具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的多西环素(Doxycycline，以下简称Dox)的结构式为式1，CAS号为564-25-0，为Sigma-AldrichCorp公司产品。

采用GraphPad Prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准误表示，采用双尾t检验。

Hgs(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)是一种酪氨酸磷酸化蛋白，是ESCRT-0复合体的重要组分之一。小鼠的Hgs是氨基酸序列是GenBank Accession No.NP_001152800(Update Date 2020-12-09)所示的蛋白质，或小鼠的Hgs是氨基酸序列是GenBank Accession No.NP_032270(Update Date 2020-12-09)所示的蛋白质。小鼠Hgs基因(野生型等位基因，Hgs⁺)包括22个外显子，其核苷酸序列是GenBankAccession No.NC_000077(Update Date 2020-09-22)的第120358431-120374810位核苷酸，其中，第31-159位为第一外显子(E1)序列，第1405-1489位为第二外显子序列(E2)，第1996-2071位为第三外显子序列(E3)，第2431-2523位为第四外显子序列(E4)，第3876-3999位为第五外显子序列(E5)，第4999-5051位为第六外显子序列(E6)，第6652-6720位为第七外显子序列(E7)，第7516-7640位为第八外显子序列(E8)，第9525-9603位为第九外显子序列，第9685-9783位为第十外显子序列，第9915-10010位为第十一外显子序列，第10732-10770位为第十二外显子序列，第10858-11001位为第十三外显子序列，第11091-11150位为第十四外显子序列，第11483-11693位(对应NP_001152800)或第11486-11693位(对应NP_032270)为第十五外显子序列，第11949-12121位为第十六外显子序列，第12195-12335位为第十七外显子序列，第12420-12594位为第十八外显子序列，第14926-15059位为第十九外显子序列，第15140-15259位为第二十外显子序列，第15411-15497位为第二十一外显子序列，第15785-16380位为第二十二外显子序列。该Hgs基因的mRNA序列为GenBank AccessionNo.NM_001159328(Update Date 2020-12-09)所示(对应NP_001152800)，或小鼠Hgs基因的mRNA序列是GenBank Accession No.NM_008244(Update Date 2020-12-09)所示(对应NP_032270)。

Hgs条件基因打靶小鼠(Hgs^fl/fl小鼠，Hgs-floxed mouse line)在文献“Chen J，Hou N，Zhang C，et al.Smooth Muscle Hgs Deficiency Leads to Impaired EsophagealMotility[J].International journal of biological sciences，2015，11(7)：794-802.”中公开过。该小鼠的制备方法如下。

1.构建Hgs基因打靶载体，将包含了Hgs基因第二到第八外显子的目的片段克隆到包含FRT锚定的新霉素抗性盒和TK基因表达盒的Pfrtl载体中获得Hgs基因打靶载体。该Hgs基因打靶载体示意图如图1所示，该Hgs基因打靶载体的目的片段包括Hgs基因的第二外显子至第八外显子之间的片段(图中E2-E8)，并将FRT元件锚定的新霉素抗性基因元件(Neo)及5’端loxP元件插入到第五外显子上游1105bp处，3’端loxP元件插入在第五外显子下游588bp处。

2.利用NotI核酸内切酶将Hgs基因打靶载体线性化，并通过电穿孔法将其导入TC1小鼠胚胎干细胞(TC1 mouse embryonic stem cells，下述简称ES细胞)中，利用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)筛选具有双抗的细胞并挑取状态较好的ES细胞，利用SouthernBlot鉴定中靶ES细胞克隆。中靶ES细胞含有中靶等位基因，中靶等位基因是将原Hgs基因(图1中的野生型等位基因，Hgs⁺)序列(GenBank Accession No.NC_000077(REGION：120358431-120374810，Update Date 2020-09-22))中的第843-9369位替换为SEQ ID No.2所示的片段。

3.利用细胞显微注射技术将中靶ES细胞注射到C57BL/6J小鼠囊胚中制备获得嵌合体小鼠，嵌合体小鼠进一步与C57BL/6J小鼠交配获得中靶等位基因杂合子小鼠。然后将其与ROSA26：：FLPeknockin小鼠(南京大学高翔实验室赠送，可于Jackson实验室购买，https：//www.jax.org/strain/003946，129S4/SvJaeSor-Gt(ROSA)26Sor^tm1(FLP1)Dym/J货号为003946)交配，去除新霉素基因元件，获得Hgs^fl/+小鼠。与C57BL/6J小鼠相比，Hgs^fl/+小鼠的一条染色体上的原Hgs基因(图1中的野生型等位基因，Hgs⁺)序列(GenBank AccessionNo.NC_000077((REGION：120358431-120374810，Update Date 2020-09-22))中的第843-9369位替换为)的替换为SEQ ID No.3所示的片段(如图1 Hgs^fl等位基因)。

4.Hgs^fl/+小鼠自交获得纯合子小鼠Hgs^fl/fl小鼠，Hgs^fl/fl小鼠的两条染色体上的原Hgs基因序列(GenBank Accession No.NC_000077(REGION：120358431-120374810，UpdateDate 2020-09-22))的第843-9369位替换为SEQ ID No.3所示的片段。

α-MHC-Cre转基因小鼠(α-MHC-Cre小鼠)在文献“王剑等，心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[J]军事医学科学院院刊，2015，29(1)：38-44”中公开。α-MHC-Cre转基因小鼠(α-MHC-Cre小鼠)构建方法具体如下。

将包括α-MHC基因启动子、Cre重组酶基因和人生长素基因polyA的α-MHC-Cre-hGH目的片段(序列如SEQ ID No.1所示)通过显微注射导入至昆明白小鼠受精卵胸原核中，将该受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中，从而获得子代鼠。利用PCR从中筛选出携带Cre重组酶基因的小鼠，通过与C57BL/6J回交获得α-MHC-Cre小鼠。α-MHC-Cre小鼠仅在心肌细胞特异性表达Cre重组酶。SEQ ID No.1中，α-MHC基因启动子为第1-5474位，Cre重组酶基因为第5526-6719位，人生长素基因polyA为第6778-8935位。

Cre重组酶是SEQ ID No.1的第5526-6719位核苷酸(CDS)编码的蛋白质。

实施例1心肌细胞特异性Hgs基因敲除小鼠的建立

将饲养于SPF动物房的Hgs^fl/fl小鼠与α-MHC-Cre小鼠交配得到F1代小鼠，通过PCR鉴定获得双阳性杂合子小鼠，命名为α-MHC-Cre；Hgs^fl/+小鼠。α-MHC-Cre；Hgs^fl/+小鼠基因组整合有α-MHC-Cre-hGH目的片段(序列如SEQ ID No.1所示)，一条染色体上的Hgs基因(GenBank Accession No.NC_000077(REGION：120358431-120374810，Update Date 2020-09-22))的第843-9369位替换为SEQ ID No.3所示的片段，而另一条染色体上的Hgs基因未被替换。

将α-MHC-Cre；Hgs^fl/+小鼠与Hgs^fl/fl小鼠交配得到F2代小鼠，通过PCR鉴定获得双阳性纯合子小鼠，命名为心肌细胞特异性Hgs基因敲除小鼠(α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl)，即为限制型心肌病小鼠模型。心肌细胞特异性Hgs基因敲除小鼠(α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl)基因组整合有α-MHC-Cre-hGH目的片段，两条染色体上的Hgs基因(GenBank Accession No.NC_000077(REGION：120358431-120374810，Update Date 2020-09-22))的第843-9369位替换为SEQID No.3所示的片段。α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠的心肌细胞中两条染色体上的Hgs基因的第五外显子均被Cre/LoxP系统敲除，即缺失124bp的第五外显子(如图1敲除等位基因所示)。

α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠构建方法示意图见图2。

其中，PCR鉴定方法具体如下：

(一)小鼠基因组DNA的制备

1、剪15天小鼠尾巴尖约2mm放入Eppendorf管中。

2、每管加入鼠尾裂解缓冲液(0.5％SDS，0.1M NaCl，0.05M EDTA，0.01M Tris-ClpH8.0，蛋白酶K，200μg/ml)400μl。

3、55℃保温过夜。

4、每管加入200μl饱和的NaCl(6M)。

5、将Eppendorf管置于纸盒中剧烈晃动200次。

6、将Eppendorf管置于冰上，10min。

7、室温14,000rpm离心，10min。

8、将上清500μl转移至干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。

9、14,000rpm离心，5min。弃上清。

10、将Eppendorf管口朝下，室温干燥。将DNA重悬于50～100μl TE中，37℃保温至DNA完全溶解。

(二)PCR鉴定小鼠的基因型

按如下体系，在96孔板中加入各组分：

将配置好的反应体系放入PCR仪中。反应程序如下：

配置2％琼脂糖凝胶电泳，将扩增完之后的产物点入凝胶孔中。恒压140V，20min。

鉴定Cre重组酶采用的Cre引物为5′-ATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCC-3′和5′-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3′。鉴定Hgs基因采用的Hgs引物为5′-CCTGGTGTCCTTGGATCTCCT-3′和5′-GAGCCACTCTTGTAGCCTTGC-3′。

基因型鉴定结果见图3，图中有5个样本，泳道Cre为采用Cre引物扩增的产物电泳，如能特异性扩增出629bp片段，则为α-MHC-Cre阳性；泳道Hgs为采用Hgs引物扩增的产物电泳，如能特异性扩增出一条311bp片段，则为Hgs^fl/fl纯合子，如能特异性分别扩增出212bp片段、311bp片段，则为Hgs^fl/+杂合子，如能特异性扩增出一条212bp片段，则为Hgs^+/+野生型。样本1的基因型为α-MHC-Cre；Hgs^+/+，样本2的基因型为α-MHC-Cre；Hgs^fl/+，样本3的基因型为Hgs^fl/+，样本4的基因型为Hgs^fl/fl，样本5的基因型为α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl。

实施例2心肌细胞特异性Hgs基因敲除小鼠组织内HGS蛋白表达水平的检测

取实施例1制备的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-cKO)和Hgs^fl/fl小鼠(对照，Control)的心脏组织。

心脏组织蛋白提取：将放有心脏组织的离心管中加入500μL RIPA裂解液(预先加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂)，利用匀浆器将组织彻底匀浆碎，其间用PBS清洗转头。将匀浆后的组织放于冰上静置10min。

将离心管放入超声破碎仪进行超声破碎。超声程序：超声时间3min 30s，工作6s，间隔9s。

12000r/min，4℃离心机离心20min。

将所得上清液吸入另一干净的离心管中，利用BCA法测量蛋白浓度。利用所测标准品浓度得到标准曲线，计算出样品的蛋白浓度。

采用western blot检测Hgs蛋白表达，以GAPDH蛋白为参照。

取出100μL蛋白样品(即上述所得的上清液)并加入6×蛋白上样缓冲液，然后沸水中煮5min。

将蛋白量定为30μg，计算含上样缓冲液的蛋白上样量。

配置SDS-PAGE凝胶。

将SDS-PAGE电泳槽中加入电泳缓冲液，在SDS-PAGE凝胶胶孔中加入蛋白样品。电泳程序：115V，30min；175V，1h。(在上样缓冲液将要跑出胶时，停止电泳)

将电泳槽中加入转膜缓冲液，蛋白利用湿转法转至PVDF膜。电泳程序为：100v，1.5h。

使用5％脱脂奶粉作为封闭液，160rpm摇床室温孵育1.5h。

PBST洗去牛奶，孵育已稀释好的兔来源HGS一抗和小鼠来源GAPDH一抗4℃摇床过夜。

使用PBST洗膜3次，每次7min，室温孵育稀释的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG二抗1h。

利用PBST洗膜3次后，利用ImageQuant LAS 4000mini进行显影。

结果如图4所示，Hgs-cKO小鼠的心脏组织中Hgs蛋白的表达量较对照小鼠(Control)明显下降。

实施例3心肌细胞特异性Hgs基因敲除小鼠的表型分析

实施例1制备的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-cKO，6只)和Hgs^fl/fl小鼠(对照，Control，6只)，3月龄，称重后断颈处死，取出心脏。观察心脏大体形态，剪去周围大血管，用电子天平称取心脏重量，测量胫骨长度，计算心脏重量与体重的比值以及心脏重量与胫骨长度。

图5结果显示从大体形态方面进行观察发现Hgs-cKO小鼠的心脏与对照小鼠(Control)大小无明显异常，但心脏表面出现多处白色斑块，标尺长度3mm。图6结果显示Hgs-cKO小鼠的心脏重量与体重的比值(HW/BW)与对照小鼠(Control)无明显差异，Hgs-cKO小鼠的心脏重量与胫骨长度比值(HW/TL)与对照小鼠(Control)也无明显差异。

实施例4基因敲除小鼠心脏形态病理学分析

(一)心脏组织的石蜡包埋及切片

将实施例3中取出的心脏组织于4％PFA固定过夜后，放入包埋机中进行系列组织脱水。程序如下：

70％乙醇，30min；80％乙醇，30min；90％乙醇，30min；95％乙醇，30min；无水乙醇，30min；无水乙醇，30min；二甲苯，15min；二甲苯，15min。

将脱水后的组织放入石蜡中透蜡2h，其间换蜡2次，放于60℃恒温培养箱中。

将组织放到预热的包埋框中，用镊子摆好位置，凝固热蜡。

将石蜡包埋后的组织固定于石蜡切片机上开始切片。切片厚度为5μm，用毛笔将切片放于42℃水面展开，贴于载玻片。37℃过夜，用于后续染色。

(二)H&E染色

将步骤(一)制备的石蜡组织切片放在60℃恒温培养箱烤片2h。

将石蜡组织切片进行脱蜡系列乙醇复水：二甲苯，10min；二甲苯，20min；二甲苯，20min；无水乙醇，15min；无水乙醇，15min；95％乙醇，5min；90％乙醇，5min；80％乙醇，5min；70％乙醇，5min。

将组织切片用蒸馏水洗5min。

将组织切片置于Harris苏木素内染色5min，然后自来水冲5min，盐酸乙醇分化至蓝色褪去，再用自来水冲5min进行蓝化，显微镜下观察核染色情况。

将组织切片放入95％乙醇与伊红混合染液染色1min，后经95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇各一分钟进行组织脱水，二甲苯透明2次各2min，中性树胶封片。

(三)Masson染色

将步骤(一)制备的石蜡组织切片进行烤片脱蜡复水(如上述步骤(二))。

将组织切片放在Bouin’s固定液中室温过夜。

将切片置于蒸馏水中，以充分漂洗去除切片上固定液的颜色。

将组织切片置于苏木素中染色5min。

用自来水冲洗5min，再用蒸馏水浸泡8min。

将组织切片进行Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin染色3min。

蒸馏水浸泡10min(换水一次)，然后将组织切片置于磷钨酸溶液中染色5min。

再将切片放于Aniline Blue溶液中染色8min。

将切片置于蒸馏水中约5s，看到蓝色褪去立即拿出。

将组织切片迅速放于95％乙醇中进行组织系列脱水，用中性树脂封片。脱水步骤：95％乙醇，1min；无水乙醇，1min；无水乙醇，1min；二甲苯，2min；二甲苯，2min。

(四)Von Kossa染色

将步骤(一)制备的石蜡组织切片进行烤片脱蜡，系列乙醇复水(如上述步骤(二))。

向组织上滴加2％硝酸银溶液后，将组织切片置于紫外灯下照射30min。

弃掉硝酸银，使用蒸馏水进行清洗，每次2min，共2次。

用5％硫代硫酸钠孵育2min，显微镜下观察有沉淀产生，即为钙化部位。

蒸馏水冲洗5min，甲基绿染核(染色时间不要太长)

蒸馏水洗后封片。

结果如图7所示，通过H&E染色发现，与对照小鼠(Control)比较，在Hgs-cKO小鼠局部区域原本心肌细胞存在位置出现被大量纤维条索状填充现象，并出现异常的细胞核聚集(图7中A和B)。进一步的Masson染色显示，Hgs-cKO小鼠出现明显的纤维化改变，纤维化面积较对照小鼠显著增加(图7中C和D)。由于心脏表面局部有白色斑块，提示心肌有可能出现了钙化，对心脏切片进行Von kossa染色，发现Hgs-cKO小鼠心脏组织局部沉淀着色，出现钙化(图7中E和F)。

实施例5α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠心肌细胞死亡情况的检测

下述使用的小鼠为实施例1制备的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-cKO)和Hgs^fl/fl小鼠(对照，Control)，3月龄。

(一)Evans Blue灌注观察心肌细胞死亡情况

1.首先通过对小鼠腹腔注射Evans Blue，然后取出心脏组织于4％PFA中固定4℃过夜后，用30％蔗糖替换掉PFA，过夜。

2.将心脏组织用OCT包埋，冷冻后固定于冰冻切片机。

3.调整好位置及角度，进行组织切片，切片厚度为8μm，用毛笔将切片贴于载玻片上。

4.将冰冻组织切片室温晾30min。使用PBS洗2次，每次5min。

5.用0.5％Triton-100透膜15min，使用PBS洗3次，每次5min。

6.使用山羊血清封闭液，在37℃恒温培养箱封闭40min。

7.倾去血清，加入一定稀释比例的小鼠来源α-actinin一抗，4℃冰箱过夜。

8.PBS洗3次，每次5min，将组织切片加入与一抗相对应的Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG二抗(一般用PBS稀释)，37℃恒温培养箱孵育1h。

9.PBS洗3次，每次5min，组织切片放入蒸馏水中，Hoechst室温避光染核10min。

10.使用PBS洗两次，然后用10％甘油进行封片。

(二)血清中乳酸脱氢酶(LDH)含量的测定

用摘眼球法取小鼠血液于干净EP管中。

EP管室温放置30min后，3000g离心10min，然后将上清吸取到新的EP管中，所得上清即为血清。

然后用乳酸脱氢酶LDH活力定量测定试剂盒(普利莱基因技术公司)测定血清中乳酸脱氢酶的含量。

(三)免疫组化染色

将实施例4步骤(一)制备的石蜡组织切片进行烤片脱蜡，系列乙醇复水(如实施例4步骤(二))。

将组织切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中进行抗原修复，当高压锅排气时开始计时3min，将火力下降后继续加热4min关闭电源，使其自然冷却。

蒸馏水洗切片，用3％过氧化氢室温孵育15min，将内源性过氧化物酶消灭活性。

蒸馏水洗2min×3次，PBS浸泡5min。

根据一抗种属的不同，使用不同来源的封闭液。一般为山羊血清，在37℃培养箱进行封闭40min。

倾去血清，加入一定稀释比例的兔来源cleaved-caspase3一抗(按抗体说明书进行稀释)，4℃过夜。

PBS洗去一抗，5min×3次。

将组织切片加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，37℃恒温培养箱中孵育1h。

PBS洗去二抗，5min×3次，将组织切片放入蒸馏水中。

利用TSA Plus Fluorescein工作液显微镜下显色，显色后放入蒸馏水中。

将显色后的组织切片置于柠檬酸盐缓冲液中，100摄氏度处理7min，去除抗体。

加入一定稀释比例的兔来源laminin一抗(按抗体说明书进行稀释)，4℃过夜。

PBS洗去一抗，5min×3次。

将组织切片加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，37℃恒温培养箱中孵育1h。

PBS洗去二抗，5min×3次，将组织切片放入蒸馏水中。

利用TSA Plus Cyanine3工作液显微镜下显色，显色后放入蒸馏水中。

将组织切片PBS洗后进行Hoechst核染色，室温避光10min，蒸馏水洗后用封片剂封片。

(四)Western Blot检测剪切型Caspase 3蛋白表达情况

Western Blot具体方法参照实施例2，其中使用的抗体为兔来源cleaved-caspase3一抗、小鼠来源GAPDH一抗。

检测结果如图8所示。A左侧为心脏冰冻切片观察Evans Blue(EBD)染色情况，cTnT染色(绿色)用于标记心肌细胞，EBD着色(红色)标记死细胞，右侧为定量统计EBD标记区域占据心脏组织整个切片面积的比例，n＝5，对照小鼠为0.03±0.02(％)，Hgs-cKO小鼠为0.25±0.07(％)。B为血清中LDH浓度测定结果，n＝4，对照小鼠12.11±0.94(U/dL)，Hgs-cKO小鼠为17.63±1.69(U/dL)，Hgs-cKO小鼠血清中LDH水平较对照小鼠明显升高。C左侧为心脏组织免疫荧光染色检测剪切型Caspase 3表达情况。Laminin染色(绿色)标记细胞边界，剪切型Caspase 3染色(红色)标记凋亡细胞。标尺长度为50μm；右侧为定量统计剪切型Caspase 3阳性信号的细胞个数占据心脏组织切片细胞总数比例，n＝3，对照小鼠为0.23±0.07(％)，Hgs-cKO小鼠为2.74±0.48(％)。D为Western Blot杂交检测剪切型Caspase 3蛋白表达情况，相较于对照小鼠，Hgs-cKO小鼠剪切型Caspase 3蛋白表达量明显提高。

上述结果表明Hgs敲除促进心肌细胞死亡。

实施例6α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠心脏损伤相关基因的检测

下述使用的小鼠为实施例1制备的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl(Hgs-CKO 7只)和Hgs^fl/fl小鼠(对照，Control，7只)，3月龄。采用Real-time PCR检测心肌损伤相关基因的表达。

1.组织总RNA的提取

(1)取小鼠心脏组织约50mg放入1ml Trizol中，用匀浆器进行匀浆，于室温培养5分钟。

(2)加入0.2ml氯仿，盖紧瓶盖剧烈振荡15秒，放置2-3分钟。2-8℃，10000-12000g离心15分钟。

(3)将上层水相转移到一个新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟，2-8℃，10000-12000g离心10分钟。

(4)弃上清，加入至少1ml75％的乙醇洗涤，2-8℃，不大于7500g离心5分钟。

(5)弃上清，空气干燥5-10分钟，加入无RNase的水500μl，反复抽吸使RNA溶解。

(6)55-60℃保温10分钟，-70℃冰箱储存备用。

2.RNA的反转录及Real-time PCR

将提取的RNA按如下体系进行反转录：

RNA 2μg

5×RT Mix(TOYOBO) 2μL

DEPC水 up to 10μL

反应条件：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min。

将上述所得产物cDNA加水稀释到50μL，用于后续实时荧光定量PCR的模板。

3.Real-time PCR检测组织内

(1)按如下体系于96孔板中加入各组分

(2)将配制好的反应体系放入ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪中。

反应条件如下：

95℃：15s：60℃：60s；95℃：30s；60℃：15s。

GAPDH引物5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′和5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3′

β-MHC引物5′-GTGAAGGGCATGAGGAAGAGT-3′和5′-AGGCCTTCACCTTCAGCTGC-3′

ANF引物5′-GCCGGTAGAAGATGAGGTCA-3′和5′-GGGCTCCAATCCTGTCAATC-3′

BNP引物5′-GCTCTTGAAGGACCAAGGCCTCAC-3′和5′-GATCCGATCCGGTCTATCTTGTG C-3′

Colla1引物5′-AGCGAAGAACTCATACAGCCG-3′和5′-TTGGAGCAGCCATCGAC TAG-3′

Col3a1引物5′-GCCTCCCAGAACATTACATACC-3′和5′-GGGTAGTCTCAT TGCCTTGC-3′

图9为实时荧光定量PCR检测心脏组织中胚胎期基因表达水平，通过对胚胎期高表达基因的检测发现，β-MHC(Hgs-CKO为9.70±1.21，Control为1.00±0.07)，ANF(Hgs-CKO为25.41±2.86，Control为1.00±0.16)和BNP(Hgs-CKO为3.22±0.80，Control为1.00±0.16)在敲除小鼠心脏组织中mRNA表达明显上调，这些结果表明在心肌细胞内敲除Hgs导致心脏组织损伤。

图10为实时荧光定量PCR检测小鼠心脏组织RNA水平Col1a1，Col3a1的表达，对纤维化标志分子进行检测，发现基因敲除小鼠心脏内Col1al(Hgs-CKO为2.27±0.33，Control为1.00±0.07)和Col3a1(Hgs-CKO为1.76±0.29，Control为1.00±0.05)的表达水平明显上调，进一步证实了Hgs在心肌细胞的敲除导致纤维化的发生。

实施例7心脏超声检测小鼠心脏功能

下述使用的小鼠为实施例1制备的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-cKO，7只)和Hgs^{fl /fl}小鼠(对照，Control，7只)，三月龄。

腹腔注射1.5％异氟烷麻醉小鼠，胸部脱毛后，将其放置在恒温加热板上。

使用Vevo770超声仪(Visualsonics)为小鼠进行心脏探测。

记录以下参数：舒张末期左心室前壁厚度(LVAWd)，mm；舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)，mm；舒张末期左心室内径(LVIDd)，mm；舒张末期左心室容积(LVVd)，μL；收缩末期左心室前壁厚度(LVAWs)，mm；收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)，mm；收缩末期左心室内径(LVIDs)，mm；收缩末期左心室容积(LVVs)，μL；左心室质量(LVM)，mg；左室射血分数(EF)，％；左室收缩指数(FS)，％。

多普勒超声检测血流显示α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠二尖瓣口血流频谱E峰与A峰流速比值(MV E/A)，二尖瓣环组织多普勒频谱E’峰与A’峰的比值(E’/A’)，E波减速时间(EDT)，ms等指标。

所有参数测量三次取平均值。

结果如图11所示，M型超声检测结果显示Hgs-cKO小鼠收缩末期左心室容积(Hgs-cKO为16.87±2.78μL，Control为31.82±3.1μL)，舒张末期左心室容积(Hgs-cKO为53.96±2.95μL，Control为70.28±4.22μL)明显低于对照小鼠(Control)(图11A，B，C)；收缩期及舒张期左心室前壁厚度无明显差异(图11D，E)；左心房舒张末期内径(Hgs-cKO为2.58±0.03mm，Control为2.00±0.11mm)显著增加(图11F)，而左室射血分数(Hgs-cKO为69.63±3.22％，Control为54.79±3.95％)及收缩指数(Hgs-cKO为38.90±2.51％，Control为28.40±2.54％)要略高于对照小鼠(图11G，H)。多普勒超声检测血流显示Hgs-cKO小鼠二尖瓣口血流频谱E峰与A峰流速比值(Hgs-cKO为4.99±0.52，Control为1.80±0.19)远高于对照小鼠(图11A，I)；二尖瓣环组织多普勒频谱E’峰与A’峰的比值(Hgs-cKO为2.93±0.33，Control为1.24±0.25)显著大于对照小鼠(图11J)，E波减速时间(Hgs-cKO为20.81±1.16ms，Control为32.87±1.63ms)显著缩短(图11K)，这些指标均指示心肌细胞敲除Hgs引起了心脏舒张功能障碍。

上述实施例证明心肌细胞特异性敲除Hgs引起心脏产生类似限制型心肌病的病理特征。通过对心肌细胞特异性Hgs敲除小鼠进行表型分析，发现敲除Hgs会引起心肌细胞死亡，心肌纤维化、钙化以及心脏舒张功能障碍，这些表现与限制型心肌病基本一致。

实施例8多西环素(doxycycline，Dox)给药治疗

将8周龄的实施例1制备的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠8只(雌雄各半)随机分为2组：Hgs-CKO Dox组和Hgs-CKO Ctrl组，每组2只雌性和2只雄性。将8周龄的实施例1制备的Hgs^fl/fl小鼠7只(3只雌性和4只雄性)随机分为2组：Control Dox组和Control Ctrl组，Control Dox组为1只雌性和2只雄性，Control Ctrl组2只雌性和2只雄性。

Hgs-CKO Dox组和Control Dox组这两个Dox处理组的每只小鼠使用Dox进行如下8周治疗；每只小鼠自由饮用6mg/mL Dox的蔗糖溶液8周，6mg/mL Dox的蔗糖溶液是向5％蔗糖饮用水中添加Dox至Dox含量为6mg/mL得到的液体；5％蔗糖饮用水是向去离子水中加入蔗糖得到的蔗糖含量为5％(5g/100ml)得到的液体。

Hgs-CKO Ctrl组和Control Ctrl组这两个对照组每只小鼠进行如下8周治疗；每只小鼠自由饮用上述5％蔗糖饮用水8周。

治疗8周后，小鼠进行如下检测。数据多重比较分析采用TWO-WAYANOVA。

(一)Western Blot检测蛋白表达情况

Western Blot具体方法参照实施例2，其中使用的抗体为p62(cat.no.5114；CellSignaling Technology)，anti-cleaved-caspase 3(cat.no.YM3431；ImmunoWay，Plano，TX，USA)，BAG3(cat.no.10599-1-AP；Proteintech)，Des(cat.no.5332；Cell SignalingTechnology)，ankyrin repeat domain 1(ANKRD1；cat.no.sc-365056；Santa CruzBiotechnology，Dallas，TX，USA)和glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH；cat.no.TA-08；ZSGB-BIO)

蛋白表达的定量检测方法为利用软件Image J做蛋白定量分析。具体方法如下：

1.装好Image J软件后，点击软件上方的File，下拉点击Open，将扫描图片拉入进入软件中。接着点击软件上方的Image，下拉第一个是Type，点击，将其改为8-bit；

2.点击analyze，下拉点击set measurement，点击图中所勾的四个选项。然后点击ok确定。然后点击process，下拉点击substract background，只勾图中light background一个选项，点击ok；

3.完成第三步后，点击analyze，下拉出现set scale，点击它，弹出一个小框，把unit of length那个空白框内的英语改为pixels，点击OK；

4.完成前四步后开始点击file下方一列不规则圆圈，选择心型圆圈，点击出现freehand selections。然后点击Edit，下拉出现invert，点击即可；

5.最后一步，进行灰度统计。用鼠标选择图中亮色区域，尽可能的把亮色区域全部圈起来。然后点击anlyze下拉出现的measurement，即可弹出你选定区域的灰度统计值；

6.将测得的目的蛋白条带的灰度值与对应样品内参GAPDH测量的灰度值做比值后进行后续统计学分析。

检测结果如图12和图13。

图12中A为蛋白质毒性相关蛋白检测，图中A左侧为Western Blot检测蛋白表达情况，右侧为蛋白表达的定量检测情况，数据为平均值±标准误(mean+SEM)，n＝3。与蔗糖处理的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-CKO Ctrl)相比，Dox处理的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-CKO Dox)的p62蛋白、Ankrd1蛋白和Des蛋白减少，具体为Hgs-CKO Ctrl组的p62相对表达量为6.60±1.16，Hgs-CKO Dox组的p62相对表达量为5.71±1.14；Hgs-CKO Ctrl组的Ankrd1相对表达量为4.81±1.02，Hgs-CKO Dox组的Ankrd1相对表达量为3.88±0.78；Hgs-CKO Ctrl组的Des相对表达量为2.15±0.49，Hgs-CKO Dox组的Des相对表达量为0.89±0.04；Hgs-CKO Ctrl组的Bag3相对表达量为1.43±0.83，Hgs-CKO Dox组的Bag3相对表达量为1.27±0.83。

图13中A为泛素化蛋白表达检测，与蔗糖处理的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-cKOCtrl)相比，Dox处理的α-MHC-Cre；Hgs^fl/fl小鼠(Hgs-cKO Dox)的泛素化蛋白减少，具体为Hgs-CKO Ctrl组的Ubiquitin蛋白相对表达量为2.42±0.42；Hgs-CKO Dox组的Ubiquitin蛋白相对表达量为1.49±0.60。

(二)小鼠心脏功能检测

采用心脏超声检测小鼠心脏功能，具体方法与实施例7相同。

结果如图12中B和表1。

表1.多西环素治疗小鼠心脏超声检测结果

图12中B上侧图E波减速时间(EDT)的测量，下侧图为左心房内径(LAID)的测量，数据为mean±SEM，Control Ctrl，Hgs-CKO Ctrl和Hgs-CKO Dox组n＝4，Control Dox组n＝3。超声心动图分析显示，Hgs-CKO Ctrl组的小鼠心脏舒张功能逐渐下降，而Hgs-CKO Dox组小鼠的舒张功能随着时间的推移而恢复，表现为左心房内径(LAID)、二尖瓣E/A、E’/A’下降以及EDT增加。

(三)小鼠细胞心肌凋亡检测

采用免疫组化染色检测剪切性Caspase 3蛋白(cleaved-caspase 3)。具体方法与实施例5相同。

采用Western Blot检测剪切型Caspase 3蛋白表达情况，Western Blot具体方法参照实施例2，其中使用的抗体为anti-cleaved-caspase 3(cat.no.YM3431；ImmunoWay，Plano，TX，USA)。

蛋白表达的定量检测方法为利用Image J做蛋白定量分析，方法同实施例8(一)。

采用实时荧光定量PCR检测心脏组织中胚胎期基因表达。具体方法与实施例6相同。

检测结果见图12中的D-F和图13中的B-C。图12中的D为抗层粘连蛋白抗体(绿色)和抗cleaved-caspase3抗体(红色)对心室切片的免疫荧光分析，标尺50μm。图12中的E为心脏中剪切型Caspase 3阳性心肌细胞的定量，数据为mean±SEM，每组n＝3，其中，Hgs-CKOCtrl组的剪切型Caspase 3阳性心肌细胞比率为0.0021±0.0001；Hgs-CKO Dox组的比率为0.0014±0.00009。图12中F为用ctrl或Dox治疗后心室提取物中Cleaved-Caspase3(剪切型Caspase 3)的Western blot，表明使用Dox治疗后，Hgs-CKO小鼠剪切型Caspase 3蛋白表达量明显降低。上述结果表明，与Hgs-CKO Ctrl小鼠相比，Hgs-CKO Dox小鼠心肌细胞凋亡明显减少。

(四)小鼠心脏损伤相关基因表达水平的检测

采用Real-time PCR检测心肌损伤相关基因的表达，具体方法与实施例6相同。检测结果如图13。图13中的B和C为ANP和BNPmRNA水平的实时PCR分析，其中，Hgs-CKO Ctrl组的ANP变化倍数为51.07±6.49；Hgs-CKO Dox组的ANP变化倍数为34.36±3.73；Hgs-CKOCtrl组的BNP变化倍数为9.15±0.49；Hgs-CKO Dox组的变化倍数为5.95±0.82。结果显示在Hgs-CKO Dox小鼠中，编码ANP和BNP胎儿基因的重新激活也被减弱。

(五)小鼠心肌纤维化检测

采用Masson三色染色检测小鼠心肌纤维化情况，具体方法与实施例4相同。

采用实时荧光定量PCR检测小鼠心脏组织RNA水平Col1a1和Col3a1的表达。具体方法与实施例6相同。

检测结果如图12中的G-J。图12中的G为心脏切片的Masson三色染色，标尺100μm。图12中的H为用ctrl或Dox治疗后Hgs-CKO小鼠心脏纤维化面积的定量，n＝4。图中I和J分别为心脏中Col1a1和Col3a1 mRNA水平的Real-time PCR分析，数据为mean±SEM，每组n＝3。Masson三色染色、纤维化区域的定量以及Col1a1和Col3a1 mRNA表达检测结果分别如下：Hgs-CKO Ctrl组的纤维化区域所占比例为0.038％±0.006％；Hgs-CKO Dox组的纤维化区域所占比例为0.019％±0.005％；Hgs-CKO Ctrl组的Col1a1变化倍数为2.36±0.19；Hgs-CKO Dox组的Colla1变化倍数为1.57±0.10；Hgs-CKO Ctrl组的Col3a1变化倍数为2.23±0.32；Hgs-CKO Dox组的Col3a1变化倍数为0.99±0.17。这些结果显示，采用Dox治疗，减轻Hgs-CKO小鼠心肌纤维化。

上述实施例表明，通过Dox治疗可减轻小鼠的限制型心肌病。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 多西环素在制备治疗和/或预防和/或缓解和/或改善心肌病药物中的应用

<130> 210174

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8935

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtacctcca ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcctgcaag gtcacacaag 60

ggtctccacc caccaggtgc cctagtctca atttcagttt ccatgccttg ttctcacaat 120

gctggcctcc ccagagctaa tttggacttt gtttttattt caaaagggcc tgaatgagga 180

gtagatcttg tgctacccag ctctaagggt gcccgtgaag ccctcagacc tggagccttt 240

gcaacagccc tttaggtgga agcagaataa agcaattttc cttaaagcca aaatcctgcc 300

tctagactct tcttctctga cctcggtccc tgggctctag ggtggggagg tggggcttgg 360

aagaagaagg tggggaagtg gcaaaagccg atccctaggg ccctgtgaag ttcggagcct 420

tccctgtaca gcactggctc atagatcctc ctccagccaa acatagcaag aagtgatacc 480

tcctttgtga cttccccagg cccagtacct gtcaggttga aacaggattt agagaagcct 540

ctgaactcac ctgaactctg aagctcatcc accaagcaag cacctaggtg ccactgctag 600

ttagtatcct acgctgataa tatgcagagc tgggccacag aagtcctggg gtgtaggaac 660

tgaccagtga cttttcagtc ggcaaaggta tgaccccctc agcagatgta gtaatgtccc 720

cttagatccc atcccaggca ggtctctaag aggacatggg atgagagatg tagtcatgtg 780

gcattccaaa cacagctatc cacagtgtcc cttgcccctt ccacttagcc aggaggacag 840

taaccttagc ctatctttct tcctccccat cctcccagga cacaccccct ggtctgcagt 900

attcatttct tccttcacgt cccctctgtg acttccattt gcaaggcttt tgacctctgc 960

agctgctgga agatagagtt tggccctagg tgtggcaagc catctcaaga gaaagcagac 1020

aacaggggga ccagattttg gaaggatcag gaactaaatc actggcgggc ctgggggtag 1080

aaaaaagagt gagtgagtcc gctccagcta agccaagcta gtccccgaga tactctgcca 1140

cagctgggct gctcggggta gctttaggaa tgtgggtctg aaagacaatg ggattggaag 1200

acatctcttt gagtctcccc tcaaccccac ctacagacac actcgtgtgt ggccagactc 1260

ctgttcaaca gccctctgtg ttctgaccac tgagctaggc aaccagagca tgggccctgt 1320

gctgaggatg aagagttggt taccaatagc aaaaacagca ggggagggag aacagagaac 1380

gaaataagga aggaagaagg aaaggccagt caatcagatg cagtcagaag agatgggaag 1440

ccaacacaca gcttgagcag aggaaacaga aaagggagag attctgggca taaggaggcc 1500

acagaaagaa gagcccaggc cccccaagtc tcctctttat accctcatcc cgtctcccaa 1560

ttaagcccac tcttcttcct agatcagacc tgagctgcag cgaagagacc cgtagggagg 1620

atcacactgg atgaaggaga tgtgtggaga agtccaggga acctaagagc cagagcctaa 1680

aagagcaaga gataaaggtg cttcaaaggt ggccaggctg tgcacacaga gggtcgagga 1740

ctggtggtag agcctcaaga taaggatgat gctcagaatg ggcggggggg gggattctgg 1800

gggggggaga gagaaggtga gaaggagcct ggaacagaga atctggaagc gctggaaacg 1860

ataccataaa gggaagaacc caggctacct ttagatgtaa atcatgaaag acagggagaa 1920

gggaagctgg agagagtaga aggaccccgg ggcaagacat ggaagcaagg acaagccagg 1980

ttgagcgctc cgtgaaatca gcctgctgaa ggcagagccc tggtatgagc accagaacag 2040

cagaggctag ggttaatgtc gagacaggga acagaaggta gacacaggaa cagacagaga 2100

cgggggagcc aggtaacaaa ggaatggtcc ttctcacctg tggccagagc gtccatctgt 2160

gtccacatac tctagaatgt tcatcagact gcagggctgg cttgggaggc agctggaaag 2220

agtatgtgag agccagggga gacaaggggg cctaggaaag gaagaagagg gcaaaccagg 2280

ccacacaaga gggcagagcc cagaactgag ttaactcctt ccttgttgca tcttccatag 2340

gaggcagtgg gaactctgtg accaccatcc cccatgagcc cccactaccc ataccaagtt 2400

tggcctgagt ggcattctag gttccctgag gacagagcct ggcctttgtc tcttggacct 2460

gacccaagct gacccaatgt tctcagtacc ttatcatgcc ctcaagagct tgagaaccag 2520

gcagtgacat attaggccat gggctaaccc tggagcttgc acacaggagc ctcaagtgac 2580

ctccagggac acagctgcag acaggtggcc tttatcccca aagagcaacc atttggcata 2640

ggtggctgca aatgggaatg caaggttgaa tcaggtccct tcaagaatac tgcatgcaag 2700

acctaagacc cctggagaga ggggtatgct cctgccccca cccaccataa ggggagtgaa 2760

ctatcctagg gggctggcga ccttggggag acaccacatt actgagagtg ctgagcccag 2820

aaaaactgac cgccctgtgt cctgcccacc tccacactct agagctatat tgagaggtga 2880

cagtagatag ggtgggagct ggtagcaggg agagtgttcc tgggtgtgag ggtgtagggg 2940

aaagccagag caggggagtc tggctttgtc tcctgaacac aatgtctact tagttataac 3000

aggcatgacc tgctaaagac ccaacatcta cgacctctga aaagacagca gccctggagg 3060

acaggggttg tctctgagcc ttgggtgctt gatggtgcca caaaggaggg catgagtgtg 3120

agtataaggc cccaggagcg ttagagaagg gcacttggga aggggtcagt ctgcagagcc 3180

cctatccatg gaatctggag cctggggcca actggtgtaa atctctgggc ctgccaggca 3240

ttcaaagcag cacctgcatc ctctggcagc ctggggaggc ggaagggagc aaccccccac 3300

ttataccctt tctccctcag ccccaggatt aacacctctg gccttccccc ttcccacctc 3360

ccatcaggag tggagggttg cagagggagg gtaaaaacct acatgtccaa acatcatggt 3420

gcacgatata tggatcagta tgtgtagagg caagaaagga aatctgcagg cttaactggg 3480

ttaatgtgta aagtctgtgt gcatgtgtgt gtgtctgact gaaaacgggc atggctgtgc 3540

agctgttcag ttctgtgcgt gaggttacca gactgcaggt ttgtgtgtaa attgcccaag 3600

gcaaagtggg tgaatccctt ccatggttta aagagattgg atgatggcct gcatctcaag 3660

gaccatggaa aatagaatgg acactctata tgtgtctcta agctaaggta gcaaggtctt 3720

tggaggacac ctgtctagag atgtgggcaa cagagactac agacagtatc tgtacagagt 3780

aaggagagag aggagggggt gtagaattct cttactatca aagggaaact gagtcgtgca 3840

cctgcaaagt ggatgctctc cctagacatc atgactttgt ctctggggag ccagcactgt 3900

ggaacttcag gtctgagaga gtaggaggct cccctcagcc tgaagctatg cagatagcca 3960

gggttgaaag ggggaaggga gagcctggga tgggagcttg tgtgttggag gcaggggaca 4020

gatattaagc ctggaagaga aggtgaccct tacccagttg ttcaactcac ccttcagatt 4080

aaaaataact gaggtaaggg cctgggtagg ggaggtggtg tgagacgctc ctgtctctcc 4140

tctatctgcc catcggccct ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca 4200

tggagccaga ggggcgaggg caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc 4260

ctcctgtcac ctccagagcc aagggatcaa aggaggagga gccaggacag gagggaagtg 4320

ggagggaggg tcccagcaga ggactccaaa tttaggcagc aggcatatgg gatgggatat 4380

aaaggggctg gagcactgag agctgtcaga gatttctcca acccaggtaa gagggagttt 4440

cgggtggggg ctcttcaccc acaccagacc tctccccacc tagaaggaaa ctgcctttcc 4500

tggaagtggg gttcaggccg gtcagagatc tgacagggtg gccttccacc agcctgggaa 4560

gttctcagtg gcaggaggtt tccacaagaa acactggatg ccccttccct tacgctgtct 4620

tctccatctt cctcctgggg atgctcctcc ccgtcttggt ttatcttggc tcttcgtctt 4680

cagcaagatt tgccctgtgc tgtccactcc atctttctct actgtctccg tgccttgcct 4740

tgccttcttg cgtgtccttc ctttccaccc atttctcact tcaccttttc tccccttctc 4800

atttgtattc atccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 4860

tctcccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttcctgtg tcagagtgct 4920

gagaatcaca cctggggttc ccacccttat gtaaacaatc ttccagtgag ccacagcttc 4980

agtgctgctg ggtgctctct taccttcctc accccctggc ttgtcctgtt ccatcctggt 5040

caggatctct agattggtct cccagcctct gctactcctc ttcctgcctg ttcctctctc 5100

tgtccagctg cgccactgtg gtgcctcgtt ccagctgtgg tccacattct tcaggattct 5160

ctgaaaagtt aaccaggtga gaatgtttcc cctgtagaca gcagatcacg attctcccgg 5220

aagtcaggct tccagccctc tctttctctg cccagctgcc cggcactctt agcaaacctc 5280

aggcaccctt accccacata gacctctgac agagaagcag gcactttaca tggagtcctg 5340

gtgggagagc cataggctac ggtgtaaaag aggcagggaa gtggtggtgt aggaaagtca 5400

ggacttcaca tagaagccta gcccacacca gaaatgacag acagatccct cctatctccc 5460

ccataagagt ttgagtcgac ctgcagccca agctgtaccc cctcgaaact gacaggagaa 5520

ccaccatggg cccaaagaag aagagaaagg tttcgaattt actgaccgta caccaaaatt 5580

tgcctgcatt accggtcgat gcaacgagtg atgaggttcg caagaacctg atggacatgt 5640

tcagggatcg ccaggcgttt tctgagcata cctggaaaat gcttctgtcc gtttgccggt 5700

cgtgggcggc atggtgcaag ttgaataacc ggaaatggtt tcccgcagaa cctgaagatg 5760

ttcgcgatta tcttctatat cttcaggcgc gcggtctggc agtaaaaact atccagcaac 5820

atttgggcca gctaaacatg cttcatcgtc ggtccgggct gccacgacca agtgacagca 5880

atgctgtttc actggttatg cggcggatcc gaaaagaaaa cgttgatgcc ggtgaacgtg 5940

caaaacaggc tctagcgttc gaacgcactg atttcgacca ggttcgttca ctcatggaaa 6000

atagcgatcg ctgccaggat atacgtaatc tggcatttct ggggattgct tataacaccc 6060

tgttacgtat agccgaaatt gccaggatca gggttaaaga tatctcacgt actgacggtg 6120

ggagaatgtt aatccatatt ggcagaacga aaacgctggt tagcaccgca ggtgtagaga 6180

aggcacttag cctgggggta actaaactgg tcgagcgatg gatttccgtc tctggtgtag 6240

ctgatgatcc gaataactac ctgttttgcc gggtcagaaa aaatggtgtt gccgcgccat 6300

ctgccaccag ccagctatca actcgcgccc tggaagggat ttttgaagca actcatcgat 6360

tgatttacgg cgctaaggat gactctggtc agagatacct ggcctggtct ggacacagtg 6420

cccgtgtcgg agccgcgcga gatatggccc gcgctggagt ttcaataccg gagatcatgc 6480

aagctggtgg ctggaccaat gtaaatattg tcatgaacta tatccgtaac ctggatagtg 6540

aaacaggggc aatggtgcgc ctgctggaag atggcgatta gccattaacg cggcgtggta 6600

cctctagagt cgacccgggc ggcctcgaga gatctacggg tggcatccct gtgacccctc 6660

cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaac 6720

cattaacgcg cgaccagctt gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc actagtccga 6780

tcccaaggcc caactccccg aaccactcag ggtcctgtgg acagctcacc tagctgcaat 6840

ggctacaggt aagcgcccct aaaatccctt tgggcacaat gtgtcctgag gggagaggca 6900

gcgacctgta gatgggacgg gggcactaac cctcaggttt ggggcttctg aatgtgagta 6960

tcgccatgta agcccagtat ttggccaatc tcagaaagct cctggtccct ggagggatgg 7020

agagagaaaa acaaacagct cctggagcag ggagagtgct ggcctcttgc tctccggctc 7080

cctctgttgc cctctggttt ctccccaggc tcccggacgt ccctgctcct ggcttttggc 7140

ctgctctgcc tgccctggct tcaagagggc agtgccttcc caaccattcc cttatccagg 7200

ctttttgaca acgctatgct ccgcgcccat cgtctgcacc agctggcctt tgacacctac 7260

caggagtttg taagctcttg gggaatgggt gcgcatcagg ggtggcagga aggggtgact 7320

ttcccccgct gggaaataag aggaggagac taaggagctc agggtttttc ccgaagcgaa 7380

aatgcaggca gatgagcaca cgctgagtga ggttcccaga aaagtaacaa tgggagctgg 7440

tctccagcgt agaccttggt gggcggtcct tctcctagga agaagcctat atcccaaagg 7500

aacagaagta ttcattcctg cagaaccccc agacctccct ctgtttctca gagtctattc 7560

cgacaccctc caacagggag gaaacacaac agaaatccgt gagtggatgc cttctcccca 7620

ggcggggatg ggggagacct gtagtcagag cccccgggca gcacagccaa tgcccgtcct 7680

tcccctgcag aacctagagc tgctccgcat ctccctgctg ctcatccagt cgtggctgga 7740

gcccgtgcag ttcctcagga gtgtcttcgc caacagcctg gtgtacggcg cctctgacag 7800

caacgtctat gacctcctaa aggacctaga ggaaggcatc caaacgctga tgggggtgag 7860

ggtggcgcca ggggtcccca atcctggagc cccactgact ttgagagctg tgttagagaa 7920

acactgctgc cctcttttta gcagtcaggc cctgacccaa gagaactcac cttattcttc 7980

atttcccctc gtgaatcctc caggcctttc tctacaccct gaaggggagg gaggaaaatg 8040

aatgaatgag aaagggaggg aacagtaccc aagcgcttgg cctctccttc tcttccttca 8100

ctttgcagag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag cagacctaca 8160

gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac gggctgctct 8220

actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg cagtgccgct 8280

ctgtggaggg cagctgtggc ttctagctgc ccgggtggca tccctgtgac ccctccccag 8340

tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat 8400

taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg 8460

tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg 8520

aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc 8580

aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc 8640

tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct 8700

ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg 8760

cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg 8820

acgtccagac acagcatagg ctacctggcc atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct 8880

tgcttggcac tgtcctctca tgcgttgggt ccactcagta gatgcctgtt gaatt 8935

<210> 2

<211> 10553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaatccacta acttgttgaa tgagtaacaa gggtggtgta tcttgggata gctcactttc 60

gtaagggagg ggtgatccga gtgtgaagag gtgttggctg ggggtaccac ttgacatgga 120

gaaatcatcc ctcatcttct agagcttgct aagggaccca ttacattacc cagctaagag 180

gtaaaggaca aaacttctaa atgatgggac tctgttgaga agcagcaggg tatgccattt 240

taaagtgccc agcaagctgt gacaaagggc attctctacc tcctttatct ttaaagcaga 300

tgcaagtagt acctctctcc agagggtctg tgggaactga gtgaagccga gcttgagctg 360

acagctgata gggactaagt atcatttcca cattatttgc ttcttgcatg ggaggatgcc 420

atttccatgg ttgtcagtgt acttcaagag gattttcagt ttggttttgg ctgtataaaa 480

tgagggatgt tcttgacttt tgacgggccg gctcggaaac atagctcaat ggaccctttg 540

aatgggcatc tcttcccttt agacaaagcc accagccagc ttctgttgga gacagactgg 600

gagtccattc tacagatctg cgacctgatc cgtcaggggg acacacagta agtgaagaga 660

accacccctc ttctaagatt aaatgggcaa catgagtttt ttgttttttt gttttttttt 720

aatccagatt gttttgatat cttgggacaa ttaaaacagc acaatttgga gatacttaga 780

ctcactgata tttccttgag gaggtctgtc aggctaaact catggttggc ttatatttca 840

gttggtagag tatttgccta gcatgtatta aaccttgagt gtcatgctca acacactata 900

acccaggtgt gacagcactg tcatacccca ggtgtgacag cactctctgt gatcccagca 960

cttaggaagt gaagacagaa ggataggaag tccaaggctt gagtctagcc tggggtacga 1020

aaacccctgt ctcagtactt aaagaaatat ggaggagggc tttcctaacc atactgaggg 1080

ctttcccatc cttttctctc tctgctgtta ctaattccta cccccccgcc cctttttttc 1140

ccccctcttc cagagcaaaa tatgctgtaa actccatcaa gaagaaggtt aatgataaga 1200

acccacacgt ggctttgtat gctctggagg taactagagc gctgttgcag ttgtttctct 1260

cctcagactc caagaatcct tacccttccg gtgtcaggtc tccacatagc aaccagtgga 1320

gacctttagc acttcgtaca gttgtgagct cggccactga gcctggctgc tctcatggga 1380

atgggaggga gcagaaatgc tgctcttcta gctgtcatcc atgtacccct gagggactgg 1440

atgttatcag ggcctggaac ccgactttga gctgctgctt ggggtttcta acaagttagg 1500

tgggttcaga gacctgtctt ccagcaagag gggctcttgc ctcttccctg aacacgagct 1560

aggcctttct cttccttggg gttttcaggt gatggagtct gtggtaaaga actgtggcca 1620

gacagtccat gatgaagtgg ccaacaaaca gaccatggaa gaactgaagg agctgctgaa 1680

ggtaggcggg cgtcctggga gtcacaagag aaggtagatt caggtatagt gccaaatctt 1740

ctgtttgtgg gcagaataca gcaggaagag cagtgggtgt gttagagggg gtgagggtaa 1800

gaatggtcac ttactgtgag tctagcgtag accctgggag agatgctttg agactcatgg 1860

gtcatttttg caagatgaga aagacacttc ttttgggact gggaaaggct tccaagaact 1920

agggcatgaa gcttgaattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcaggtc 1980

tgaagaggag tttacgtcca gccaagctag cttggctgca ggtcgtcgaa attctaccgg 2040

gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc 2100

acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc 2160

caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg 2220

aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt 2280

ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg 2340

ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt 2400

gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc 2460

ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc 2520

tcatctccgg gcctttcgac ctgcagcctg ttgacaatta atcatcggca tagtatatcg 2580

gcatagtata atacgacaag gtgaggaact aaaccatggg atcggccatt gaacaagatg 2640

gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 2700

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 2760

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc 2820

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 2880

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 2940

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 3000

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 3060

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 3120

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgat gatctcgtcg 3180

tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 3240

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 3300

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 3360

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag 3420

gggatcaatt ctctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 3480

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 3540

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 3600

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 3660

gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tcgactagag 3720

cttgcggaac ccttcgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttca tcagtcaggt 3780

acataatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttaggtggat ccaggcttcc 3840

aagaactagg gcatgcagct gagctcttaa gggcagtagg ttacatccct gtgagcatag 3900

atggccatgg agtatatgtg tgagcttgag gaagacattc agagcagcac attcagggat 3960

gggagagatc tgagcagaga ggtccaagtt taggtgacag aatcaagagg gcaaaatgat 4020

tgagcaagga gctgccccag ggagaatgga attcataccc ttcagcagag gaggaaagac 4080

tctctggatc catgtgagat tatccccagg accacctaag gattgtgatg tggatggtga 4140

tacagctgga ttgggcaaat cgatgctgtt ccccatttca tgggatccag catcagggtt 4200

tggtctctca ggaagcccca actcatgctg cccagaacct gtctcaggcg ctgagctgtg 4260

agctgaatca gaccaggtcc tgtttgttct agcaggtcct agctgtaaaa gagctaagtg 4320

ttaggagccc tcgctgtttt tgttttggca cactgtgtcc cactgtgctg caaggggcag 4380

caggctggct tgctcctctc ctggaaggaa cccttagagg gaaacgcaaa tcccagtgta 4440

aaagcccttg tatcccttcc tgaagctgct tcatcccaac ataatgtgtc acagcctccc 4500

tgagagtgcc aagcatgaag ctggactgta gctcacaggg cctgagcccc tggagaaaca 4560

tctgaagagg atatcaccct gcctctctca gatcatggtc ctgtcttcct catgcttttt 4620

ggagagttta gctgtggacc ctagagaact gtgttactgc ccaggatccc ctggagagat 4680

agaaggaggc atggttgtag attgggaaca tgaagcagtg tagtctccgg gagtcccctg 4740

attttttggg ggggattaaa agttgtgacc ctgagcaagc atagacccaa gagagtcgct 4800

tctgtgatta agtggtgtct ggcaacccta ggaactctcc cctacctttg cactaatcgt 4860

ctctgctcag ggcaattggt cttactagat ggcccttccc tctgagacct cagacacctg 4920

gagtctcctg agccctcccc actttcttcc tgctccacag aggcaagtgg aagttaatgt 4980

tcggaacaag atcttgtacc tgatccaggc ctgggcacat gccttccgga acgaacccaa 5040

gtacaaggtg gtccaggaca cataccagat catgaaggta gaaggtaagt tagaacagcc 5100

ccagccccag gctgagaaca cgctctctag gagccacagg gttgtctttc tagcaacact 5160

aggtaacatc agtgataggg acaagggagg gcggactggt cttccctgag tgattgggag 5220

tgaggaggcg gtgttcccta aaccttggag agctccgtag agagaggcca ggctctgaca 5280

aggtcttgca ccttacacat ctaccccaca gggaggcagt aggctatttt caggcagtaa 5340

acactaaagt ctagagctaa tcaggtttcc gagtggcatg gttcctgggg gcagcgcagg 5400

atgagtggac agggaagatc tcacaagtca gggtggcgga tgctaggagc tctgaacaca 5460

gcagcagccc tgggcctcgg caccttttct atttttaatt tttatttttg ttttaatgtg 5520

tatggatgct ttgccagcag tatatgttca tggaccatgt gcatgcctgg tgtccttgga 5580

tctcctggga ctagaattac aggcagttgt gagccaccgt ttgtgtgctg gaaatggaat 5640

gggttggttg gaaggagcag tcagtgagct gcgaattcct gcagcccaat tccgatcata 5700

ttcaataacc cttaatataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat taggtccctc 5760

gaggggatcc cttacgcact gagctgtgtc cccagctctg ccttggcacc tttgctccag 5820

ttcagaccct ggggtcagag tacactggac ctgctgcaag gctacaagag tggctcatgc 5880

cagcagagag gacaaccgga atgctgtcgc tgtgtgtgag acacacaccg gcgggtttta 5940

ggccaggcca gggaggcaca aggtcttttc ttgcaatatg gcagccctag agagctggtg 6000

gagtttaaag aaaggggatc atggattagg atgttgtggt ggcacatggt tgggcttgga 6060

tctcagagaa ctctgagtat cctttcctag tcttgacagt tttgtctgat gaggcagatg 6120

tcaggggtta gaagtggtga ccagggaggc acccagtagt gactgtcacc ttctcttccc 6180

aggacatgtc ttccctgaat ttaaggaaag tgatgccatg ttcgctgctg aaagagtgag 6240

tcctgggtca gccagtactg actggcttag tagctttgga gaggaaggag aagggaggac 6300

ctggggctct ttcttgtttg gggtttggta ggggtagctc atgccttaat ctcagcattc 6360

cggaagagga ttgccatgaa ctcctgtgct agatatgtga tgagaccctg acccaaaaga 6420

agggcaacgt gaaggattta gctcactgta aagcacgtga gtgtcataca cacagtactc 6480

agtaaagcaa acgaaccagc agttagaaaa gcagccgtta gccccaggtc aagttgaaaa 6540

gtgtttatgg tgcctgtggg tgtagcactg gcttcatttg actacaacaa gtatgattca 6600

gggtagaacg aactctggca tttacacgcg ctctggtact ggctttttgt tttgttttgt 6660

tttgttttta gtatagaata gaatttattt agggcacggg gaggggagta gagggagaga 6720

aagggagaga gagaagagag gagtagagac tggccgtgag cacgtggcaa gggagagggg 6780

aatgagggga gaagggacag agggggagag gataggagag caagaggttt tttttttgga 6840

aggaaagaag gaagccagcc agccaggtgg tggtgcacgc cttgatccta gccctccaca 6900

gacagaggca tgctgatctc tgtgtgttct aggccaacct ggtctaaata tgagggtcct 6960

cgacagccag ggctacacag aaaaccctgt cttgaaaaga aaaaccaccg gacagtggtg 7020

gtgcatgcct ttaatcccaa cacttgggag gcagaggcag gcagatttct gagttcgagg 7080

ccagcctggt ctacagagtg agttccagga cagccagggc tacacagaga aaccctgtct 7140

cgaaaaaaac aaacaaacaa acgaaacaaa caaaaacaaa caaacaaaaa aactgaaaag 7200

aaaaaccaac cccacccacc cccaccatcc ccccaaaaag aaaggaggga gtacatttgt 7260

ttagaatttt ttgtttgttt agttggttga tttttatttg ttttcttgat agagggtttc 7320

tctgtttagc cctggctgtc ctggaacttg ctctatagac caggctcaca gagatccccc 7380

tacctctgcc tccctgagtg ctaggattaa aggcttgcac taccacaccc agagtgaatt 7440

tcttcacaca gctttaaaac taggctagtt gcaatggtgt acacttttat cccagaatct 7500

cagaggcaga agcagaggcc ggcagagctc tgtgatctta aagccagcct agtctaccca 7560

gtaagttgca ggacagccag tgctacacag tgaggtgcta aaccctgtct caaaaaccca 7620

catccacaaa attggcaagt gtcaggattc tacctttgac aagaagtctg tttggaggaa 7680

ggtcttctct ttggagcaac ttaaccctgg gccatgtggt ttaggccaca gaattcgatg 7740

gtcttggcac aggtagtcac attgggacct gctctggtga cctttctgtt tgaaagcact 7800

ggggagggaa atgtgatgat gactgttgtc cccaggcccc tgactgggtg gatgctgagg 7860

aatgccatcg gtgcagagta cagtttgggg tggtgacccg caaggtgagt atcccccaga 7920

gactcactcg agtatttggt ctcatgcccc tgccatcttc acaaagagca gcgctccttt 7980

gtgtgatcct gtcagtctgc tctaacctga tggtttcgga accacattca tctcagaatt 8040

gtgtggtggc tggggccgga gcttggtgtt tgcctctgtg gtgctcagtg tcatcatttg 8100

acgtttgcct catgggcagg gcccagcttc tcctcgggga tctgaacgtg gaaagcttag 8160

gctgagtcag ggtcactcta ggctttctct aggatcgggg aagaacttat ttctagggtc 8220

cacagcctgt gtggccagcg gcccctatag cttcccatct cacttcccgc ctgacagttg 8280

tgaatgtgga gcctgcaggg tctgagcaac agcactgggg ttcattgtac ttccagaatc 8340

agcacctgtt ttctgttttt tttttttttt ttaaaagatt tatttattat atataagtac 8400

actgttgctg tctttagaca taccagtaga gggtgtcaga tctcattaca gatggttgtg 8460

agccatcatg tgattgctgg gatttgaact caggaccttt ggaagagcag tcaatgctct 8520

taaccgctga gccatctctc cagccccttc tgtttatttt tgtttatttt taattccttt 8580

cctttcctcc aagtggtggc tggaactgag tttcctgcga gtcctcacct ctctgctcca 8640

cttgtcctta cccccgtgcc tgctcttgtt cactgggcct gtcttgctct gtctcacagc 8700

atcactgccg agcatgtggg cagatcttct gtggcaagtg ctcctccaag tactccacca 8760

tccccaagtt cggcattgag aaggaggtgc gcgtgtgtga gccctgctat gagcagctga 8820

acaagtgagt gttcacatct ctgtgcggac tctgtgatgc ttcagaactg caggccgcac 8880

aagctcctca agctctgtca ggagggttaa ggggcaaacc aatgctgctc tgcaggcggc 8940

cccagcaccc caaactttgg gacagggtga gcagggtgga cagtgtgggc agggttacat 9000

ggccacactc taggacaggg tgggcatagt gacatggctg caaactcaag gacagtttgg 9060

gcggggtgct gtggccccac actttaggac agggtggaca gggtgctgtg gctgcatagc 9120

agctgagact gccctgggcc agtcactggc tttgagtttt gtttagatag gctcttgctt 9180

ggacttgaat ctcctgatgt agcctttcca gttctgggac ttcagacctg gtccacacat 9240

tcttattttg gattggaaat gaagtttaca agctgagaat agtggtgcac acctttgatc 9300

cagtacttaa gaggcagaag caggtggatc tctgagttca aggccagcct ggtctacaaa 9360

gccagtccag gacagtcagg gctacacaga gaaaccctgt cttcaaaaag caagtgtgat 9420

acaaagaggc atgttttttt tttttaaaga tttatttatt tattgtatgt aagtacactg 9480

tagctgtctt cagacactcc agaagaggga gtcagatctc gttacagatg gttgttagcc 9540

accatgtggt tgctgggatt tgaactccag acctttggaa gagcagtcgg gtgctcttac 9600

ccactgagcc atctcaccag cccaagaggc atgtttaatt gtgtacatga gaacatgtct 9660

gcaagccctt ctcttggatt tctcaactgt ggtttgtgtt cctgtgtcca tatgagtttg 9720

tgtttattgt aaatttttaa aatttgctgg gaactgggtt ggggagagta gttgggcatg 9780

accgccaatg ctgtggttaa agcatgcttt ttcctttaga aaagagcatg tttaaattga 9840

aatgctaatt atgctttata tatatggccc tcagccctac tttgtggaga aatctccgac 9900

atatagatca aactctagga aaaccctggc ctgcctgggc cttactgcct gtgatgtgta 9960

tatgcttagc ccaggaagtg gcactattag gaggagtagc cttgttgaag tgggtgtgtc 10020

actgtgggtg tgggctttga gaccctcatc ctagctgcct ggaagtcagt attctgctag 10080

ctgccttcag atgaaggtgt agagctctca gctcctcctg caccatgcct gcctggatgc 10140

tgttatgttc ccaccttggt gataatgaac tgaacctctg aatccagccc caattaaatg 10200

ttgtccttat cagagttgcc ttgcaagccg ggcgtggtgg cgcacacctt tagtccagta 10260

ctcaggaggc agaggcaggc agatttctga gtttgaggcc agcctggtct acaaagtgag 10320

ttccaggaca gccagggtta tacagagaaa ccctgtcttg aaaaaaaacc aaaaaacaaa 10380

aagagttgcc ttgatcatgg tgtctgttca cagcagtgaa accctaacta agacactgtc 10440

ctttctggca ccttctgaag ggaaggacca ttgctggtca tggtaggcgc agtgggcaat 10500

atgtaggtac tatagaaagg cccttgctca gcacagccag gagagagacc cac 10553

<210> 3

<211> 8759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaatccacta acttgttgaa tgagtaacaa gggtggtgta tcttgggata gctcactttc 60

gtaagggagg ggtgatccga gtgtgaagag gtgttggctg ggggtaccac ttgacatgga 120

gaaatcatcc ctcatcttct agagcttgct aagggaccca ttacattacc cagctaagag 180

gtaaaggaca aaacttctaa atgatgggac tctgttgaga agcagcaggg tatgccattt 240

taaagtgccc agcaagctgt gacaaagggc attctctacc tcctttatct ttaaagcaga 300

tgcaagtagt acctctctcc agagggtctg tgggaactga gtgaagccga gcttgagctg 360

acagctgata gggactaagt atcatttcca cattatttgc ttcttgcatg ggaggatgcc 420

atttccatgg ttgtcagtgt acttcaagag gattttcagt ttggttttgg ctgtataaaa 480

tgagggatgt tcttgacttt tgacgggccg gctcggaaac atagctcaat ggaccctttg 540

aatgggcatc tcttcccttt agacaaagcc accagccagc ttctgttgga gacagactgg 600

gagtccattc tacagatctg cgacctgatc cgtcaggggg acacacagta agtgaagaga 660

accacccctc ttctaagatt aaatgggcaa catgagtttt ttgttttttt gttttttttt 720

aatccagatt gttttgatat cttgggacaa ttaaaacagc acaatttgga gatacttaga 780

ctcactgata tttccttgag gaggtctgtc aggctaaact catggttggc ttatatttca 840

gttggtagag tatttgccta gcatgtatta aaccttgagt gtcatgctca acacactata 900

acccaggtgt gacagcactg tcatacccca ggtgtgacag cactctctgt gatcccagca 960

cttaggaagt gaagacagaa ggataggaag tccaaggctt gagtctagcc tggggtacga 1020

aaacccctgt ctcagtactt aaagaaatat ggaggagggc tttcctaacc atactgaggg 1080

ctttcccatc cttttctctc tctgctgtta ctaattccta cccccccgcc cctttttttc 1140

ccccctcttc cagagcaaaa tatgctgtaa actccatcaa gaagaaggtt aatgataaga 1200

acccacacgt ggctttgtat gctctggagg taactagagc gctgttgcag ttgtttctct 1260

cctcagactc caagaatcct tacccttccg gtgtcaggtc tccacatagc aaccagtgga 1320

gacctttagc acttcgtaca gttgtgagct cggccactga gcctggctgc tctcatggga 1380

atgggaggga gcagaaatgc tgctcttcta gctgtcatcc atgtacccct gagggactgg 1440

atgttatcag ggcctggaac ccgactttga gctgctgctt ggggtttcta acaagttagg 1500

tgggttcaga gacctgtctt ccagcaagag gggctcttgc ctcttccctg aacacgagct 1560

aggcctttct cttccttggg gttttcaggt gatggagtct gtggtaaaga actgtggcca 1620

gacagtccat gatgaagtgg ccaacaaaca gaccatggaa gaactgaagg agctgctgaa 1680

ggtaggcggg cgtcctggga gtcacaagag aaggtagatt caggtatagt gccaaatctt 1740

ctgtttgtgg gcagaataca gcaggaagag cagtgggtgt gttagagggg gtgagggtaa 1800

gaatggtcac ttactgtgag tctagcgtag accctgggag agatgctttg agactcatgg 1860

gtcatttttg caagatgaga aagacacttc ttttgggact gggaaaggct tccaagaact 1920

agggcatgaa gcttgaattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcatcag 1980

tcaggtacat aatataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag gtggatccag 2040

gcttccaaga actagggcat gcagctgagc tcttaagggc agtaggttac atccctgtga 2100

gcatagatgg ccatggagta tatgtgtgag cttgaggaag acattcagag cagcacattc 2160

agggatggga gagatctgag cagagaggtc caagtttagg tgacagaatc aagagggcaa 2220

aatgattgag caaggagctg ccccagggag aatggaattc atacccttca gcagaggagg 2280

aaagactctc tggatccatg tgagattatc cccaggacca cctaaggatt gtgatgtgga 2340

tggtgataca gctggattgg gcaaatcgat gctgttcccc atttcatggg atccagcatc 2400

agggtttggt ctctcaggaa gccccaactc atgctgccca gaacctgtct caggcgctga 2460

gctgtgagct gaatcagacc aggtcctgtt tgttctagca ggtcctagct gtaaaagagc 2520

taagtgttag gagccctcgc tgtttttgtt ttggcacact gtgtcccact gtgctgcaag 2580

gggcagcagg ctggcttgct cctctcctgg aaggaaccct tagagggaaa cgcaaatccc 2640

agtgtaaaag cccttgtatc ccttcctgaa gctgcttcat cccaacataa tgtgtcacag 2700

cctccctgag agtgccaagc atgaagctgg actgtagctc acagggcctg agcccctgga 2760

gaaacatctg aagaggatat caccctgcct ctctcagatc atggtcctgt cttcctcatg 2820

ctttttggag agtttagctg tggaccctag agaactgtgt tactgcccag gatcccctgg 2880

agagatagaa ggaggcatgg ttgtagattg ggaacatgaa gcagtgtagt ctccgggagt 2940

cccctgattt tttggggggg attaaaagtt gtgaccctga gcaagcatag acccaagaga 3000

gtcgcttctg tgattaagtg gtgtctggca accctaggaa ctctccccta cctttgcact 3060

aatcgtctct gctcagggca attggtctta ctagatggcc cttccctctg agacctcaga 3120

cacctggagt ctcctgagcc ctccccactt tcttcctgct ccacagaggc aagtggaagt 3180

taatgttcgg aacaagatct tgtacctgat ccaggcctgg gcacatgcct tccggaacga 3240

acccaagtac aaggtggtcc aggacacata ccagatcatg aaggtagaag gtaagttaga 3300

acagccccag ccccaggctg agaacacgct ctctaggagc cacagggttg tctttctagc 3360

aacactaggt aacatcagtg atagggacaa gggagggcgg actggtcttc cctgagtgat 3420

tgggagtgag gaggcggtgt tccctaaacc ttggagagct ccgtagagag aggccaggct 3480

ctgacaaggt cttgcacctt acacatctac cccacaggga ggcagtaggc tattttcagg 3540

cagtaaacac taaagtctag agctaatcag gtttccgagt ggcatggttc ctgggggcag 3600

cgcaggatga gtggacaggg aagatctcac aagtcagggt ggcggatgct aggagctctg 3660

aacacagcag cagccctggg cctcggcacc ttttctattt ttaattttta tttttgtttt 3720

aatgtgtatg gatgctttgc cagcagtata tgttcatgga ccatgtgcat gcctggtgtc 3780

cttggatctc ctgggactag aattacaggc agttgtgagc caccgtttgt gtgctggaaa 3840

tggaatgggt tggttggaag gagcagtcag tgagctgcga attcctgcag cccaattccg 3900

atcatattca ataaccctta atataacttc gtataatgta tgctatacga agttattagg 3960

tccctcgagg ggatccctta cgcactgagc tgtgtcccca gctctgcctt ggcacctttg 4020

ctccagttca gaccctgggg tcagagtaca ctggacctgc tgcaaggcta caagagtggc 4080

tcatgccagc agagaggaca accggaatgc tgtcgctgtg tgtgagacac acaccggcgg 4140

gttttaggcc aggccaggga ggcacaaggt cttttcttgc aatatggcag ccctagagag 4200

ctggtggagt ttaaagaaag gggatcatgg attaggatgt tgtggtggca catggttggg 4260

cttggatctc agagaactct gagtatcctt tcctagtctt gacagttttg tctgatgagg 4320

cagatgtcag gggttagaag tggtgaccag ggaggcaccc agtagtgact gtcaccttct 4380

cttcccagga catgtcttcc ctgaatttaa ggaaagtgat gccatgttcg ctgctgaaag 4440

agtgagtcct gggtcagcca gtactgactg gcttagtagc tttggagagg aaggagaagg 4500

gaggacctgg ggctctttct tgtttggggt ttggtagggg tagctcatgc cttaatctca 4560

gcattccgga agaggattgc catgaactcc tgtgctagat atgtgatgag accctgaccc 4620

aaaagaaggg caacgtgaag gatttagctc actgtaaagc acgtgagtgt catacacaca 4680

gtactcagta aagcaaacga accagcagtt agaaaagcag ccgttagccc caggtcaagt 4740

tgaaaagtgt ttatggtgcc tgtgggtgta gcactggctt catttgacta caacaagtat 4800

gattcagggt agaacgaact ctggcattta cacgcgctct ggtactggct ttttgttttg 4860

ttttgttttg tttttagtat agaatagaat ttatttaggg cacggggagg ggagtagagg 4920

gagagaaagg gagagagaga agagaggagt agagactggc cgtgagcacg tggcaaggga 4980

gaggggaatg aggggagaag ggacagaggg ggagaggata ggagagcaag aggttttttt 5040

tttggaagga aagaaggaag ccagccagcc aggtggtggt gcacgccttg atcctagccc 5100

tccacagaca gaggcatgct gatctctgtg tgttctaggc caacctggtc taaatatgag 5160

ggtcctcgac agccagggct acacagaaaa ccctgtcttg aaaagaaaaa ccaccggaca 5220

gtggtggtgc atgcctttaa tcccaacact tgggaggcag aggcaggcag atttctgagt 5280

tcgaggccag cctggtctac agagtgagtt ccaggacagc cagggctaca cagagaaacc 5340

ctgtctcgaa aaaaacaaac aaacaaacga aacaaacaaa aacaaacaaa caaaaaaact 5400

gaaaagaaaa accaacccca cccaccccca ccatcccccc aaaaagaaag gagggagtac 5460

atttgtttag aattttttgt ttgtttagtt ggttgatttt tatttgtttt cttgatagag 5520

ggtttctctg tttagccctg gctgtcctgg aacttgctct atagaccagg ctcacagaga 5580

tccccctacc tctgcctccc tgagtgctag gattaaaggc ttgcactacc acacccagag 5640

tgaatttctt cacacagctt taaaactagg ctagttgcaa tggtgtacac ttttatccca 5700

gaatctcaga ggcagaagca gaggccggca gagctctgtg atcttaaagc cagcctagtc 5760

tacccagtaa gttgcaggac agccagtgct acacagtgag gtgctaaacc ctgtctcaaa 5820

aacccacatc cacaaaattg gcaagtgtca ggattctacc tttgacaaga agtctgtttg 5880

gaggaaggtc ttctctttgg agcaacttaa ccctgggcca tgtggtttag gccacagaat 5940

tcgatggtct tggcacaggt agtcacattg ggacctgctc tggtgacctt tctgtttgaa 6000

agcactgggg agggaaatgt gatgatgact gttgtcccca ggcccctgac tgggtggatg 6060

ctgaggaatg ccatcggtgc agagtacagt ttggggtggt gacccgcaag gtgagtatcc 6120

cccagagact cactcgagta tttggtctca tgcccctgcc atcttcacaa agagcagcgc 6180

tcctttgtgt gatcctgtca gtctgctcta acctgatggt ttcggaacca cattcatctc 6240

agaattgtgt ggtggctggg gccggagctt ggtgtttgcc tctgtggtgc tcagtgtcat 6300

catttgacgt ttgcctcatg ggcagggccc agcttctcct cggggatctg aacgtggaaa 6360

gcttaggctg agtcagggtc actctaggct ttctctagga tcggggaaga acttatttct 6420

agggtccaca gcctgtgtgg ccagcggccc ctatagcttc ccatctcact tcccgcctga 6480

cagttgtgaa tgtggagcct gcagggtctg agcaacagca ctggggttca ttgtacttcc 6540

agaatcagca cctgttttct gttttttttt ttttttttaa aagatttatt tattatatat 6600

aagtacactg ttgctgtctt tagacatacc agtagagggt gtcagatctc attacagatg 6660

gttgtgagcc atcatgtgat tgctgggatt tgaactcagg acctttggaa gagcagtcaa 6720

tgctcttaac cgctgagcca tctctccagc cccttctgtt tatttttgtt tatttttaat 6780

tcctttcctt tcctccaagt ggtggctgga actgagtttc ctgcgagtcc tcacctctct 6840

gctccacttg tccttacccc cgtgcctgct cttgttcact gggcctgtct tgctctgtct 6900

cacagcatca ctgccgagca tgtgggcaga tcttctgtgg caagtgctcc tccaagtact 6960

ccaccatccc caagttcggc attgagaagg aggtgcgcgt gtgtgagccc tgctatgagc 7020

agctgaacaa gtgagtgttc acatctctgt gcggactctg tgatgcttca gaactgcagg 7080

ccgcacaagc tcctcaagct ctgtcaggag ggttaagggg caaaccaatg ctgctctgca 7140

ggcggcccca gcaccccaaa ctttgggaca gggtgagcag ggtggacagt gtgggcaggg 7200

ttacatggcc acactctagg acagggtggg catagtgaca tggctgcaaa ctcaaggaca 7260

gtttgggcgg ggtgctgtgg ccccacactt taggacaggg tggacagggt gctgtggctg 7320

catagcagct gagactgccc tgggccagtc actggctttg agttttgttt agataggctc 7380

ttgcttggac ttgaatctcc tgatgtagcc tttccagttc tgggacttca gacctggtcc 7440

acacattctt attttggatt ggaaatgaag tttacaagct gagaatagtg gtgcacacct 7500

ttgatccagt acttaagagg cagaagcagg tggatctctg agttcaaggc cagcctggtc 7560

tacaaagcca gtccaggaca gtcagggcta cacagagaaa ccctgtcttc aaaaagcaag 7620

tgtgatacaa agaggcatgt tttttttttt taaagattta tttatttatt gtatgtaagt 7680

acactgtagc tgtcttcaga cactccagaa gagggagtca gatctcgtta cagatggttg 7740

ttagccacca tgtggttgct gggatttgaa ctccagacct ttggaagagc agtcgggtgc 7800

tcttacccac tgagccatct caccagccca agaggcatgt ttaattgtgt acatgagaac 7860

atgtctgcaa gcccttctct tggatttctc aactgtggtt tgtgttcctg tgtccatatg 7920

agtttgtgtt tattgtaaat ttttaaaatt tgctgggaac tgggttgggg agagtagttg 7980

ggcatgaccg ccaatgctgt ggttaaagca tgctttttcc tttagaaaag agcatgttta 8040

aattgaaatg ctaattatgc tttatatata tggccctcag ccctactttg tggagaaatc 8100

tccgacatat agatcaaact ctaggaaaac cctggcctgc ctgggcctta ctgcctgtga 8160

tgtgtatatg cttagcccag gaagtggcac tattaggagg agtagccttg ttgaagtggg 8220

tgtgtcactg tgggtgtggg ctttgagacc ctcatcctag ctgcctggaa gtcagtattc 8280

tgctagctgc cttcagatga aggtgtagag ctctcagctc ctcctgcacc atgcctgcct 8340

ggatgctgtt atgttcccac cttggtgata atgaactgaa cctctgaatc cagccccaat 8400

taaatgttgt ccttatcaga gttgccttgc aagccgggcg tggtggcgca cacctttagt 8460

ccagtactca ggaggcagag gcaggcagat ttctgagttt gaggccagcc tggtctacaa 8520

agtgagttcc aggacagcca gggttataca gagaaaccct gtcttgaaaa aaaaccaaaa 8580

aacaaaaaga gttgccttga tcatggtgtc tgttcacagc agtgaaaccc taactaagac 8640

actgtccttt ctggcacctt ctgaagggaa ggaccattgc tggtcatggt aggcgcagtg 8700

ggcaatatgt aggtactata gaaaggccct tgctcagcac agccaggaga gagacccac 8759