一种用于快速鉴别质谱样本聚乙二醇污染的方法
阅读说明：本技术 一种用于快速鉴别质谱样本聚乙二醇污染的方法 (Method for rapidly identifying polyethylene glycol pollution of mass spectrum sample ) 是由 陆欣 许国旺 胡春秀 张秀琼 由蕾 孙晓珊 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用极坐标散点灰度图、基于肯德里克质量(Kendrick mass,KM)、肯德里克质量亏损(Kendrick mass defect,KMD)及保留时间(retention time,RT)相互关系来判断质谱分析样本中是否含有聚乙二醇(PEG)聚合物的方法,属于分析化学应用研究领域。该方法适用于评价待质谱分析的临床或生物样本在采集及制备过程中是否存在PEG污染。该方法的检测过程基于高效液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)来完成,在得到质谱分析样本的LC-MS数据后,通过构建数据的KM-KMD-RT极坐标散点灰度图即可判定样本中PEG峰及其碎片离子的存在情况。本方法有助于评估质谱样本的质量、采集耗材的质量及制备方法的可靠性,进而保证了代谢组学等高通量质谱数据的质量。(The invention discloses a method for judging whether a mass spectrometry sample contains polyethylene glycol (PEG) polymers or not by utilizing a polar coordinate scatter plot gray-scale map and based on Kendrick Mass (KM), Kendrick Mass Defect (KMD) and Retention Time (RT) mutual relations, and belongs to the field of analytical chemistry application research. The method is suitable for evaluating whether PEG pollution exists in the process of collecting and preparing clinical or biological samples to be subjected to mass spectrometry. The detection process of the method is completed based on a high performance liquid chromatography-mass spectrometry combined technology (LC-MS), and after LC-MS data of a mass spectrometry sample is obtained, the existence condition of PEG peaks and fragment ions thereof in the sample can be judged by constructing a KM-KMD-RT polar coordinate scatter gray scale diagram of the data. The method is beneficial to evaluating the quality of the mass spectrum sample, the quality of the acquisition consumables and the reliability of the preparation method, and further ensures the quality of high-throughput mass spectrum data such as metabonomics.)
技术领域
本发明涉及分析化学和非靶向代谢组学应用领域，是一种利用极坐标散点灰度图来显示样本液相色谱质谱联用(LC-MS)数据中聚乙二醇(PEG)聚合物峰的方法。
技术背景
近年来，代谢组学在筛选临床疾病标志物、揭示疾病的发生发展机理、药物疗效及安全性评价等方面体现出了广阔的应用前景。LC-MS以其灵敏性高、分析范围广、特异性好等特点成为了代谢组学临床样本分析最主要的技术手段。然而，由于采集耗材质量问题或样本制备过程中有机试剂不合理使用等原因，临床样本(血液、尿液等)或生物样本(细胞、微生物提取物等)采集及制备过程中经常会将大量的聚合物引入到待分析样本中，进而造成LC-MS代谢组学数据中存在严重的聚合物峰污染，并对后续的数据分析造成较大影响，PEG便是最为常见的一种。目前，对于样本中聚合物的检测方法包括红外法、凝胶渗透色谱法等，但这些方法相比于LC-MS灵敏度较低且操作流程复杂，对于诸如临床或生物样本等复杂体系中的低浓度聚合物无法获得较好的表征效果。因此，建立灵敏、高效的聚合物表征方法对于保证质谱样本数据质量、减少数据分析干扰具有重要意义。
肯德里克质量(KM)与肯德里克质量亏损(KMD)的相互关系常被用于表征具有相同化学母核且不同数量重复基团的一系列化合物，如石油烃类、脂质等。而聚合物峰在LC-MS数据中的行为也具有上述特征，前期有研究利用KM-KMD散点图来表征聚合物标准物质在LC-MS数据中的行为，相比于传统方法能够更加直观地将聚合物峰从LC-MS中呈现出来。但由于实际样本相对于标准物质化学组成更加复杂、干扰性更强，简单的二维散点图不足以对如此复杂体系中的聚合物进行表征。此外，KMD为KM值的小数部分，在传统的二维正交散点图中KMD接近“0”和接近“1”的点分布在散点图的两端。由于分析仪器具有固有的系统误差，当化合物的KMD在小到接近“0”或大到接近“1”的情况下，具有相同理论KMD的化合物易受到仪器系统误差的影响被错误地分配到散点图KMD轴的两端，进而不利于准确判断这些化合物之间KMD的关系。因此，对于复杂生物体系中的聚合物表征需要结合更多的化合物表征信息、基于更加准确、全面的可视化技术来实现。
发明内容
本发明的目的在于基于KM、KMD及保留时间(RT)相关性构建一种用于快速鉴别质谱样本聚乙二醇污染的方法。
申请人经研究发现，在使用真空负压管等耗材进行样本采集及制备的过程中，由于劣质采样耗材的使用、采集流程操作的不规范、提取试剂的不合理使用都易将PEG引入到制备完成待分析的样本中。这些聚合物往往以多种母核结构、不同数量-C2H4O-重复单位的形式存在，对后期的数据处理及多变量分析造成较大影响。由于相同母核聚合物峰具有KMD相同而KM递变的规律，有文献报道可用KM-KMD散点图来对聚合物峰进行表征，然而实际样本研究中由于临床样本体系更加复杂，传统的散点图无法对埋藏在海量离子特征中的聚合物分子及其碎片进行有效表征，如何在表征过程中融入更多的结构信息、利用更全面的可视化技术来表征复杂样本中聚合物峰对于保证样本及数据质量具有重要意义。
针对上述研究及问题，申请人发现相同KMD聚合物的LC-MS色谱峰的保留时间随着其重复基团数目的增多而增加的趋势，因此首次提出将保留时间作为又一特征信息与KM及KMD共同表征质谱样本中的PEG聚合物峰。此外，针对当前常用的KM-KMD正交散点图无法解决散点KMD值接近“0”和“1”时易在KMD轴两端分布的问题，可采用极坐标来表征KMD，即极坐标0度来表示KMD的“0”值，用360度来表示KMD的“1”值，用半径来表征KM。由于在极坐标散点图中极坐标0度和360度是重合的，即使出现了由于系统误差而导致的KMD接近“0”、“1”而错误分配的情况，散点也不会出现两端分布的情况，从而有利于判定这些区域化合物是否具有相同KMD。本发明公开了一种用于快速鉴别质谱样本聚乙二醇污染的方法，具体步骤如下：
以质谱样本的液相色谱质谱联用高通量数据为分析对象，利用数据中离子特征的肯德里克质量、肯德里克质量亏损及保留时间三种信息构建可以区分聚合物峰及其他离子特征的极坐标散点灰度图，进而实现对样本中聚乙二醇特征峰的快速识别；所述判定手段为基于离子特征的肯德里克质量、肯德里克质量亏损及保留时间相关性所构建的极坐标散点灰度图；所述信息是指离子特征在极坐标散点灰度图中的分布形式及灰度色度变化趋势；
判定过程为：将所有待判定离子特征的质荷比根据聚乙二醇的重复单位-C2H4O-的IUPAC质量与肯德里克质量比值转换为各自的肯德里克质量，并在此基础上计算相应的肯德里克质量亏损，最后以各离子特征的肯德里克质量为半径、肯德里克质量亏损极坐标为极坐标、保留时间为色度标度构建极坐标散点灰度图，并根据散点的分布情况及灰度色度变化即可判定聚乙二醇的存在情况。
识别聚合物重复单位为-C2H4O-，数据中各离子特征的肯德里克质量(KM待测离子)根据-C2H4O-的IUPAC质量(IMC2H4O)与其肯德里克质量(KMC2H4O)的比值利用其各自的实测IUPAC质量(IM待测离子)来计算，其中KMC2H4O为44Da、IMC2H4O为44.0262Da，具体计算公式为KM待测离子＝KMC2H4O×IM待测离子/IMC2H4O＝IM待测离子×44/44.0262；各离子特征的肯德里克质量亏损(KMD待测离子)则是其肯德里克质量的小数部分，各离子的质量亏损极坐标为θ待测离子＝KMD待测离子×360度；
聚乙二醇污染样本的判断标准为：图中存在不少于5个散点成等极坐标、等半径间距排列；极坐标相等判定标准为相邻散点肯德里克质量亏损±0.01Da，即极坐标±3.6度；等半径间距判定标准为相邻散点半径间隔44±0.01Da或22±0.005Da(双电荷)；满足上述标准的散点灰度标度显示为随着其肯德里克质量升高灰度色度连续增加。
本发明具有以下优点：相比于传统的KM-KMD散点图，本发明避免了KMD“0”值、“1”值附近散点两端分布的情况；此外，本发明引入了RT灰度图可对筛选的潜在聚合物做进一步确证；由于采用了极坐标散点形式，本发明对于混杂于复杂体系中的聚合物散点具有更好的分辨能力。
本发明的意义在于：随着代谢组学及LC-MS等相关技术越来越多地应用于临床检验及生物样本分析，如何保证样本其相关数据的质量是获得稳定、可靠结果的重要前提。作为样本采集及制备过程中最容易引入的污染物，快速判别质谱样本中PEG的存在状态对于科学评价耗材及数据质量具有重要意义。
附图说明
图1：未被PEG污染的正常人血清LC-MS正离子KM-KMD-RT极坐标散点灰度图(0-24min)。
图2：未被PEG污染的正常人血清LC-MS正离子KM-KMD-RT极坐标散点灰度图(3-9min)。
图3：PEG污染的正常人血清LC-MS正离子KM-KMD-RT极坐标散点灰度图(0-24min)。
图4：PEG污染的正常人血清LC-MS正离子KM-KMD-RT极坐标散点灰度图(3-9min)。
具体实施方式
实施例
1样本采集：
血液样本按照临床标准采集程序进行采集。首先利用不含抗凝剂的真空负压采血管进行全血样本的采集，通过室温静置30min、4000rpm离心后得到血清样本，分离得到的血清样本分装后-80℃冻存。
2样本制备
取不含聚乙二醇污染物及证实含有聚乙二醇污染物的1.5mL塑料离心管，分别加入50μL缓冻后的血清样本，再加入200μL的0℃的甲醇并涡旋1min，将该含甲醇的混合样本置于4℃中静置10min，之后将该样本于14000rpm，4℃离心10min，取上清200μL进行冻干。
冻干后的样本中加入50μL25％(V/V)乙腈溶液并涡旋1min，混合溶液于14000rpm，4℃离心10min，上清40μL至于玻璃进样瓶中待分析。
3样本分析
样本分析采用液相色谱质谱联用仪，离子模式为电喷雾正离子模式。
色谱分析采用沃特世Aquity系列超高效液相色谱(ultra-performance liquidchromatography,UPLC)，色谱柱采用沃特世BEH C8(100mm×2.1mm，1.7μm)反相色谱柱，柱温为60℃。流动相A为含0.1％甲酸(V/V)的水，流动相B为含0.1％甲酸(V/V)的乙腈，洗脱梯度(体积)为：0-1min维持B相在2％，1-18min将B相线性地从2％升至100％，18-22min将B相维持在100％，22-22.1min将B相梯度降为2％，22.1-25min将B相维持在2％以平衡梯度。色谱流速为0.35mL/min，进样体积为4μL。质谱分析采用ABScix5600系列高分辨质谱仪。采集模式为电喷雾正离子模式，喷雾电压为5500V，表面温度为550℃，扫描模式采用Full scan模式，GS1及GS2均为55psi。采集速度为0.3秒/谱，采集范围为50-1000Da。
采用LC-MS/MS二级质谱分析结合聚乙二醇特征碎片对聚乙二醇特征峰进行鉴定。
4离子特征提取
数据中的离子特征提取采用XCMS(https://xcmsonline.scripps.edu/landing_page.php？pgcontent＝mainPage)在线数据分析平台进行离子特征的提取。提取参数为：Method：centWave，ppm：10，minimum peak width：5s，maximum peak width：30s，mzdiff：0.01，S/N threshold：6，Integration method：1，prefilter peaks：3，prefilterintensity：100。
5KM、KMD的计算及极坐标散点灰度图的构建
含有聚乙二醇及不含有聚乙二醇的样本经过离子特征筛选分别得到了1312及742个离子特征。以根据KM待测离子＝44×IM待测离子/44.0262将各离子特征的m/z转换为各离子特征的KM，其小数部分即为对应的KMD。例如，IM为906.2890Da的离子特征的KM为44×906.2890Da/44.0262＝905.7497Da，其KMD为0.7497Da；IM为736.4199Da的离子特征的KM为44×736.4199Da/44.0262＝735.9816Da，其KMD为0.9816Da；IM为566.5518Da的离子特征的KM为44×566.5518Da/44.0262＝566.2146Da，其KMD为0.2146Da；IM为362.7104Da的离子特征的KM为44×362.7104Da/44.0262＝362.4946Da，其KMD为0.4946Da。最后，利用Origin2017软件以各离子特征的KM为半径、KMD×360度为对应极坐标，RT为灰度图灰度标度，构建KM-KMD-RT极坐标散点灰度图。
6PEG污染的鉴别
如附图1、2所示为未被PEG污染的血清样本KM-KMD-RT散点灰度图，图3、4为被PEG污染的血清样本KM-KMD-RT散点灰度图，图1、3为用全部离子特征构建的散点图，散点保留时间从0至24min，图2、4为PEG主要聚集的色谱保留时间区域，散点保留时间为3到9min。根据本发明中对于PEG的判断标准，从图中1、3中可以看出以下特征：①图3中相比于图1出现若干条由中心向外散射的直线(椭圆线内)，提示组成直线的散点具有相等的极坐标，原始数据中其误差小于3.6度；②直线中的散点数量最少的含有6个点；③直线中的散点呈现半径间距相等的排列方式，相邻散点原始数据中的间距均为44±0.01Da或22±0.005Da；④从图4的散点灰度标度可以看出，满足上述三个特征的散点具有随着KM的增加，散点灰度色度逐渐增加，该灰度色度变化趋势提示RT值也逐渐增加。以上特征均与PEG聚合物的判定信息相符。
最后利用LC-MS/MS对根据KM-KMD-RT散点灰度图判断的聚乙二醇特征峰进行鉴定，其中均含有质荷比为89.0620±0.01Da、133.0863±0.01Da、177.1133±0.01Da、221.1355±0.01Da、265.1639±0.01Da等聚乙二醇特征碎片，证明根据KM-KMD-RT散点灰度图能够准确判定聚乙二醇污染物的特征峰。
6结论
在实际样本的采集中经常由于耗材质量问题或有机试剂的不合理使用造成以PEG为代表的聚合物的引入，对样本及数据质量造成影响。因此，快速、准确地判断样本中聚合物的存在情况对于保证临床数据质量至关重要。利用我们公开的PEG表征方法可以实现对样本中各类聚合物的快速、准确表征。相比于之前报道的方法，避免了某些聚合物由于系统误差而无法准确表征的问题，此外引入的保留时间灰度图还可以对聚合物散点进行确证，保证了准确性。相比于传统的正交散点图，本方法所应用的极坐标图具有更好的分辨能力，对于复杂样本中的聚合物峰具有更好的表征效果。
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