具体实施方式

为使本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特根据本发明的较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下：

本发明所述的“克拉维酸(clavulanic acid)”，具有如图2所示的化学结构式，属于β-内酰胺类的分子(β-lactam molecular)，尽管克拉维酸作为抗生素的效果不佳，但是在合并青霉素类抗生素(penicillin-group antibiotics)时，可以克服分泌β-内酰胺酶(β-lactamase)的细菌的抗生素抗药性(antibiotic resistance)，否则将使大多数的青霉素失去活性。

本发明所述的克拉维酸可以投予一所需个体，以治疗该所需个体的癫痫发作(seizure)，及治疗与癫痫相关的运动障碍(motor symptom)与认知缺陷(cognitiveimpairment)，因而可以应用于制备抗癫痫药物，或应用于制备治疗与癫痫相关的运动障碍与认知缺陷的药物，克拉维酸可以与至少一医药学上可接受的载体组合形成一医药组合物，其中，克拉维酸可以制备成任何方便投予的形式，如锭剂、胶囊、粉剂、粒剂或液剂等。

本发明的克拉维酸能够以各种合适的投予途径投予该所需个体，举例而言，克拉维酸能够以口服(orally)或非经肠道(parenterally)的方式投予该所需个体，例如克拉维酸可以利用静脉注射(intravenous injection，简称IV injection)、肌肉注射(intramuscular injection，简称IM injection)、腹膜内注射(intraperitonealinjection，简称IP injection)、经皮吸收、舌下吸收或吸入性投予该所需个体。

另外地，本发明的克拉维酸能够以0.016～10毫克/千克/天的投予剂量投予该所需个体，较佳是以低于临床剂量的0.016～4.99毫克/千克/天的投予剂量投予该所需个体。克拉维酸能够连续性地(continuously)或间歇性地(intermittently)投予该所需个体。详而言之，每隔一预定时间 (predetermined time period)，将克拉维酸投予该所需个体一次，在该预定时间不大于24小时的状况下，即是将克拉维酸连续性地投予该所需个体，而在该预定时间大于24小时的状况下，则指将克拉维酸间歇性地投予该所需个体。但是，前述的投予剂量、投予频率应对应该所需个体及投予途径的不同而有所差异，在此不加以限制。

另外地，本发明的克拉维酸还可以与现有的抗癫痫药物(即，丙戊酸) 共同投予该所需个体，使克拉维酸与丙戊酸的药效(pharmacological effect)期间可以相互重叠，借此协同地(synergistically)治疗该所需个体的癫痫发作及治疗该所需个体的与癫痫相关的运动障碍与认知缺陷。详而言之，是指可以并行地(concurrently)将克拉维酸与丙戊酸投予该所需个体﹝即，同时将克拉维酸与丙戊酸投予该所需个体﹞；或者可以依序地(sequentially)将克拉维酸与丙戊酸投予该所需个体﹝即，将克拉维酸优先投予该所需个体后，在克拉维酸的药物血中浓度(plasma drug concentration)仍维持一有效治疗浓度(therapeutic drug concentration) 的状况下，即将丙戊酸投予该所需个体；例如，在克拉维酸投予该所需个体后的10分钟至8小时内，即将丙戊酸投予该所需个体﹞；或者可以依序地将丙戊酸与克拉维酸投予该所需个体﹝即，将丙戊酸优先投予该所需个体后，在丙戊酸的药物血中浓度仍维持该有效治疗浓度的状况下，即将克拉维酸投予该所需个体；例如，在丙戊酸投予该所需个体后的10分钟至8小时内，即将克拉维酸投予该所需个体﹞；又或者，更可以分开地(separately) 将克拉维酸与丙戊酸投予该所需个体﹝即，将克拉维酸投予该所需个体，并待克拉维酸的药物血中浓度低于该有效治疗浓度后，才将丙戊酸投予该所需个体；例如，在克拉维酸投予该所需个体后的8～12小时后，才将丙戊酸投予该所需个体﹞；或者，另外可以分开地将丙戊酸与克拉维酸投予该所需个体﹝即，将丙戊酸投予该所需个体，并待丙戊酸的药物血中浓度低于该有效治疗浓度后，才将克拉维酸投予该所需个体；例如，在丙戊酸投予该所需个体后的8～12小时后，才将克拉维酸投予该所需个体﹞。

另外地，在丙戊酸与本发明的克拉维酸共同投予该所需个体，以治疗该所需个体的癫痫发作，及治疗该所需个体的与癫痫相关的运动障碍与认知缺陷时，丙戊酸能够以口服或非经肠道的方式投予该所需个体，例如丙戊酸能够以静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、经皮吸收、舌下吸收或吸入性投予该所需个体，并以0.8～30毫克/千克/天的投予剂量投予该所需个体，较佳以低于临床剂量的0.8～19.99毫克/千克/天的投予剂量投予该所需个体。丙戊酸能够连续性地或间歇性地投予该所需个体。但是，前述的投予剂量、投予频率应对应该所需个体及投予途径的不同而有所差异，在此不加以限制。

此外，本发明的克拉维酸与丙戊酸更可以共同制作为一组合物，并通过投予剂型(dosage form)的调整，使克拉维酸与丙戊酸得以并行地、依序地或分开地投予该所需个体。举例而言，该组合物可以另外包含至少一医药学上可接受的载体，以通过该至少一医药学上可接受的载体，调整克拉维酸与丙戊酸在该所需个体体内的释放状况；例如可以利用微脂体(liposome) 包覆克拉维酸(或丙戊酸)，使克拉维酸(或丙戊酸)得以缓慢释放，借此达到依序地或分开地投予克拉维酸与丙戊酸的目的。

为证实通过本发明的克拉维酸的投予可以有效治疗该所需个体的癫痫发作，及可以有效治疗与癫痫相关的运动障碍与认知缺陷，以及证实本发明的克拉维酸与丙戊酸的共同投予对治疗癫痫发作，及对治疗与癫痫相关的运动障碍与认知缺陷具有加乘效果(synergistic effect)，遂进行以下试验：

(A)癫痫大鼠的诱发及试验设计

本试验是选用8周龄的雄性Wistar大鼠(购自中国台湾乐斯科生物科技股份有限公司)，其饲养于维持室温为21～24℃的动物室(光照时间与黑暗时间各为12小时)，且可以自由进食及饮水。

在试验开始的前3天，以滚轮仪试验(rotarod test)测试前述大鼠的运动功能，并且于第1～13天，以每2天一次的频率(即，于试验的第1、3、 5、7、9、11及13天时)，利用腹腔注射的方式将戊烯四唑 (pentylenetetrazol，简称PTZ，每次剂量为35mg/kg)投予前述大鼠，即获得癫痫大鼠。在第21天时，再次以腹腔注射的方式投予PTZ后，测量各组癫痫大鼠癫痫发作的强度。

接着，在试验的第7天起，每天以腹腔注射的方式，将如表1所示的克拉维酸及/或丙戊酸投予第A2～A5组癫痫大鼠，连续进行7天的治疗(即，在试验的第7～13天)，第A0组正常大鼠及第A1组癫痫大鼠则投予生理食盐水(1毫升/千克/天，腹膜内注射)。

表1、本试验各组大鼠的处理条件

另外地，在试验的第14天，以滚轮仪试验测试第A0～A5组待测试大鼠的运动功能，在试验的第15～17天，以物件辨识试验(object recognition test)测试第A0～A5组待测试大鼠的物件辨识能力的损伤状况，及在试验的第18～20天，以被动回避试验(passiveavoidance test)测试第A0～ A5组待测试大鼠的记忆能力的损伤状况。接着，在试验的第22天，以腹膜内注射(intraperitoneal injection)的方式，将5-溴-2’脱氧尿苷 (5’-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU)投予第A0～A5组待测试大鼠，进而标定新生的细胞(proliferating cell)，并在试验的第23天牺牲第A0～ A5组待测试大鼠，挑选具有海马回齿状回区域(dentate gyrus)的脑组织切片进BrdU染色，进而估算海马回内BrdU阳性细胞的数量。

(B)癫痫发作的强度

本试验在试验的第1、3、5、7、9、11、13及21天，以Racine分级(Racine score)评估第A0～A5组大鼠的癫痫发作的强度，其中共区分为6级：第1 级：口部及面部抽动(mouthand facial movement)；第2级：头部点头(head nodding)；第3级：肌跃型发作(myoclonicseizure)；第4级：前肢抽动 (forelimb clonus)且以后肢站立(stand on hindlimb)；第5级：肌肉僵直(muscular rigidity)及痉挛(spasm)；第6级：死亡。

请参照图3所示，第A0组正常大鼠维持为第0级(如图3〝○〞所示)，在投予克拉维酸及/或丙戊酸之前的第1、3、5、7天，第A1～A5组癫痫大鼠的癫痫发作的强度持续上升(如图3〝●〞所示)，而在第9、11、13天时，投予生理食盐水的第A1组癫痫大鼠及投予投予低剂量的克拉维酸的第A2组癫痫大鼠的癫痫发作的强度仍维持第3～4级(如图3〝◎〞、〝▲〞所示)，投予高剂量的克拉维酸的第A3组癫痫大鼠的癫痫发作的强度则有减缓(如图3〝▼〞所示)，显示投予高剂量的克拉维酸可以治疗该癫痫大鼠的癫痫发作；另外地，投予低剂量的丙戊酸的第A4组癫痫大鼠，由于丙戊酸的投予剂量不足，仍无法有效减缓癫痫发作的强度(如图3〝■〞所示)。另外，共同投予低剂量的克拉维酸与低剂量的丙戊酸的第A5组癫痫大鼠的癫痫发作的强度则有显著地减少(如图3〝★〞所示)，且其效果明显优于单独投予低剂量的克拉维酸(第A2组)及单独投予低剂量的丙戊酸(第A4组)的效果，显示克拉维酸与丙戊酸对治疗癫痫发作具有加乘效果。

此外，值得注意的是，在经过连续7天的治疗(即，在试验的第7～13 天)之后，纵使在第14～20天停止治疗，曾投予高剂量的克拉维酸的第A3 组癫痫大鼠，或曾共同投予低剂量的克拉维酸与低剂量的丙戊酸的第A5组癫痫大鼠的癫痫发作的强度(如图3〝▼〞、〝★〞所示)仍显著地低于曾投予生理食盐水的第A1组癫痫大鼠的癫痫发作的强度(如图3〝◎〞所示)。

(C)滚轮仪试验

接着以滚轮仪试验测试上述第A0～A5组大鼠的运动功能。详而言之，在试验开始的前3天的训练期(training session)中，以尚未以PTZ进行诱导大鼠(即，正常大鼠)作为待测试大鼠R，使该待测试大鼠R在如图4a 所示的滚轮W上走动(滚轮的转速自0rpm加速至25rpm，每次6分钟，中间休息5分钟，共进行3次的训练)。

在试验第14天，以第A0～A5组大鼠作为该待测试大鼠R，将待测试大鼠R分别放置于转速为25rpm的滚轮W上3分钟，若是该待测试大鼠R越快失去平衡而自该滚轮上掉落(如图4b所示)，则显示该待测试大鼠R的运动协调(coordination)、平衡能力(balance)的损伤状况越严重。

请参照图5所示，相较于第A0组的正常大鼠，投予生理食盐水的癫痫大鼠(第A1组)的持续运动时间明显较短(p＜0.01，与A0组相比)，但是，投予低剂量或高剂量的克拉维酸，则可以显著增加癫痫大鼠的持续运动时间 (第A2组，与第A0组相比无差异；第A3组，p＜0.05，与第A1组相比)。此外，投予低剂量的丙戊酸虽无法改善癫痫大鼠的运动协调与平衡能力的损伤(第A4组，p＜0.001，与A0组相比)，但是共同投予低剂量的克拉维酸与低剂量的丙戊酸则能够改善癫痫大鼠的运动协调与平衡能力的损伤(第A5 组，与第A0组相比无差异)。

(D)物件辨识试验

在试验的第15～17天，以物件辨识试验测试第A0～A5组大鼠R的物件辨识能力的损伤状况。详而言之，在暴露期(exposure session)时，将该待测试大鼠R置于如图6a所示的开放空间箱(open box)5分钟，其中在该开放空间箱的三个角落分别设有大小、颜色、形状及材质均相同，且无特殊气味的物件(object，以下简称旧物件O1、O2、O3)。

在试验的第17天，进入测试期(test session)，同样将该待测试大鼠 R置于如图6a所示的开放空间箱，并分别纪录第A0～A5组待测试大鼠R探索该旧物件O1的时间(T_O1)，以及探索该旧物件O1、O2及O3的总时间(T_O1+O2+O3)，计算待测试大鼠R对该旧物件O1的探索时间百分比((T_O1/T_O1+O2+O3)×100％)；继续在5分钟后，以与前述旧物件O1、O2、O3具有不同大小、颜色、形状及材质的新物件O4取代该旧物件O1(如图6b所示)，再次纪录将待测试大鼠R置于该开放空间箱时，第A0～A5组待测试大鼠R探索该新物件O4的时间(T_O4)，以及探索该旧物件O2、O3及该新物件O4的总时间(T_O2+O3+O4)，以计算该待测试大鼠R对该新物件O4的探索时间百分比((T_O4/T_O2+O3+O4)×100％)。

请参照图7所示，第A0组的正常大鼠对该新物件O4的探索时间百分比显著多于对该旧物件O1的探索时间百分比，显示正常大鼠可以辨识环境中的新物件O4(p＜0.001)；且依据投予生理食盐水的癫痫大鼠(第A1组)的试验结果，显示癫痫大鼠的辨识能力已发生损伤，因而无法分辨该新物件O4。另外地，投予低剂量或高剂量的克拉维酸的癫痫大鼠(第A2、A3组)均可以辨识环境中的新物件O4(第A2组，p＜0.01；第A3组，p＜0.05)，投予低剂量的丙戊酸无法改善癫痫大鼠的辨识能力的损伤状况(第A4组)。值得注意的是，共同投予低剂量的克拉维酸与低剂量的丙戊酸能够改善癫痫大鼠的辨识能力的损伤状况(第A5组，p＝0.008)，且其效果优于单独投予低剂量的克拉维酸(第A2组)或单独投予低剂量的丙戊酸(第A4组)的效果，显示合并投予克拉维酸与丙戊酸对治疗癫痫个体的物件辨识能力的损伤状况具有加乘效果。

(E)被动回避试验

在试验的第18～20天，以如图8a～8d所示的穿梭箱(shuttle box) 进行被动回避试验，以测试第A0～A5组大鼠的记忆能力的损伤状况。

该穿梭箱包括由一滑门D(guillotine door)分隔的一光亮容室C1 (lightchamber)及一黑暗容室C2(dark chamber)。首先在探索期(exploration session)中，如参照图8a所示，开启该滑门D，并将该待测试大鼠R置于该黑暗容室C2中，使该待测试大鼠R可以自由地于该光亮容室C1及该黑暗容室C2自由穿梭探索。

在学习期(learning session)中，关闭该滑门D，并如图8b所示，将该待测试大鼠R置于该光亮容室C1中；接着在30秒后，开启该滑门D，该待测试大鼠R会由于强烈的避光性(photophobism)而如图8c所示，立即进入该黑暗容室C2。此时，如图8d所示，立刻关闭该滑门D，并对进入该黑暗容室C2的待测试大鼠R进行电击S(foot shock)。

在24小时的等待期(retention session)之后，同样如图8b所示，将该待测试大鼠R置于该光亮容室C1中，再开启该滑门D，并记录该待测试大鼠R进入该黑暗容室C2的潜伏时间(latency)，若是潜伏时间越短，则显示该待测试大鼠R的记忆能力的损伤状况越严重。

请参照图9所示，相较于第A0组的正常大鼠，投予生理食盐水的癫痫大鼠(第A1组)具有明显较短的潜伏时间(p＜0.01，与第A0组相比)，投予低剂量的克拉维酸的癫痫大鼠(第A2组)其潜伏时间也较短(第A2组， p＜0.05，与第A0组相比)，投予低剂量的丙戊酸虽无法改善癫痫大鼠的记忆能力的损伤状况(第A4组，p＜0.05，与第A0组相比)，但是共同投予低剂量的克拉维酸与低剂量的丙戊酸的癫痫大鼠则可以改善癫痫大鼠的记忆能力的损伤状况(第A5组，p＜0.001，与第A1组相比；p＜0.01，与第A2、 A4组相比)，显示合并投予克拉维酸与丙戊酸对治疗癫痫个体的记忆能力的损伤状况具有加乘效果。

(F)组织病理学分析

在试验的第22天，以腹腔注射的方式利用5-溴-2’脱氧尿苷(bromodeoxyuridine，简称BrdU)标记新生的细胞，接着在试验的第23 天，将第A0～A5组待测试大鼠牺牲后，将大脑进行冠状切片(coronal section)，并挑选具有海马回齿状回区域(dentate gyrus)的组织切片进行5-溴-2’脱氧尿苷(BrdU)染色，进而估算海马回齿状回内新生的BrdU 阳性细胞的数量，结果如图10所示。

请参照图10所示，相较于第A0组的正常大鼠，投予生理食盐水的癫痫大鼠(第A1组)的BrdU阳性细胞的数量显著降低(p＜0.05，与第A0组相比)，显示神经细胞新生的功能出现缺损；而投予低剂量的丙戊酸(第A4组) 仍无法有效提升神经细胞新生的缺损现象(p＜0.05，与第A0组相比)。但是无论是投予低剂量或高剂量的克拉维酸的癫痫大鼠(第A2、A3组)，以及共同投予低剂量的克拉维酸与低剂量的丙戊酸(第A5组)均可以使BrdU阳性细胞的数量恢复到正常值(与第A0组相比无差异)。

此外，依据体表面积(body surface area，简称BSA)的剂量转换(dosetranslation)的公式(Reagan-Shaw et al.(2007),FASEB J.,22:659-661)，进一步换算前述投予剂量，可以得知：在共同投予克拉维酸与丙戊酸时，克拉维酸的投予剂量为0.016～10毫克/千克/天，且丙戊酸的投予剂量为0.8～30毫克/千克/天；较佳地，克拉维酸的投予剂量为低于临床剂量的 0.016～4.99毫克/千克/天，且丙戊酸的投予剂量为低于临床剂量的0.8～ 19.99毫克/千克/天。

综上所述，本发明的用以治疗癫痫的组合物，及用以治疗与癫痫相关的运动障碍、认知缺陷与神经损伤的组合物，可以通过克拉维酸与丙戊酸的协同作用，预防癫痫发作、减弱癫痫发作的强度，及促使海马回齿状回区域中的神经细胞得以新生，因此能够治疗癫痫，及治疗与癫痫相关的运动障碍与认知缺陷(例如，改善癫痫个体的运动协调与平衡能力的损伤状况，及改善癫痫个体的物件辨识能力的损伤状况及记忆能力的损伤状况)。

此外，通过与克拉维酸的共同投予，可以降低丙戊酸的投予剂量，使肝、肾等代谢器官快速、有效率地代谢分解丙戊酸，也可以防止丙戊酸过度累积于生物体内，减少丙戊酸所造成的神经、精神与行为干扰，并可以降低丙戊酸的过度投予对肝、肾等代谢器官造成的负担，达成减低副作用发生可能性的目的。

同时，相较于必须连续性地投药的现有抗癫痫药物，无论是在单独投予克拉维酸，或者是在共同投予克拉维酸与丙戊酸的状况下，纵使停止治疗，仍能够维持良好的抑制癫痫发作的效果，并且同样具有改善癫痫相关的运动障碍与认知缺陷的效果。

值得注意的是，药物的治疗方法的开发，最终都需要进入临床试验，在患者身上验证疗效，而在临床试验时，基于患者的安全与权益考量，无法贸然停止使用目前正在使用的药物，因此，在执行临床试验时，通常会将所欲探讨的新药与正在使用的药物进行合并使用(即，add-on study)，而本发明的包含克拉维酸与丙戊酸的组合物的用途则是已经证实克拉维酸与丙戊酸的合并使用的效果。