬液，5-7周后无痛苦牺牲裸小鼠，荷瘤小鼠称重，取肝和肺组织，实验标本固定在中性缓冲福尔马林中，石蜡切片及HE染色后进行病理组织学检查。

实施例1 SNX5可作为肝癌预后的分子标志物

通过分析TCGA和GEO数据库，发现SNX5在肝癌组织中表达增高(见图1)，发明人进一步通过western blot法分析SNX5蛋白在肝癌组织中的表达水平，结果显示肝癌组织中SNX5的表达高于相应的癌旁组织，发明人通过免疫组化法分析SNX5蛋白在肝癌组织中的表达，根据143例肝癌组织中SNX5的表达水平，相应的分成SNX5低表达组和高表达组，采用Kaplan–Meier法分析SNX5的表达与肝癌患者预后的关系。

结果显示(见图2，表1)高表达SNX5患者预后较差(p＝0.015)，而且，SNX5高表达患者与血管侵袭和肝内转移密切相关。同时TCGA的数据库也显示，SNX5高表达患者预后较差。发明人进一步根据143例肝癌组织中SNX5的表达水平，通过单变量和多变量(见图3)分析分析预后风险比显示，SNX5是影响肝癌患者预后的风险因素。

因此，SNX5的表达水平可能作为肝癌预后的分子标志物。

表1.肝癌组织中SNX5的表达与患者临床病理的关系

*p<0.05

实施例2 SNX5促进肝癌细胞增殖

根据SNX5在肝癌细胞中的表达水平，SMMC-7721和Li7进行过表达SNX5，Huh7和MHCC-LM3细胞进行敲低SNX5的表达，通过CCK8和克隆形成实验显示，过表达SNX5促进肝癌细胞增殖，敲低SNX5抑制肝癌细胞增殖，结果见图4。

同时，体内动物实验也显示过表达SNX5能促进肝癌细胞体内增殖，干扰SNX5的表达抑制MHCC-LM3细胞肝原位成瘤能力，结果见图5。

实施例3 SNX5促进肝细胞转移

通过transwell实验，过表达SNX5促进SMMC-7721和Li7细胞迁移和侵袭，反之，敲低SNX5的表达抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力，结果见图6。

而且，通过phalloidin染色发现，过表达SNX5促进SMMC-7721和Li7细胞侵袭性伪足的形成，作为侵袭的标志物MMP9的表达增高，过表达SNX5促进肝癌细胞MMP9的表达，敲低SNX5的表达抑制肝癌细胞MMP9的表达。进一步通过动物实验显示，肝原位注射SNX5过表达细胞，过表达SNX5能促进肝癌细胞肝内转移和肺转移，干扰SNX5的表达抑制肝癌细胞肝内转移，结果见图7。

实施例4 干扰SNX5表达能增加sorafenib和Erlotinb的药物敏感性

发明人检测敲低SNX5的表达对化疗药物sorafenib和Erlotinb的敏感性，结果(见图8和图9)显示，敲低SNX5的表达能加强sorafenib和Erlotinb对肝癌细胞的药物敏感性，抑制肝癌细胞克隆形成能力，并且促进其细胞凋亡。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。