一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法
阅读说明：本技术 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法 (Method for simultaneously detecting homocysteine and metabolic related substances thereof ) 是由 刘霞 王猛 米文珍 张继钢 孙海燕 孙翠霞 靳海娇 时瑞海 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。所述方法步骤包括：将血液样本经过前处理,在采用液相色谱-串联质谱法进行分析检测,最后采用内标法进行定量。该方法可以同时检测人血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质(甲硫氨酸、吡哆醇、叶酸和5-甲基四氢叶酸)的含量,并进行精确的定性和定量分析,是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。(The invention relates to a method for simultaneously detecting homocysteine and relevant metabolic substances thereof. The method comprises the following steps: the blood sample is pretreated, and is analyzed and detected by adopting a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method, and finally, an internal standard method is adopted for quantification. The method can simultaneously detect the content of homocysteine and relevant metabolic substances (methionine, pyridoxine, folic acid and 5-methyltetrahydrofolic acid) in human serum, and performs accurate qualitative and quantitative analysis, and is a detection method with simple sample processing, high flux and reliable result.)
技术领域
本发明属于氨基酸和维生素联合检测的技术领域，具体涉及一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。
背景技术
同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，主要来源于饮食摄取的甲硫氨酸代谢，是甲硫氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。甲硫氨酸是构成人体的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成。如果甲硫氨酸缺乏就会导致体内蛋白质合成受阻，造成机体损害。同型半胱氨酸在细胞内的代谢主要有两条代谢途径：一是甲硫氨酸的重甲基化，即同型半胱氨酸通过叶酸的循环重新合成甲硫氨酸；另一途径为转硫基途径。
人血液中同型半胱氨酸的正常含量一般为5～15μmol/L，当总同型半胱氨酸浓度超过15μmol/L，可导致高同型半胱氨酸血症的发生。引起高同型半胱氨酸血症的原因有多种，主要是由于不良的高甲硫氨酸饮食习惯，叶酸、维生素B12缺乏和肾功能不全等原因导致。多项研究显示高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化症和冠心病的一个独立危险因素，目前已证实其还与呼吸系统疾病、妊娠相关疾病、糖尿病、老年痴呆症、肝病、肿瘤、老年性骨质疏松等存在密切关系。
目前，常用的氨基酸或维生素检测方法主要包括酶联免疫分析法、化学免疫发光法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等。免疫法检测时所用的抗体，也可识别其它维生素衍生物，且抗体抗原反应通常不足100％，因此结果差异较大，特异性较差，应用于临床检测可靠性不高，尤其是对于检测含量较低的维生素。液相色谱法由于检出限有限，主要用于氨基酸和维生素含量较高的样品测定，一般只能进行单组份或含量较高的几个组分的同时测定。LC-MS/MS具有检测灵敏度高，准确性好，易于高通量，且一次可检测多种代谢相关物质等多种优点，所以LC-MS/MS在氨基酸和水溶性维生素检测方面整逐渐倍推广。目前的LC-MS/MS检测方法只能对同型半胱氨酸一种氨基酸，三种含硫氨基酸或单独几种水溶性维生素做定量分析。由于血浆/血清成分复杂，且水溶性维生素含量较低，在进行定量分析时，杂质严重影响检测结果的准确性。所以为了降低检测时的基质效应，检测者都是对不同的氨基酸和维生素逐个指标进行检测分析。这样存在以下的缺点：检测成本较高，而且操作复杂，耗费的时间较长，检测需要的血量较多。目前还没有一种能够同时检测血清/血浆中同型半胱氨酸、甲硫氨酸和水溶性维生素的有效方法。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本申请提供一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。该方法可以同时检测人血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质(甲硫氨酸、吡哆醇、叶酸和5-甲基四氢叶酸)的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法，所述方法步骤包括：将血液样本经过前处理，在采用液相色谱-串联质谱法进行分析检测，最后采用内标法进行定量。
进一步的，所述血液样本是血浆或血清。
进一步的，所述同型半胱氨酸及其代谢相关物质为：同型半胱氨酸Hcy、甲硫氨酸Met、甲基丙二酸MMA、吡哆醇PN、叶酸FA和5-甲基四氢叶酸5-MTHF。
进一步的，所述采用内标法进行定量的各分析物同位素内标为：同型半胱氨酸-D4、甲硫氨酸-13C5、甲基丙二酸-D3、吡哆醇-13C4、叶酸-13C5和5-甲基四氢叶酸-13C5。
进一步的，所述样本前处理操作为：取校准品和血清样本150μL，加入到2mL离心管中，加入20μL内标品溶液，再加入20μL还原剂溶液，涡旋孵育30min后，加入460μL甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡3min后，吸取500μL样本混合溶液，经过蛋白磷脂过滤板过滤后，滤液氮气吹干，然后用超纯水复溶。
进一步的，所述采用液相色谱-串联质谱法进行分析检测具体操作步骤为：
(1)标准工作液的配制：以水配制各分析物标准品储存液，然后用BSA-PBS溶液制备不同浓度的混合标准溶液，分装后-20℃保存备用；
(2)内标品溶液的配制：以水配制各分析物同位素内标储存液，然后再用超纯水稀释后混合得到混合同位素内标品溶液，分装后-20℃保存备用；
(3)液相色谱串联质谱法检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测；色谱条件：流动相A为含甲酸的水，流动相B为含甲酸的乙腈，梯度洗脱；质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。
进一步的，色谱条件具体为：色谱柱：T3 C18柱，柱温：40℃；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件：0～1min，99％A，1～1.5min，99％-30％A，1.5～2.5min，30％-5％A，2.5～3.5min，5％A，3.5～5.0min，99％A，流速0.4mL/min，进样量，10μL。
进一步的，质谱条件具体为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，毛细管电压：3.90kV，锥孔电压：45V，离子源温度：150℃，脱溶剂气流量：650L/Hr，脱溶剂气温度：200℃。
进一步的，所述还原剂为二硫苏糖醇。
进一步的，所述BSA-PBS溶液为1.0％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液。
有益效果：
本发明通过对样本前处理方法和液相色谱-串联质谱条件的优化，建立了一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。采用本发明可以同时检测人血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质(甲硫氨酸、吡哆醇、叶酸和5-甲基四氢叶酸)的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
本发明中使用的提取方法，可以较多的去除杂质，降低检测时的基质效应，且操作简单快捷，可以灵敏的检测出各分析物的含量，尤其是人体内含量较低的叶酸和吡哆醇。
本发明可以同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关共6种物质的含量，一是降低了检测成本，二是节省时间，三是减少采集被检测人的血量，四是可以辅助临床医生判断Hcy水平的高低，并辅助分析引起Hcy水平异常可能的原因，为维生素B6和叶酸的补充提供依据。
本发明用液相色谱-串联质谱法检测血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质，特异性强，灵敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。
本发明的方法针对每种分析物分别选择特定的母离子、子离子，以分析物的相对保留时间作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量，保证检测结果的准确性。
本发明首次实现了应用LC-MS技术对一份血清样本中Hcy及其5种代谢相关物质同时检测的目的，选择分析物特定的母离子、子离子保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响。该方法操作简便快速，分析时间仅6min，通量高、成本低，有效监测人体内同型半胱氨酸及其相关代谢物水平，对Hcy水平异常的可能原因进行辅助分析，对维生素B6和叶酸的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。
附图说明
图1为本发明实施例的总离子流图；
图2为本发明实施例的同型半胱氨酸及其内标的色谱图；
图3为本发明实施例的甲硫氨酸及其内标的色谱图；
图4为本发明实施例的的吡哆醇及其内标的色谱图；
图5为本发明实施例的甲基丙二酸及其内标的色谱图；
图6为本发明实施例的叶酸及其内标的色谱图；
图7为本发明实施例的5-甲基四氢叶酸及其内标的色谱图。
具体实施方式
实施例
一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法，步骤如下：
(1)样品处理：取血清样本120μL，加入到2mL离心管中，加入20μL内标品溶液，再加入20μL二硫苏糖醇溶液，涡旋孵育30min后，加入460μL甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡3min后，吸取500μL样本混合溶液，经过96孔蛋白磷脂过滤板过滤后，收集滤液，然后滤液氮气吹干，吹干后用超纯水复溶。通过该处理，有效的分离沉淀蛋白，去除杂质，减少离子干扰，降低基质效应，同时可以最大程度的保留分析物，避免其分解或氧化，从而检测出最真实的待测分析物含量。
(2)标准工作液的配制：用超纯水溶解Hcy、Met和MMA标准品,用0.1mol/L盐酸溶液溶解PN标准品，用0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解FA和5-MTHF标准品，得到各分析物标准品储存液。然后用含抗氧化剂的水溶液稀释制备6个梯度(Hcy：2、4、8、16、32、64μmol/L；Met：2、4、8、16、32、64μmol/L；MMA：2、4、8、16、32、64μmol/L；PN：8、16、32、64、128、256nmol/L；FA：8、16、32、64、128、256nmol/L；5-MTHF：8、16、32、64、128、256nmol/L)的混合标准溶液分装于2mL棕色瓶中，-70℃及以下温度保存备用；
(3)LC-MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后(梯度洗脱条件如表1所示)，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式(MRM质谱参数如表2所示)，对待测物质进行定量检测。
表1梯度洗脱条件
表2 MRM质谱参数
如图1至图7所示，应用标准品制作标准曲线，通过对各标准品中各分析物与相应内标峰面积的比值(y)进行计算，对校准品中的各分析物的标识浓度(x)与相应峰面积的比值(y)绘制标准曲线并拟合标准曲线方程，待测样品中各分析物的峰面积与相应内标峰面积的比值代入拟合的标准曲线方程，即可计算出样品中的各分析物的浓度。
通过具体实验，优化出通用的流动相和流速梯度，从而可以同时检测出同型半胱氨酸及5种代谢相关物质。另外，每种分析物选择特定的母离子、子离子、锥孔电压及碰撞能，从而提高各个分析物的信号强度，降低基质效应的影响，有利于检测各分析物含量，尤其是含量较低的水溶性维生素测定。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
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