β-羟基丙酮酸在制备人胰岛淀粉样多肽聚集抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 β-羟基丙酮酸在制备人胰岛淀粉样多肽聚集抑制剂中的应用 (Application of beta-hydroxy pyruvic acid in preparing human islet amyloid polypeptide aggregation inhibitor ) 是由 郝海平 郑秋凌 夏丹丹 杨蕾 徐小为 于 2021-01-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种内源性代谢物β-羟基丙酮酸(HPA)在制备人胰岛淀粉样蛋白(IAPP)聚集抑制剂中的应用。本发明以内源性代谢物为目标,筛选出具有抑制IAPP纤维化潜力的差异代谢物HPA,经ThT法检测表明HPA通过作用于IAPP寡聚体形成阶段,显著延缓IAPP寡聚体生成速度,降低β折叠结构含量,达到抑制纤维化的作用。经TEM表征,与HPA作用后所形成的纤维形貌发生显著变化,无典型IAPP纤维生成,进一步表明HPA可有效抑制IAPP纤维化,对发现和设计抑制IAPP聚集及由其引起的生理毒性的药物具有非常重要的意义。(The invention discloses application of an endogenous metabolite beta-Hydroxy Pyruvic Acid (HPA) in preparation of an inhibitor for human islet amyloid protein (IAPP) aggregation. The invention takes endogenous metabolites as targets, screens out differential metabolites HPA with the potential of inhibiting IAPP fibrosis, and the ThT method detection shows that the HPA remarkably delays the generation speed of IAPP oligomer by acting on the formation stage of IAPP oligomer, reduces the beta-folding structure content and achieves the effect of inhibiting the fibrosis. The appearance of the fiber formed after the fiber is acted by HPA is obviously changed by TEM representation, no typical IAPP fiber is generated, further, the HPA can effectively inhibit IAPP fibrosis, and the method has very important significance for discovering and designing the medicines for inhibiting IAPP aggregation and physiological toxicity caused by the IAPP.)
技术领域
本发明属于生物医药技术，具体涉及β-羟基丙酮酸在制备人胰岛淀粉样多肽聚集抑制剂中的应用。
背景技术
人胰岛淀粉样多肽(IAPP，Human islet amyloid polypeptide)的聚集被认为与II型糖尿病(T2DM)的发生发展密切相关。研究表明，T2DM引起的代谢紊乱会导致IAPP的错误折叠和聚集，形成的纤维沉积会进一步导致胰岛β细胞功能紊乱，通过诱导细胞内的氧化应激，内质网应激和线粒体损伤而引起细胞毒性。因此，抑制IAPP的聚集对于预防和治疗T2DM具有重要意义。目前以延缓或预防IAPP聚集以及纤维生成为目的的治疗方法研究取得进展，包括淀粉样蛋白模拟肽段，淀粉样蛋白抗体和纳米颗粒等。此外，小分子抑制剂的开发引起了广泛的关注，已有许多在体外实验中被证实可有效抑制纤维形成并减少由蛋白聚集引起的细胞毒性。然而，当前可用的小分子抑制剂多来源于化学合成或从天然产物中提取，生物利用度和肠胃吸收率较低，限制了在生物体内的作用。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本申请以内源性代谢物为靶标，发现了内源性代谢物β-羟基丙酮酸具有抑制IAPP聚集和由聚集引起的细胞毒性，可用于制备人胰岛淀粉样多肽聚集抑制剂。
技术方案：本申请公开了β-羟基丙酮酸在制备人胰岛淀粉样多肽聚集抑制剂中的应用。
本申请公开了β-羟基丙酮酸在制备预防和治疗II型糖尿病的药物中的应用。
其中，所述β-羟基丙酮酸延缓或预防人胰岛淀粉样多肽聚集。
进一步的，所述β-羟基丙酮酸抑制人胰岛淀粉样多肽纤维化。具体的，所述β-羟基丙酮酸通过作用于人胰岛淀粉样多肽寡聚体形成阶段，延缓人胰岛淀粉样多肽寡聚体生成速度，降低β折叠结构含量，达到抑制纤维化。
本申请以内源性代谢物为目标，通过非靶向代谢组学分析，筛选得到内源性代谢物β-羟基丙酮酸(HPA，β-hydroxypyruvic acid)，结构如下所示：
本申请通过实验验证，β-羟基丙酮酸具有抑制IAPP聚集的作用，对发现和设计抑制IAPP聚集及由其引起的生理毒性的药物具有非常重要的意义。
本申请所使用的术语如下：
术语“HPA”是指：β-羟基丙酮酸，β-hydroxypyruvic acid。
术语“HFIP”是指：六氟异丙醇，1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol。
术语“ThT”是指：硫黄素T，Thioflavin T。
有益效果：本申请所述β-羟基丙酮酸HPA是内源性的小分子，有望克服其它小分子抑制剂生物利用度低，肠胃吸收率差等缺点；HPA是通过非靶向代谢组学的方法筛选出来的糖尿病差异代谢物，是丝氨酸代谢产物，可从代谢调控角度抑制IAPP的聚集，对深入理解IAPP与T2DM的发病机制间联系具有重要意义。
附图说明
图1为透射电子显微镜表征候选代谢物对IAPP聚集所形成纤维形貌的调控，其中，(A)为IAPP纤维的形貌；(B)为HPA与IAPP混合浓度比例为10:1时所形成纤维的形貌；(C)为3-甲基-L-组氨酸与IAPP混合浓度比例为10:1时所形成纤维的形貌(D)为3-羟基丁酸与IAPP混合浓度比例为10:1时所形成纤维的形貌；
图2为ThT染色后应用荧光分光光度法表征HPA对调控IAPP聚集动力学具有剂量依赖性示意。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
β-羟基丙酮酸HPA来源：
委托武汉迈特维尔生物科技有限公司基于ABSciex6500+LC-MS/MS检测平台对27份血清样本(8例二型糖尿病患者，10例肥胖患者，9例正常人)进行非靶向代谢组学分析。基于自建靶向标品数据库MWDB(metware database),根据检测物质的保留时间、子母离子对信息及二级谱数据进行定性分析。利用三重四级杆质谱的多反应监测模式获得样本中代谢物峰面积数据，得到代谢物在不同样本中的相对含量。使用正交偏最小二乘法对数据结果进行分析，筛选差异代谢物。筛选标准为：fold change≥2或≤0.5，在此基础上，选取VIP≥1的代谢物。获得差异代谢物后，利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)和HMDB(Human Metabolome Database)数据库对差异代谢物进行功能注释以及相关疾病分析，筛选出3个与淀粉样蛋白疾病相关代谢物，包括3-N-甲基-L-组氨酸，3-羟基丁酸以及本申请的HPA。再经TEM电镜表征后发现仅HPA对IAPP聚集有抑制作用，因此选择HPA进行后续验证。
实施例1
本实施例采用透射电子显微技术，用于表征候选代谢物对IAPP聚集生成纤维形貌的影响。
1.IAPP分散方法：称取4.74mg IAPP，量取2.456mL HFIP使其溶解,浓度为0.5mM，超声2分钟。
2.配制2.5×PBS(含50mM NaCl)溶液：称取0.2g KCl,1.1688g NaCl,0.22gKH2PO4,2.08g Na2HPO4·12H2O，量取250mL超纯水使其完全溶解。
3.配制HPA储备液：称取5mg HPA，加入600μL上述配置的2.5×PBS(含50mM NaCl)溶液，使其溶解，配制成80mM的HPA储备液。
4.配制3-甲基-L-组氨酸储备液：称取1mg 3-甲基-L-组氨酸，加入739μL上述配置的2.5×PBS(含50mM NaCl)溶液，使其溶解，配制成8mM的3-甲基-L-组氨酸储备液。
5.配制3-羟基丁酸储备液：量取8μL 3-羟基丁酸(1.126g/ml)，加入1080μL上述配置的2.5×PBS(含50mM NaCl)溶液，使其溶解，配制成80mM的3-羟基丁酸储备液。
6.量取10μL IAPP储备液，加入到990μL的2.5×PBS(50mM NaCl)中，配制成对照组溶液。室温孵育6小时后进行检测。
7.IAPP-HPA混合溶液配制方法：量取0.625μL HPA储备液，加入到989.35μL的2.5×PBS(50mM NaCl)中，与10μL IAPP储备液混合，配制成HPA：IAPP为10:1组。室温孵育6小时后进行检测。
8.IAPP-3-甲基-L-组氨酸混合溶液配制方法：量取6.25μL 3-甲基-L-组氨酸储备液，加入到983.75μL的2.5×PBS(50mM NaCl)中，与10μL IAPP储备液混合，配制成3-甲基-L-组氨酸：IAPP为10:1组。室温孵育6小时后进行检测。
9.IAPP-3-羟基丁酸混合溶液配制方法：量取0.625μL 3-羟基丁酸储备液，加入到989.35μL的2.5×PBS(50mM NaCl)中，与10μL IAPP储备液混合，配制成3-羟基丁酸：IAPP为10:1组。室温孵育6小时后进行检测。
10.电镜样品制备：取50μL待测试溶液滴加到超薄镀碳铜网表面，静置10分钟，将剩余液体吸走。在沉积样品的铜网表面滴20μL 1mg/mL磷钨酸铵水溶液，沉积5分钟，将剩余液体吸走。制备好的样品在干燥器中干燥30分钟。利用生物透射电子显微镜(HitachiHT7700，日本)成像。
TEM表征反应了IAPP聚集形成纤维的形貌特征。如图1A所示(标尺为500nm)，IAPP对照组经6小时孵育后，自身聚集形成典型的长直线型的淀粉样纤维。图1B所示，将HPA与IAPP混合孵育后，在视野范围内无典型IAPP纤维形成，形貌发生显著改变，证明所述小分子抑制剂能明显抑制IAPP的纤维化。相反，IAPP分别与3-甲基-L-组氨酸及3-羟基丁酸孵育后(图1C和D)，仍可观察到与图1A相似的典型长直线型淀粉样纤维生成，表明3-甲基-L-组氨酸及3-羟基丁酸对IAPP纤维化并无抑制作用。
实施例2
本实施例采用ThT染色后采用荧光分光光度法表征HPA对IAPP聚集能力的调控。
1.配制2.5×PBS(含50mM NaCl)溶液：称取0.2g KCl,1.1688g NaCl,0.22gKH2PO4,2.08g Na2HPO4·12H2O，量取250mL超纯水使其完全溶解。
2.配制ThT储备液：称取1.25mg ThT，量取1.960mL超纯水使其溶解。
3.HPA储备液方法：同实施例1所述。
4.IAPP分散方法：同实施例1所述。
5.量取上述制备的分散的IAPP储备液500μL，加入到49.5mL上述配置的2.5×PBS(含50mM NaCl)中，配制成对照组。
6.取16μL HPA储备液，加入到49.484mL的2.5×PBS(50mM NaCl)中，与500μL上述制备的分散的IAPP储备液混合，配制成HPA：IAPP为5:1组。
7.取32μL HPA储备液，加入到49.468mL的2.5×PBS(50mM NaCl)中，与500μL上述制备的分散的IAPP储备液混合，配制成HPA：IAPP为10:1组。
8.分别取1980μL上述各组待测溶液置于石英比色皿中，再加入20μL ThT储液，吹打均匀。在Perkin Elmer 6500荧光分光光度计中，以450nm作为激发波长，收集486nm处的发射光信号，每30分钟采集一次荧光值。
ThT染色实验基于溶液中β折叠结构含量与荧光强度间变化关系，可用于表征IAPP聚集动力学过程。结果如图2所示，对于IAPP对照组，其荧光值随时间呈“S”型曲线变化，符合典型纤维生长动力学特征。IAPP在溶液中发生β折叠结构转变，滞后期为3.85小时，表明单体IAPP向低聚物中间体转变。随后低聚物迅速形成，β折叠结构含量的积累导致荧光强度急剧上升，在8小时达到饱和且稳定，最大荧光值为31,000。当加入HPA后(比例为HPA:IAPP＝5:1)，滞后期延长为4.34小时，表明HPA的加入可延缓IAPP低聚物形成过程。同时，达到饱和后的最大荧光值降低至29,000，表明HPA的加入降低了β折叠结构的总量。当HPA与IAPP比例为10:1时，滞后期进一步延长至5.25小时，最大荧光值降至26,000。上述结果表明HPA可显著延缓IAPP寡聚体生成速度，降低β折叠结构含量，减少IAPP纤维生成，其抑制作用具有剂量依赖性。