一种使君子配方颗粒特征图谱的构建及检测方法
阅读说明：本技术 一种使君子配方颗粒特征图谱的构建及检测方法 (Construction and detection method of rangooncreeper fruit formula particle characteristic spectrum ) 是由 周厚成 胡昌江 辜新月 陈玉梅 宋媛 叶志萍 周维 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种使君子配方颗粒特征图谱的构建及检测方法,属于中药分析及质量鉴别、控制技术领域。在本技术方案中,基于高效液相色谱仪建立特征图谱,并进行特征图谱的检测,能整体控制使君子配方颗粒中的特征成分,弥补了现有质量控制技术的不足,所得特征图谱中的特征峰信息量丰富,能有效保证使君子配方颗粒的整体质量的稳定性,使使君子配方颗粒的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单,具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势,为中药材质量鉴别提供有效依据。(The invention discloses a construction and detection method of a rangooncreeper fruit formula particle characteristic spectrum, and belongs to the technical field of traditional Chinese medicine analysis, quality identification and control. In the technical scheme, the characteristic spectrum is established based on a high performance liquid chromatograph, the detection of the characteristic spectrum is carried out, the characteristic components in the rangooncreeper fruit formula particles can be integrally controlled, the defects of the existing quality control technology are overcome, the information content of characteristic peaks in the obtained characteristic spectrum is rich, the stability of the overall quality of the rangooncreeper fruit formula particles can be effectively guaranteed, and the quality control technology of the rangooncreeper fruit formula particles is more perfect and scientific; the method is simple to operate, has the advantages of high precision, good stability, good repeatability, high accuracy and the like, and provides an effective basis for quality identification of the traditional Chinese medicinal materials.)
技术领域
本发明涉及一种中药的特征图谱的构建方法，尤其涉及一种使君子配方颗粒特征图谱的构建及检测方法，属于中药分析及质量鉴别、控制技术领域。
背景技术
使君子为使君子科植物使君子Quisqualis indica L.的干燥成熟果实，主产于热带及亚热带地区，味甘，性温，能敛虚热而止泻痢，有杀虫、益脾胃之功效。
使君子配方颗粒是由单味中药使君子饮片经水提、浓缩、干燥、制粒等而成，与药材和饮片相比，已失去固有的形态，以及对应的活性成分也有相应的变化，因此仅采用药材或饮片的含量指示性成分定量分析，难以全面反映其内在质量，而目前对于使君子配方颗粒的定性检测技术几乎没有。
特征图谱是一种体现中药化学成分整体特征的质量评价方法，对中药及其制剂的真实性、质量的一致性和稳定性均可有效地加以检测和控制。因此，有必要建立一种快速鉴别使君子配方颗粒的HPLC特征图谱方法，为有效控制和较全面评价使君子配方颗粒的质量提供依据。
现有技术“UPLC-MS/MS法同时测定使君子药材中9个成分的含量，温秀萍等，2020年”中公开了：建立超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)同时测定使君子药材中9个成分(葫芦巴碱、香草酸、阿魏酸、丁香酸、儿茶素、鞣花酸、苹果酸、没食子酸、没食子酸甲酯)的含量。方法：采用Welch Xtimate C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)，以0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱，流速0.25mL·min–1，柱温45℃；质谱采用ESI离子源，多反应监测模式。检测34批次不同产地(福建、四川、广西、广东)使君子中9种成分的含量，并结合化学计量学分析筛选出使君子的质控标志物。
发明内容
本发明旨在解决现有技术问题，而提出了一种使君子配方颗粒特征图谱的构建及检测方法。在本技术方案中，基于高效液相色谱仪建立特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制使君子配方颗粒中的特征成分，弥补了现有质量控制技术的不足，所得特征图谱中的特征峰信息量丰富，能有效保证使君子配方颗粒的整体质量的稳定性，使使君子配方颗粒的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
一种使君子配方颗粒特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.对照品溶液的制备：取鞣花酸对照品，加质量分数为80％的甲醇溶解，制成每1mL含20μg的溶液，即得；
B.供试品溶液的制备：取本品，研细，称定1.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.建立：分别取所得对照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：360nm；
理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000；
流动相按梯度洗脱程序为：
进一步的，所述君子配方颗粒的HPLC特征图谱包括六个特征峰，其中，峰2为鞣花酸，以峰2为参照峰S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.56、峰3为1.12、峰4为1.21、峰5为1.42以及峰6为1.63，相对保留时间在规定值的±10％之内。
一种使君子配方颗粒特征图谱的检测方法，包括如下步骤：
S1.取本品，研细，称定1.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2.检测：取经步骤S1所得供试品溶液10μL，注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与所得HPLC特征图谱进行比较，检测使君子配方颗粒的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：360nm；
理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000；
流动相按梯度洗脱程序为：
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1)本发明提供一种使君子配方颗粒特征图谱的构建及检测方法，确定了鞣花酸等六个共有峰，所构建的HPLC特征图谱中色谱峰实现较好分离，特征图谱信息丰富，色谱峰形好，可以全面的反应使君子配方颗粒的主要化学成分信息，检测方法具有良好的稳定性和重复性，便于大规模推广应用；
2)本发明构建的使君子配方颗粒的HPLC特征图谱，填补了现有技术使君子配方颗粒质量控制的空白，为之后使君子配方颗粒的研究提供了有效研究基础；
3)本发明基于高效液相色谱仪建立特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制使君子配方颗粒中的特征成分，能有效保证使君子配方颗粒的整体质量的稳定性，使使君子配方颗粒的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。
附图说明
图1为实施例3中提取方式考察结果色谱图；
图2为实施例3中提取溶剂考察结果色谱图；
图3为实施例3中提取时间考察结果色谱图；
图4为实施例3中物料比考察结果色谱图；
图5为实施例4的波长考察中鞣花酸对照品紫外吸收光谱图；
图6为实施例4的波长考察中使君子配方颗粒3D色谱图；
图7为实施例4的波长考察中使君子配方颗粒不同波长色谱图；
图8为实施例4中柱温考察结果色谱图；
图9为实施例4中流速考察结果色谱图；
图10为实施例5中使君子配方颗粒特征图谱色谱峰指认结果图；
图11为实施例5中三批使君子配方颗粒特征图谱验证图；
图12为实施例5中使君子配方颗粒对照特征图谱(其中，峰2(S)：鞣花酸)。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中，所涉及的仪器包括：
高效液相色谱仪：岛津LC-20AD型高效液相色谱仪，
色谱柱：Agilent 5TC-C18 250×4.6mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm、Phenomenex Luna5μm C18(2)100A 4.6×250mm，
电子天平：ME204E/02、MS205DΜ、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)，
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)，
超声波清洗器：KQ600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
在以下实施例中，所涉及的试剂包括：
流动相A中的甲醇(色谱纯)、磷酸(色谱纯)、水(超纯水)，其余试剂均为分析纯；
在以下实施例中，所涉及的供试品包括：
使君子配方颗粒批号：SJZ1、SJZ2、SJZ3；
在以下实施例中，所涉及的对照品包括：
鞣花酸(中国食品药品检定研究院，批号：111959-201602，含量以97.8％计)。
实施例1
一种使君子配方颗粒特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.对照品溶液的制备：取鞣花酸对照品，加质量分数为80％的甲醇溶解，制成每1mL含20μg的溶液，即得；
B.供试品溶液的制备：取本品，研细，称定1.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.建立：分别取所得对照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：360nm；
理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000；
流动相按梯度洗脱程序，具体如下表1：
表1梯度洗脱
实施例2
基于实施例1，本实施例提供一种使君子配方颗粒特征图谱的检测方法，包括如下步骤：
S1.取本品，研细，称定1.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2.检测：取经步骤S1所得供试品溶液10μL，注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与所得HPLC特征图谱进行比较，检测使君子配方颗粒的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：360nm；
理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000；
流动相按梯度洗脱程序为：
流动相按梯度洗脱程序，具体如下表2：
表2梯度洗脱
实施例3
基于实施例1-2，本实施例对供试品溶液制备中的提取方法、提取溶剂种类、提取时间、物料比进行考察，以本技术方案作进一步的说明。
一、提取方法考察
取供试品(批号SJZ1)两份，研细，均称定1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇10mL，再分别加热回流(常规工艺条件)30min、超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，所得结果如图1所示。
结果表明：在对供试品溶液进行超声提取和回流提取时，提取效果无较大差异，故，供试品溶液提取方法选择较简便的超声提取。
二、提取溶剂考察
取供试品(批号SJZ1)五份，研细，均称定1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇10mL、50％甲醇10mL、水10mL、乙醇10mL、50％乙醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，所得结果如图2所示。
结果表明：当提取溶剂为甲醇时，色谱峰信息量大，分离度好，故，本技术方案中供试品提取溶剂选择为甲醇。
三、提取时间考察
取供试品(批号SJZ1)三份，研细，均称定1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇10mL，称定重量，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)20min、30min、40min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，所得结果如图3所示。
结果表明：当提取时间为20min时，峰分离度等已较好，但为了保证溶液中目标成分能充分提取以及测定效率，故，供试品溶液的提取时间选择为30min。
四、物料比考察
取供试品(批号SJZ1)三份，研细，分别称定0.5g、1.0g、1.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇10mL，称定重量，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，所得结果如图4所示。
结果表明：在取样量为1.0g时，色谱峰高比例较适宜，故，将供试品取样量确定为1.0g。
综上所述，在供试品溶液制备中，将具体方案限定为：取本品，研细，取1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40KHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例4
基于实施例1-3，本实施例对构建中的色谱条件(波长、柱温、流速)进行考察，以对本技术方案作进一步的说明。
一、波长考察
利用二极管阵列检测器分别对鞣花酸对照品溶液、供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液在230nm、250nm、270nm、290nm、310nm、330nm、360nm波长下的色谱图，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图5-7所示。
结果表明：在检测波长为360nm时，色谱峰信息量较大，故，将检测波长确定为360nm。
二、柱温考察
将柱温分别设定为25℃、30℃、35℃，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如下表3及图8所示。
表3柱温考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明：柱温为25℃、30℃、35℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均符合要求，故，将柱温限定为30℃，方便进行后续考察。
三、流速考察
将流速分别设定为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如下表4及图9所示。
表4流速考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，流速分别为0.8mL/min、1.0mL/min时，各特征峰的相对保留时间色谱图峰形均对称，分离度均符合要求，故，将色谱条件流速确定为1.0mL/min。
实施例5
本实施例以使君子配方颗粒为供试品，提出一种使君子配方颗粒特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.对照品溶液的制备：取鞣花酸对照品，加质量分数为80％的甲醇溶解，制成每1mL含20μg的溶液，即得；
B.供试品溶液的制备：取本品，研细，称定1.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.建立：分别取所得对照物溶液和所得供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：360nm；
理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000；
流动相按梯度洗脱程序，具体如下表5：
表5梯度洗脱
此外，基于上述的使君子配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，本实施例还进行了如下的方法学考察，具体包括：
一、色谱峰指认
1、对照物溶液的制备：取鞣花酸对照品，加质量分数为80％的甲醇溶解，制成每1mL含20μg的溶液，即得；
2、供试品溶液的制备：取本品，研细，称定1.0g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
3、阴性对照溶液的制备：取甲醇10mL，置具塞锥形瓶中，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对使君子配方颗粒特征图谱峰进行指认，所得结果如图10，其中，峰2为鞣花酸，在后续的方法学考察中，对供试品图谱中的六个峰进行考察。
二、精密度试验
取使君子配方颗粒供试品溶液，按前述的使君子配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法连续进样六次，每次10μL，计算保留时间及峰面积，所得结果如下表6-7。
表6精密度考察-保留时间
表7精密度考察-峰面积
结果表明：各特征峰保留时间和峰面积的RSD为0.03～0.17％，各特征峰相对峰面积的RSD为0.06～1.31％，该仪器精密度良好。
三、重复性考察
取使君子配方颗粒供六份，按前述的使君子配方颗粒供的HPLC特征图谱的构建方法进行供试品溶液制备及测定，所得结果如下表8-9。
表8重复性考察-相对保留时间
表9重复性考察-相对峰面积
结果表明：各特征峰相对保留时间的RSD为0.05～0.25％，各特征峰相对峰面积的RSD为1.58～1.87％，表明该方法重复性良好。
四、中间精密度考察(不同人员和时间)
基于前述的使君子配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，分别在不同人员(A、B)和不同时间(T1、T2)条件下称取使君子配方颗粒各两份，制备供试品溶液，测定，所得结果如下表10-11。
表10人员和时间考察-相对保留时间
表11人员和时间考察-相对峰面积
结果表明：由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。
五、耐用性考察(色谱柱耐用性)
基于前述的使君子配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，分别对为PhenomenexLuna5μm C18(2)100A 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm、Agilent 5TC-C18250×4.6mm时三种色谱柱进行考察，所得结果如下表12-13所示。
表12色谱柱耐用性考察-相对保留时间
表13色谱柱耐用性考察-相对峰面积
结果表明：用上述三种色谱柱对使君子配方颗粒供试品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.10～1.32％，特征峰相对峰面积的RSD在1.48～3.65％。表明该方法色谱柱耐用性良好。
六、稳定性考察
基于前述的使君子配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，取同一使君子配方颗粒供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、18h、24h时测定，所得结果如下表14-15所示。
表14稳定性考察-保留时间
表15稳定性考察-峰面积
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.18～1.67％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述：各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好，并将上述六个特征峰纳入后续考察。
七、配方颗粒特征图谱验证
采用前述的使君子配方颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，对三批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，验证结果如下表16-17及图11所示。
表16三批使君子配方颗粒相对保留时间
表17三批使君子配方颗粒相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了六个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明：当峰2作为S峰时，三批使君子配方颗粒材特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。
因此，最终规定：供试品色谱中应呈现六个特征峰，其中与鞣花酸对照物相应的峰为S峰，计算各特征峰S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.56(峰1)、1.12(峰3)、1.21(峰4)、1.42(峰5)、1.63(峰6)。
此外，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对三批使君子配方颗粒进行合成，建立了使君子配方颗粒特征图谱的对照特征图谱，可以较为准确地整体控制使君子配方颗粒的质量，如图12所示(其中，峰2(S)：鞣花酸)。