具体实施方式

定义

本说明书中所用的术语在本发明的上下文内和在使用每一术语的特定上下文中通常具有其在所属领域中的一般意义。在说明书中下文或其它地方讨论用于描述本发明的某些术语以就本发明的描述为从业者提供附加指导。提供某些术语的同义词。一个或多个同义词的叙述并不排除其它同义词的使用。在本说明书中任何地方使用实例，包括本文中所论述的任何术语的实例，都只是说明性的，并且绝不限制本发明或任何所例示性术语的范围和含义。本发明不限于本说明书中给出的各个实施例。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。

术语“特加维因”是指其具有以下结构的化合物：

术语“BC2059”与“特加维因”互换使用。

术语“长期保存”或“长期稳定性”应理解为意指药物组合物可存储三个月或更长时间，六个月或更长时间，优选一年或更长时间。长期储存还应理解为意指药物组合物在2℃-8℃或在室温15℃-25℃下存储。

关于长期储存，术语“稳定(stable或stabilized)”应理解为意指在药物组合物中所含的活性成分其活性相对于储存开始时组合物的活性损失不超过20％，或更优选地15％，或甚至更优选地10％，并且最优选地5％。

术语“哺乳动物”包括但不限于人类。

术语“药学上可接受的载体”是指任何常规类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂助剂或赋形剂。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且与制剂的其它成分相容。

术语“治疗”是指对哺乳动物疾病的任何施用或应用，包括抑制疾病、遏制疾病发展、减轻疾病(例如，通过引起退化、恢复或修复丧失、丢失或有缺陷的功能)或刺激效率低的过程。术语包括获得期望的药理和/或生理效果，并涵盖哺乳动物的病理状况或病症的任何治疗。就完全或部分预防病症或其症状而言，所述效果可为预防性的，和/或就部分或完全治愈病症和/或可归因于病症的副作用而言可为治疗性的。它包括(1)预防可能在易患病症但尚未有症状的受试者中发生或复发病症，(2)抑制病症，如遏制其发展，(3)停止或终止病症或至少其有关的症状，使得宿主不再遭受病症或其症状的困扰，例如通过恢复或修复丧失，缺失或有缺陷的功能或刺激效率的过程而引起病症或其症状的消，或退(4)缓解、减轻或改善病症或与其有关的症状，其中改善在广义上是指至少降低参数的幅度，例如炎症、疼痛和/或肿瘤尺寸。

术语“治疗有效量”是指当向活体施用时对活体达到期望效果的量。举例来说，用于向活体施用的本发明的组合物的有效量为预防和/或治疗经由Wnt/β-连环蛋白通路介导的疾病中任一种的量。准确量将取决于治疗目的，并且将由所属领域中的普通技术人员使用已知技术确定。如所属领域中已知的，可能需要对全身递送与局部递送、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况的严重程度进行调节，并且可通过所属领域的技术人员用常规实验来确定。

术语“组合物”或“制剂”是指通常含有载体，如在所属领域中常规并且适合于出于治疗、诊断或防治的目的施用到受试者中的药学上可接受的载体或赋形剂的混合物。举例来说，用于口服施用的组合物可形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂、口服冲洗剂或粉末。术语“组合物”、“药物组合物”和“制剂”互换使用。

术语“纳米颗粒组合物”是指其中所有，或几乎所有的粒子小于1000nM的组合物。

本发明的组合物

在一个实施例中，本发明提供一种组合物，其包含：

a)式I化合物的粒子

式I

其中Ra为氢，R₇和R₈独立地选自H和SO₂NR₃R₄，其中R₇和R₈中的一个为氢，并且其中NR₁R₂和NR₃R₄独立地为在环中含有一个氮的6到15元杂环烷基，

或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体；和

b)表面活性剂；

其中当使用激光衍射测量时，所述粒子的有效D50小于或等于500nm，并且D90小于或等于1.0微米(μm)。

D50也被称为粒径分布的中值直径。它是指在累积分布中50％的粒子直径值。换句话说，当D50值小于或等于500nm时，这意味着50％的粒子的直径小于500nm。

D90是指在报告的粒径下粒子的百分比。换句话说，当D90值小于或等于1.0μm时，这意味着90％的粒子的直径小于1.0μm。

在一些实施例中，化合物的有效平均粒径为约4900nm、约4800nm、约4700nm、约4600nm、约4500nm、约4400nm、约4300mm、约4200nm、约4100nm、约4微米、约3900nm、约3800nm、约3700nm、约3600nm、约3500nm、约3400mm、约3300nm、约3200nm、约3100nm、约3微米、约2900mm、约2800nm、约2700nm、约2600nm、约2500nm、约2400nm、约2300nm、约2200nm、约2100nm、约2000nm、约1900nm、约1800nm、约1700nm、约1600nm、约1500nm、约1400nm、约1300nm、约1200nm、约1100nm、约1000nm、约900nm、约800nm、约700nm、约600nm、约500nm、约400nm，或约300nm。

另外，在一些实施例中，化合物的有效平均粒径小于900nm，更优选地小于500nm，并且甚至更优选地小于300nm。

在优选的实施例中，表面活性剂为泊洛沙姆表面活性剂。

在另一个优选的实施例中，泊洛沙姆表面活性剂为泊洛沙姆188。

在优选的实施例中，组合物还包含稳定剂。

在优选的实施例中，稳定剂选自由以下组成的组：糖、多元醇、聚山梨糖醇酯表面活性剂和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

在另一个优选的实施例中，糖选自由蔗糖和/或海藻糖组成的组。

在优选的实施例中，多元醇包含山梨糖醇和甘露糖醇。

在一个实施例中，在所提供的组合物中化合物的浓度在约1mg/ml和约100mg/ml之间，更优选地在约10mg/ml和约50mg/ml之间，更优选地在约10mg/ml和约25mg/ml之间，并且甚至更优选地约25mg/ml。

特加维因的特别优选的浓度为10-25mg/ml，最优选地25mg/ml；优选的表面活性剂为泊洛沙姆表面活性剂(优选地，泊洛沙姆188)，优选地浓度为0.625％；并且纳米悬浮液应优选地包括多元醇，并且更优选地山梨糖醇。

因此，最优选的制剂为包含25mg/ml的特加维因；0.625％泊洛沙姆188和10％山梨糖醇纳米悬浮液。

在一个实施例中，本发明的组合物通过研磨，优选地湿研磨制备。

在一个实施例中，本发明提供一种制备组合物的方法，其包含以下步骤(a)到(c)：

a)将式I化合物的粒子

其中R_A为氢，R₇和R₈独立地选自H和SO₂NR₃R₄，其中R₇和R₈中的一个为氢，并且其中NR₁R₂和NR₃R₄独立地为在环中含有一个氮的6到15元杂环烷基，

或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体；

与表面活性剂和可接受的载体混合，以产生悬浮液；

b)使用辊磨机或高能磨机研磨步骤(a)的悬浮液；和

c)将多元醇添加到步骤(b)的粒子。

在一个实施例中，可接受的载体为液体载体(例如水)。

在一个实施例中，悬浮液为水性悬浮液。

在另一个实施例中，制备组合物的方法包含以下步骤(a)到(b)：

a)将式I化合物的粒子

其中Ra为氢，R₇和R₈独立地选自H和SO₂NR₃R₄，其中R₇和R₈中的一个为氢，并且其中NR₁R₂和NR₃R₄独立地为在环中含有一个氮的6到15元杂环烷基，

或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体；

与表面活性剂、多元醇和可接受的载体混合，以产生悬浮液；和

b)使用辊磨机或高能磨机研磨步骤(a)的悬浮液。

在一个实施例中，可接受的载体为液体载体(例如水)。

在一个实施例中，悬浮液为水性悬浮液。

在另一个实施例中，本发明的组合物通过LyoCell技术制备。美国专利7,713,440描述LyoCell技术。美国专利7,713,440的内容以全文引用的方式并入本文。

在另一个实施例中，本发明的组合物可通过干研磨法制备，如在美国专利8,808,751中描述。美国专利8,808,751的内容以全文引用的方式并入本文。通过适当选择研磨介质和合适的碾磨化合物，有可能由常规药物物质粒子产生纳米颗粒组合物，并且防止在干式研磨设备中生成的小粒子附聚。

在又另一个实施例中，本发明的组合物可通过利用人血清白蛋白作为载体的方法制备，如在美国专利6,537,579中描述的方法。美国专利6,537,579的内容以全文引用的方式并入本文。此方法可特别适合于制备水溶性差的化合物的纳米颗粒组合物。由这类方法生成的组合物可以允许有效施用水溶性差的生物活性化合物。

在另一个实施例中，含有聚合物如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)的纳米颗粒组合物能够递送难溶性生物活性化合物。如在美国专利5,543,158中示出，这些组合物可被设计成长效媒剂。美国专利5,543,158的内容以全文引用的方式并入本文。

在另一个实施例中，本发明的组合物可被制备为聚合胶束，其已经成功改善生物活性化合物的溶解度。使用此技术的市售产品Genexol-PM并入抗癌药物紫杉醇，并且于2007年在韩国中获得批准。

在优选的实施例中，本发明的组合物表现出长期稳定性。

在一个实施例中，本发明的组合物为纳米颗粒组合物。

在优选的实施例中，在本发明的组合物中的式I化合物具有以下结构：

或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体。

此化合物也被称为特加维因。

本发明包涵包括特加维因和其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体的制剂。

在2到10的pH范围内测量特加维因在水中的溶解度，并且发现在整个范围内<0.25mcg/ml。

在有机溶剂中，特加维因的溶解度如下所示：DMSO(334μg/mL)，乙醇(260μg/mL)，甲醇(299μg/mL)，丙酮(1mcg/mL)，二氯甲烷:乙醇(1:4)(1mg/mL)。

在一个实施例中，本发明的组合物可被配制成：(a)选自由片剂和胶囊组成的组的剂型；(b)选自由以下组成的组的剂型：控制释放制剂、速溶制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂和混合的立即释放和控制释放制剂；(c)适合于吸入或肠胃外，包括肌内、皮下、静脉内和皮内注射施用的剂型；(d)(a)、(b)和(c)的任何组合。

本发明的组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或其组合。

在本发明的制剂中使用的药学上可接受的赋形剂可多于一种方式起作用。分散剂的作用例如主要是使各个颗粒保持分离，即使附聚最小化。然而，例如，此成分还可使制剂的表面张力改变，并且可用以降低粘度。

药学上可接受的赋形剂可为例如分散介质、分散乳化剂、分散增强剂，或其组合。

推进剂的实例包括但不限于HFA-134a(1,1,1,2-四氟乙烷)、HFA-227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)、其组合等。

分散介质可为例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、其组合等。

分散液乳化剂(增强剂)可为例如H₂O、油酸、月桂基硫酸钠、聚乙二醇1000、海藻酸铵、海藻酸钾、硬脂酸钙、单油酸甘油酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、乳化蜡、聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯40、聚山梨糖醇酯60、聚山梨糖醇酯80、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯、泊洛沙姆、其组合等。

分散液增强剂的实例包括但不限于聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯40、聚山梨糖醇酯60、聚山梨糖醇酯80、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、乙二醇硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、甲葡胺、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚烃氧35蓖麻油、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚烃氧甘油酯、吡咯烷酮、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、聚乙二醇1000、聚维酮、其组合等。

本发明的组合物可适合于所有施用途径，包括但不限于静脉内、肠胃外、口服、吸入(包括雾化递送)、口腔、鼻内、直肠、病灶内腹膜内、皮内、经皮、皮下、动脉内、心内、心室内、颅内、气管内、鞘内施用、肌内注射、玻璃体内注射和体表应用方法。

根据本发明的药物组合物还可包含一种或多种粘结剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂和其它赋形剂。这类赋形剂是所属领域中已知的。

填充剂的实例为单水合乳糖、无水乳糖和各种淀粉；粘结剂的实例为各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素，如PH101和PH102、微晶纤维素，和硅化的微晶纤维素(ProSolv SMCC^TM)。

合适的润滑剂，包括作用于待压缩的粉末的流动性的试剂，为胶态二氧化硅，如200、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙和硅胶。

甜味剂的实例为任何天然或人工甜味剂，如蔗糖、木糖醇、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜(aspartame)和安赛蜜(acsulfame)。调味剂的实例为(MAFCO的商标)、泡泡糖调味剂和水果调味剂等。

防腐剂的实例为山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸和其盐、对羟基苯甲酸的其它酯，如对羟基苯甲酸丁酯、醇，如乙醇或苯甲醇、酚类化合物，如苯酚，或季铵化合物，如苯扎氯铵。

合适的稀释剂包括药学上可接受的惰性填充剂，如微晶纤维素、乳糖、二碱磷酸钙、糖类和/或前述中任一项的混合物。稀释剂的实例包括微晶纤维素，如PH101和PH102；乳糖，如单水合乳糖、无水乳糖和DCL21；二碱磷酸钙，如甘露糖醇；淀粉；山梨糖醇；蔗糖；和葡萄糖。

合适的崩解剂包括轻度交联的聚乙烯吡咯烷酮、玉米淀粉、马铃薯淀粉、玉蜀黍淀粉和改性淀粉、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、羟基乙酸淀粉钠，和其混合物。

泡腾剂的实例为泡腾组合，如有机酸和碳酸盐或碳酸氢盐。合适的有机酸包括例如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、己二酸、琥珀酸和海藻酸以及酸酐和酸盐。合适的碳酸盐和碳酸氢盐包括例如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、甘氨酸碳酸钠、L-赖氨酸碳酸盐和精氨酸碳酸盐。替代地，可仅存在泡腾组合的碳酸氢钠组分。

在优选的实施例中，式I化合物具有以下结构：

或其药学上可接受的盐、酯、酰胺、立体异构体或几何异构体。

在另一个实施例中，本发明提供一种预防、治疗或减轻有需要的哺乳动物的癌症或肿瘤转移的方法，其包含向所述哺乳动物施用有效量的本发明的组合物。

在另一个实施例中，预防、治疗或减轻有需要的哺乳动物的癌症或肿瘤转移的方法可包括施用附加抗癌剂和/或癌症疗法(例如癌症疫苗、抗癌过继性细胞疗法和放射疗法)。

在一个实施例中，附加抗癌剂选自由以下组成的组：抗有丝分裂剂、抗代谢剂、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫治疗剂、FLT-3EGFR、MEK、PI3K和其它蛋白激酶抑制剂、LSD1抑制剂，和WNT通路抑制剂、烷化剂和DNA修复通路抑制剂、抗激素剂、抗癌抗体，和其它细胞毒性化学治疗剂。

在另一个实施例中，本发明提供一种治疗和/或预防有需要的哺乳动物的纤维化疾病的方法，其包含向所述哺乳动物施用有效量的本发明的纳米颗粒组合物。

在优选的实施例中，纤维化疾病选自由以下组成的组：肺纤维化、杜普伊特伦挛缩、硬皮病、全身性硬化症、硬皮病样病症、无皮肤硬化的硬皮病、肝硬化、间质肺纤维化、瘢痕瘤、慢性肾病、慢性移植排斥反应，和其它疤痕/伤口愈合异常、手术后粘连、反应性纤维化。

在下文的实例中将更具体地描述本发明，这些实例预期仅为说明性的，因为其中的许多修改和变化对所属领域技术人员而言将是显而易见的。在以下实例中应理解，各种成分的重量百分比表示为w/v百分比。

发明实例

获得起作用(即，稳定并且无毒性)的特加维因的制剂是非常具有挑战性并且困难的。

证明起作用的制剂为特加维因的纳米悬浮液，其中纳米悬浮液包含表面活性剂，并且其中当使用激光衍射测量时，特加维因的粒子的有效D50小于或等于500nm，并且D90小于或等于1.0微米(μm)。还已发现，特加维因的特别优选的浓度为10-25mg/ml，最优选地25mg/ml；优选的表面活性剂为泊洛沙姆表面活性剂(优选地，泊洛沙姆188)，优选地浓度为0.625％；并且纳米悬浮液应优选地包括多元醇，并且更优选地山梨糖醇。

实例部分首先描述多个配制特加维因的实验，其出于各种原因最终失败。然后，本部分描述研磨可行性实验，其展示，特加维因当用各种分散剂悬浮在水性溶液中时可辊磨。然而，即使当辊磨时，特加维因的多种制剂仍不成功。

最后，它描述成功的实验，其涉及所要求保护的特加维因的纳米悬浮液。

不成功的实验

实例1

特加维因的微乳液制剂具有极高毒性

开发特加维因的微乳液制剂，其中制剂含有20mg/ml BC2059、10％吐温(Tween)(聚山梨糖醇酯80)、30％乙醇、50％丙二醇(PG)和10％D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。

尽管观察到制剂具有良好的稳定性，但是制剂对啮齿动物具有极其高的毒性，因此不再进一步研究。

实例2

基于脂质体的制剂不稳定

基于初步研究，选择了两种BC2059脂质体制剂作为100ml放大和稳定性评估的先导。

第一种是脂质与药物比为15:1的100％ePC制剂。

另一种先导制剂包括脂质与药物比为10:1的80％:20％ePC:LysoPC脂质体。

证明这两种制剂在5℃下储存时均不稳定(观察到沉淀)。此外，制剂在冷冻时也不稳定。

实例3

口服和IV制剂不成功

最初选择含有大豆卵磷脂、PEG200、PEG400、PG和TPGS的特加维因口服制剂作为先导口服制剂。然而，此先导口服制剂在狗研究中示出差的生物利用度，并且因此未进行研究。

在进一步筛选时，选择基于IV的制剂为下一个先导。此IV制剂包含油相(植物油和聚山梨糖醇酯80(PS80)作为增溶剂)和大豆卵磷脂作为乳化剂。制剂具有以下成分(所有数字为重量％)：

BC2059：1％；PS80：10％；Miglyol 812：12％；大豆卵磷脂(LIPOID S-100)：12％；丙二醇(PG)：50％；去离子水：适量。

此制剂示出过滤到0.2微米的可能性，其中损失最小，并且具有良好的物理和化学稳定性。然而，由于在啮齿动物研究中的高毒性，不进一步进行研究此制剂。

包括特加维因的纳米悬浮液的实验

实例4

研磨可行性

首先，确定研磨在原则上是否可行。实验展示它为可行的。

研磨可行性通过辊磨以5％(50mg/mL)悬浮在水性溶液中的特加维因的实验室规模的批料开始，研磨选择其适用于静脉内施用的以下分散剂：

·聚山梨糖醇酯20(0.5％)

·泊洛沙姆188(0.5％)

·聚乙烯吡咯烷酮，K17(1％)

·聚乙烯吡咯烷酮，K17(1％)和脱氧胆酸钠(0.25％)

·卵磷脂(1％)

将5mL的测试悬浮液分别用约10mL直径为0.5mm的氧化钇稳定的氧化锆(YTZ)研磨介质研磨，并且定期取样以通过激光衍射进行粒径分布分析。在研磨十二小时之后，仅泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮悬浮液示出产生均匀纳米颗粒分散液，其中卵磷脂悬浮液示出没有明显的尺寸减小，聚山梨糖醇酯悬浮液表现出在研磨容器内测BC2059结块，而聚乙烯吡咯烷酮/脱氧胆酸钠悬浮液示出高纵横比晶体。使完成的测试悬浮液在不受控制的环境条件下放置四天，用于非正式的粒径稳定性。所有测试的悬浮液均示出一定程度的颗粒生长，其中粒子伸长率与在聚乙烯吡咯烷酮/脱氧胆酸钠悬浮液最初观察到的相似。

为了尝试防止晶体生长，使用泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为分散剂，并加入蔗糖、山梨糖醇和海藻糖(各自为10％)，以5％(50mg/mL)特加维因制备制剂。在与初始可行性实验类似的条件下进行研磨和储存。所有制剂研磨下降到纳米悬浮液，但是似乎没有添加剂对晶体生长的抑制有明显的作用。为了进一步的工作，选择泊洛沙姆188作为主要分散剂。

在泊洛沙姆188中将附加材料以5％(50mg/mL)研磨。为了便于规模的增长，泊洛沙姆的含量从1％增加到1.5％，以确保均匀的纳米悬浮液。将研磨的纳米悬浮液稀释以产生2％(20mg/mL)的BC2059/0.6％泊洛沙姆/0.9％氯化钠制剂，用于第三方进行的初始药代动力学工作。保留剩余的研磨的浓缩材料以测试冻干对防止表观晶体生长的有效性。

然后在实施例5中描述的实验中测试此制剂。

实例5

冻干可行性

此实验应确定在原则上冻干是否可行。示出在原则上特加维因可冻干。

用各种可能的含冷冻保护剂的稀释剂稀释5％(50mg/mL)的特加维因泊洛沙姆水性悬浮液，使得最终浓度为2％(20mg/mL)特加维因，0.6％泊洛沙姆和以下：

·蔗糖(10％)

·甘露糖醇(5％)

·蔗糖(5％)和甘露糖醇(2.5％)

·山梨糖醇(10％)

·山梨糖醇(5％)和甘露糖醇(2.5％)

·海藻糖(10％)

·海藻糖(5％)和甘露糖醇(2.5％)

用每种制备物将5mL血清小瓶填充到2mL，并且在-40℃和100毫托压力下冻干。将干燥的小瓶用净化水再悬浮，并且分析粒径分布。在测试的系统中，仅10％山梨糖醇和10％海藻糖再悬浮液返回与冻干前的悬浮液相当的粒径分布。研磨附加纳米悬浮液，将组分浓度提高到10％(100mg/mL)BC2059和3％泊洛沙姆，以提高研磨效率并便于较大批料制造。

由研磨的材料制备以下悬浮液，用于低温差示扫描量热法(DSC)分析：

·2％(20mg/mL)BC2059，具有0.6％聚山梨糖醇酯和10％山梨糖醇

·2％(20mg/mL)BC2059，具有0.6％聚山梨糖醇酯和10％海藻糖。

以1℃每分钟的速率从25℃到-40℃并且然后回到25℃执行DSC分析，得到悬浮液的以下玻璃化转变值：

·山梨糖醇悬浮液：-18℃

·海藻糖悬浮液：-33℃

将悬浮液冻干，用2mL填充5mL小瓶，在-30℃/150毫托下进行初步干燥，在-16℃/550毫托下进行二次干燥。对于在环境实验室条件下，非正式冻干样品示出物理稳定的，具有可重现的均匀大小分布。对于后续工作，选择山梨糖醇而不是海藻糖，因为前者玻璃化转变温度更高并且历史毒性数据利用度更高。

将测试批料研磨并且冻干，其中在-24℃/250毫托下初步干燥，并且在-16℃/500毫托下二次干燥，以提供用于动物研究的材料。研磨在20％(200mg/mL)特加维因下进行，其中泊洛沙姆含量为5％并且尝试以便于较大的批料大小和提高研磨效率。通过卡尔费舍尔(Karl Fischer)在约1％水下测量干燥的制剂，并且当用净化水重构24小时后时示出足够的粒径稳定性。

然后在实施例6中描述的实验中测试这些制剂。

实例6

非临床毒理学/药代动力学批料生产

此实验的目的为测试特加维因的冻干制剂。

依次制备的四个悬浮液亚批料，各自表示15g的特加维因，以增加的负荷研磨，并且使用11.43％山梨糖醇水性溶液的稀释剂从研磨介质提取，以提高产品产率并且产生2％(20mg/mL)特加维因/0.5％泊洛沙姆/10％山梨糖醇的悬浮液。

将亚批料以2mL填充到5mL的小瓶中，并且在先前优化的条件下冻干。尽管某些样品瓶显示出回熔迹象，可能是由于批料规模的增加，但是干燥的材料容易再悬浮成均匀的纳米悬浮液。小瓶的每个亚批料的中间测定PSD和水结果示出可接受的批料间一致性，因此将四组小瓶组合，并且处理为单个批料，用于稳定性和动物研究用途。参见下表1。

表1

在研磨期间，由于稳定的泡沫产生，这阻止进一步研磨并产生永久性粒子聚集，亚批料中的一个失败。将其丢弃并且制成另一个批料将其代替。在失败批料的生产中，使用250mL血清瓶替代介质瓶，以便于在研磨期间PSD采样。发泡归因于瓶子尺寸的不同，表面上允许夹带空气，导致批料失败。在所有批料的提取期间，从研磨介质分离深色不溶性颗粒。稍后通过XRPD分析此材料，并且发现特加维因的融合聚集体。

在一个月的稳定点上，复合批料表现出显著的粒径增加，这归因于泊洛沙姆的聚集，而不是API(药物物质)的成熟或晶体生长。试图确定一种适合实验室的路线，通过这种路线可挽救测试物品的使用。在不减少聚集体的情况下，将样品重构、重新密封并加热至50℃至多3小时。使用缓慢释放液体循环将再悬浮的小瓶在121℃下高压灭菌10分钟，并且使其冷却到环境条件，返回可接受的粒径分布。

因为这种处理不存在合适的前向路线，所以决定重新配制产品。

实例7

重新配制组合物并且冻干最终失败，但是含有泊洛沙姆的液体悬浮液似乎有前景

在此实验中，测试特加维因的附加重新配制的组合物。最终，冻干不起作用，但是液体悬浮液(纳米悬浮液)示出有前景的结果。

在一些最初测试的分散剂中制得可行性规模批料，但是使用增加的20％(200mg/mL)特加维因浓度，此改变可已制得可行的分散剂，其在5％(5mg/mL)下尚未示出前景。以下分散剂与5％泊洛沙姆188对照一起测试：

·聚山梨糖醇酯20(2％)

·聚乙烯吡咯烷酮(2％)

·聚乙烯吡咯烷酮(2％)和脱氧胆酸钠(1％)

·聚乙烯吡咯烷酮(2％)和聚山梨糖醇酯20(2％)

·聚乙烯醇，部分水解(5％)

在研磨12小时之后，聚山梨糖醇酯制备物示出比对照更快具有良好均匀性。聚乙烯吡咯烷酮制备物示出存在非结晶粒子，可能为聚乙烯吡咯烷酮的聚集体或残余物，其未显著影响粒径分布测量，但是通过光学显微镜可见。聚乙烯醇制备物未产生显著尺寸减小，可能由于分散剂的粘度。双组分聚乙烯吡咯烷酮制备物示出显著的聚集体，但是决定聚乙烯吡咯烷酮/脱氧胆酸钠制备物可证明适用于附加开发。

聚乙烯吡咯烷酮和聚山梨糖醇酯20制备物，以及改性的聚乙烯吡咯烷酮(1％)和脱氧胆酸钠(0.5％)悬浮液用于冻干开发实验，其涉及以下低温保护剂：

·山梨糖醇(10％)

·蔗糖(10％)

·海藻糖(10％)

·甘露糖醇(5％

·甘露糖醇(5％)

·山梨糖醇(5％)和甘露糖醇(2.5％)

·蔗糖(5％)和甘露糖醇(2.5％)

冻干在-36℃/100毫托和-15℃/500毫托下进行，并且经过-15℃退火步骤。在再悬浮时，仅10％蔗糖制备物得到合适的粒径恢复。虽然使用1％聚乙烯吡咯烷酮/0.5％脱氧胆酸钠制备物研磨附加悬浮液，但是包括柠檬酸盐缓冲液以将pH维持在约7.0。尽管研磨的悬浮液制备物在静置时可逆地胶凝，但将其与以下低温保护剂组合：

·蔗糖(15％)

·在25mg/mL BC2059下的蔗糖(10％)

·山梨糖醇(10％)

·乳糖(5％)

·蔗糖(5％)和山梨糖醇(5％)

相对于API，较高浓度的蔗糖示出提供最好的粒径保护，并且尽管制剂似乎容易发生回熔，但是在25℃/60％RH和40℃/75RH下执行的加速稳定性研究示出制剂在4周内具有良好物理稳定性。

然而，在稀释测试中，发现制剂在用于施用的盐水稀释剂中絮凝，并且聚乙烯吡咯烷酮/脱氧胆酸钠制剂的药代动力学释放显著地低于最初测试的泊洛沙姆制剂的药代动力学释放。

含有泊洛沙姆188的纳米悬浮液

将200mg/mL(20％)BC2059在泊洛沙姆188中研磨，并且提供给第三方用于冻干优化。将悬浮液与在下表2中列出的一系列低温保护剂组合，将其用于冻干实验。最初，2.5％葡聚糖/2.5％山梨糖醇制备物示出在重构时最有前景的粒径保持，然而，在40C/75％RH下一个月之后，仅有的保留纳米悬浮液的制备物为未干燥的对照。

因此，这些测试指示在评估的条件下冻干未起作用。此发现还指示，出人意料地，液体悬浮液比先前观察到的更稳定。初始的粒子伸长率被确定为一种立即且有限的现象，可能是由于分散剂的初始过饱和引起在停止研磨后出现少量再沉淀的结果。参见下表2。

表2

实例8

照射可行性

两种开发的制剂分散剂系统(聚乙烯吡咯烷酮/脱氧胆酸钠和泊洛沙姆)均用于确定通过照射终端灭菌的可行性。两种样品均准备用于照射可行性。两种制剂的样品均用于实验室动物的并行药代动力学(PK)研究，为此还提供含有泊洛沙姆188的稀释剂，所述稀释剂与聚乙烯吡咯烷酮/脱氧胆酸钠制剂一起使用，以确定药物的生物利用度是否与泊洛沙姆有关。PK研究的结果示出生物利用度出人意料地与泊洛沙姆含量相关。

传送两种制剂的冷冻小瓶进行照射。在15和25kGy下测试γ和e束照射。小瓶要在冷冻条件下处理，并且在5℃下为最差情形，模拟在照射期间可能的融化。降解与温度无关，但似乎与剂量相关，不管辐射的类型。

然而，由后续稳定性数据支持的初始粒径测试示出广泛的粒子聚集。基于先前成功的冷冻/融化测试，聚集归因于照射；然而，稍后对另一种悬浮液的冷冻/融化循环示出类似的聚集。

确定冷冻储存导致不可预测的聚集，而不是继续进行GLP批料的选择。将小瓶在照射之前已存储在-20C的冰箱中，并且在架子上不同位置的小瓶之间可能表现出不同的冷冻速率。

实例9

临床前生产

25mg/mL特加维因纳米悬浮液的生产是在最佳清洁条件下完成的，即，采取各种控制措施和预防措施以最小化微生物污染，但不保证无菌性。

使用用于注射的无菌水制得制备物，以不仅最小化微生物并且最小化热原污染。所有赋形剂为USP/NF级。所有产品接触用品通过高压釜灭菌，或如果不适合于加热，用70％异丙醇消毒。所有暴露的制备物使用无菌处置技术在ISO 5质量层流罩中执行。用于临床前批料的制造的API为在使用前在30kGy下γ-照射。

实例10

大鼠测试物品制备物

制备1,600克(标称)批料的特加维因悬浮液用于在大鼠毒理学研究中施用。

以200克批料的浓缩(200mg/mL)BC2059纳米悬浮液开始生产。将10g泊洛沙姆188溶解在250mL血清瓶中的150g水中。添加200克的YTZ研磨介质，并且将瓶子塞住并且密封。考虑到小批料量，可将整个组物和泊洛沙姆溶液制备物在121C下高压灭菌15分钟，以最小化生物负荷。添加40克照射的API(药物物质)，并且同样将瓶子塞住并且密封。将此制备物在辊磨机上辊压，使得级联介质的破裂角通过视觉确定为约45度。

由于因为夹带空气而使制剂失败的趋势，因此注意到，研磨介质的用量约为通常用于处理200克批料悬浮液的一半。所用的瓶子也比典型的瓶子小，以最小化顶空。允许在整个周末进行研磨，并经由皮下注射针穿过隔垫对悬浮液进行采样。

粒径分布的D90为0.23微米，并且经确定足以进行提取，这使用160克山梨糖醇于1240克水中的高压灭菌溶液和含有60微米烧结玻璃料的玻璃压力漏斗进行。混合提取的悬浮液，并使用设置为5.00mL的正排量移液管填充到高压灭菌的10mL玻璃小瓶中。填充、塞住并且密封295个小瓶，表示92％产率。将批料存储在5℃下直到使用。

纳米悬浮液呈现准备好向大鼠施用。

实例11

猪测试物品制备物

制备10,400克(标称)批料的特加维因悬浮液用于在猪毒理学研究中施用。以1,300克批料的浓缩(200mg/mL)BC2059纳米悬浮液开始生产。将65g泊洛沙姆188溶解在2000mL介质瓶中的975g水中。冲洗1000克的YTZ研磨介质，装袋用于灭菌。介质和溶液分别高压灭菌，并且在介质瓶中与260克灭菌的API组合。将此制备物在辊磨机上辊压，使得级联介质的破裂角通过视觉确定为约45度。允许研磨进行总共约三天，直到粒径分布的D90为0.33微米，并且经测定足以进行提取。将通过将520g山梨糖醇溶解在4030g水中制得的山梨糖醇溶液的两个等分试样高压灭菌，并用于提取研磨的悬浮液，这与对大鼠研究批料进行的处理类似。

提取困难，因为显然未研磨或较大粒径的API已堵塞60微米的过滤器玻璃料，因此必须去除介质并冲洗玻璃料。混合提取的悬浮液，并使用设置为10.0mL的正排量移液管填充到高压灭菌的10mL玻璃小瓶中。填充、塞住并且密封970个小瓶，表示93％产率。将批料存储在5℃下直到使用。

纳米悬浮液呈现准备好向猪施用。

实例12

高压灭菌对降解没有显著影响

与用于临床前研究的测试物品的生产一起，制备两个批料的特加维因悬浮液：一个批料用山梨糖醇制得，另一个不使用山梨糖醇制得。这些悬浮液在5℃、25℃/60％RH和40℃/75％RH下储存的稳定性评估指示，悬浮液在所有条件下都相当稳定。

使用液体循环，将来自猪研究批料的一部分小瓶在121℃下高压灭菌20分钟，并将制剂称为批料515-76和FID5910。

稳定性数据指示，高压灭菌对降解没有显著影响，但确实呈现增加粒径。

实例13

纳米悬浮液的工程研究

在临床制造的预测中，制备若干工程批料的特加维因的纳米悬浮液，并且必须对工艺进行某些改变以维持合规性并最小化损失和污染。部分出于安全原因，部分出于提取目的并入较大表面积的过滤器，将原来用于提取的玻璃压力漏斗替换为装配有55um不锈钢过滤器元件(颇尔(Pall))的不锈钢直列式过滤器外壳。

使用蠕动泵对先前使用氮气的提取设备进行加压，因为此泵也将被并入工艺中，从而不仅可无菌过滤稀释剂和分散剂，还可以对其进行高压灭菌。采用计量蠕动泵单元填充小瓶。考虑到高压灭菌增加制剂的粒径的趋势，因此将第一工程批料(RD4050-5)提交伽马照射。

稳定性结果示出最小降解和类似于先前批料的稳定性。

表3

特加维因25mg/mL工程批次

基于初步的颗粒测试，处理后的制剂含有一些较大的颗粒，这些颗粒未呈现足够多以显著影响激光衍射粒径测量，但足以显著影响USP<788>测试。为了减少颗粒，提出了一种“抛光”过滤器，其孔隙率小到足以保留较大的颗粒，但又不小到足以影响特加维因测定的程度。然而，先前过滤悬浮液的尝试导致显著的测定损失。因此，颇尔公司(PallCorporation)签约评估了其某些膜对特加维因纳米悬浮液过滤的适用性。

使用可从颇尔得到的各种47mm膜过滤非最佳清洁悬浮液的一部分，并使用压力反馈泵送系统确定在过滤器堵塞和故障之前可处理多少材料。使用以下膜类型，并且测试滤液的PSD和测定：

表4

选择6微米的HDCII膜作为最佳候选，因为它对纳米悬浮液的测定值或粒径分布均未示出明显的影响。然而，颇尔过滤器的相对较长的交货时间是及时生产临床材料的限制因素。因此，寻求一种替代方法，Sartorius 8微米聚丙烯过滤器用于制造两个工程批料，用于确定灭菌验证目的生物负荷。

不利的是，两个批料的测定值受到过滤的负面影响(分别为80.9％LC和91.9％LC)。由于它们不能代表最终的临床批料特性，因此丢弃批料，并使用颇尔HDC膜过滤器处理另一个工程批料。此批料测定在90％到110％LC内，并且在填充小瓶之前将颇尔HDC过滤器并入制造过程的最后一步。

实例14

特加维因对雌性史泊格-多利(Sprague-Dawley)大鼠缓慢静脉内推注施用后的药 代动力学研究

这项研究的目的是研究对雌性史泊格-多利大鼠进行单次静脉内缓慢推注施用特加维因后的特加维因的药代动力学。

使用平行设计(n＝4/组)和连续采样执行研究，如在表5中概括：

表5

来源 研究中使用的史泊格-多利大鼠是从印度班加罗尔Advinus TherapeuticsLtd.的室内动物资源机构获得的。在给药当天，这些动物约10-11周龄。

识别 每只动物都用笼卡上指示的唯一识别号和动物身上的姜黄溶液标记进行识别。笼子卡通过研究号、识别号，种类和品系、剂量和性别识别每个笼子。

住房和环境 在给药前3天，使大鼠适应研究区域的条件。将动物圈养在聚丙烯笼中(每笼一只)，并维持在受控环境条件下，其中光照12小时和黑暗12小时循环。房间的温度和湿度分别保持在22±3℃和40％-70％之间。每小时对房间进行10-15次新鲜空气更换循环。

食物和水 随意提供标准颗粒食品(Teklad认证的(2014C)全球14％蛋白啮齿动物饮食-啮齿动物团块食品，由荷兰AN Venray，Maasheseweg 87c PO Box 553,5800的HarlanLaboratories公司生产。

剂量制备和施用 提供储备制剂(25mg/mL)。准确地将600μL剂量制剂(储备，25mg/mL)转移到标记的玻璃容器中。向其中添加2.4mL的5％葡萄糖溶液，涡旋混合并超声处理以获得强度为5mg/mL的均质悬浮液。在喂养条件下给动物给药。使用1mL BD注射器，在23G钝针的引导下，以2mL/kg的剂量体积，通过缓慢静脉内推注(在1.5分钟内)颈静脉导管向大鼠施用单次剂量的10mg/kg的特加维因。在给药之前和之后称重用于给药的注射器，以便计算实际施用剂量。

样品采集和处理 在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24h采集血液样品。在每个时间点，从插管大鼠的颈静脉中抽出大约0.25mL血液，并将其转移到含有200mMK2EDTA(每mL血液20μL)的标记微量离心管中。在采样后，将等体积的肝素化盐水置换到导管中。收集后立即将血样品始终保持在湿冰上，并通过在4±2℃下以5000g离心5分钟分离血浆。血浆样品在计划的时间内分离1h，并保存在低于-60℃下直到生物分析。

生物分析 使用适合目的的LC-MS/MS方法执行生物分析，用于定量测定大鼠血浆样品中的BC2059。方法的校准曲线(CC)由至少包含6种非零校准标准品以及空白和具有内标样品的空白组成，其中定量下限(LLOQ)为0.050μg/mL。分析研究样品以及三组质量对照样品(9QC样品；低，中和高QC样品重复三次)。

药代动力学数据分析使用经验证的软件(6.3版)的非隔室分析工具(血管外)计算特加维因的药代动力学参数。浓度时间曲线下的面积(AUCIast和AUCinf)通过线性梯形法则计算。在静脉内推注剂量施用后，通过对前两个浓度值进行反向外推来估计CO(在零时的反向外推浓度)。总血浆清除率(CL)和稳态下的分布体积(Vss)为估计值。消除速率常数(k)通过浓度-时间曲线的对数线性终端相的线性回归来计算的，在终端相中使用了至少3个递减的浓度，相关系数>0.8。使用公式0.693/k计算终端半衰期值(T1/2)。计算并报告β半衰期。

实验结果

在向大鼠单次缓慢静脉内推注施用特加维因(剂量：10mg/kg)后，估计平均血浆清除率(CL)为9.92mL/min/kg，这比正常大鼠肝脏血液流动55mL/min/kg低约5.5倍。发现稳态时的平均血浆分布体积(Vss)比的正常身体水0.7L/kg几乎高9.34倍，这可能表明其广泛分布于组织隔室中。半对数血浆浓度-时间图表明BC2059表现出双指数消除模式，其快速分布半衰期(T1/2α)为0.546h，长终端血浆半衰期(T1/2β)为13.8小时。

表6

BC2059的PK特性

选择α相的回归点0.5、1和2h以及终端β相的回归点6、8、12和24h来计算消除速率常数。

实例15

特加维因在雄性比格犬(Beagle Dogs)中的剂量递增静脉内输注研究

研究动物：Xenometrics于2017年4月20日发布四只雄性非幼稚比格犬用于研究使用。在整个研究期间，动物随意喂养Harlan 全球25％蛋白认证的狗饮食2025C(除在当它处于时一生过程期间短暂时间段外

给药：动物经由静脉内(IV)输注(经由颈静脉)给药4小时(h)[±5分钟(min)]。

表7

研究给药概述

药代动力学(PK)血液采集：

在开始输注之前最后一个给药日(剂量6；15mg/kg)和在开始输注之后4、12、24、36、48和72h采集血液样品。在目标时间的10分钟内采集所有血液样品，并按照操作规程处理。生物分析结果指示特加维因存在于所有血浆样品中。

表8

在15mg/kg 4h IV输注后在比格犬中计算的血浆BC-2059值(ng/mL)

在最终15mg/kg的输注药物后4小时内，确定BC-2059的药代动力学参数。在上表8中展示平均值。数据指示半衰期为53.0h，并且总AUC0-120h为73480ng*h/mL。

表9

BC-2059的平均PK参数

n＝4雄性

实例16

特加维因制剂的喷雾递送

此实验的目的是测试纳米悬浮液的喷雾递送。此实验展示喷雾递送为成功的。

使用浓度为25mg/mL的悬浮在泊洛沙姆188/山梨糖醇中的特加维因粒子。

通过全身暴露的方法，将这些制剂以气雾剂的形式向小鼠施加。将小鼠放置在塑料盒内。此盒子是密封的，并且其一侧与喷雾器装置的出口连接，并且另一侧与封闭水系统连接。整个过程在动物房的通风橱内进行。

对于第一个实验，使用SATER LABS的喷雾器套件。此装置使用喷气系统。对于每组5只小鼠，用5ml的药物(即125mg特加维因(BC2059))灌注装置，并且然后将装置连接到电源进行喷雾。能量由型号为646的DeVilbiss压缩机提供，允许5-7磅的压力，和每分钟6-8升的流量。对于第二个实验，使用的装置是Altera超声喷雾器。

对于这两个实验，每组使用10只雄性bcat-Ex3小鼠。将这些小鼠分成2组，每组5只小鼠。第一组连续5天每天接收药物。第二组仅接收一次药物(第五天)。在第5天，处死所有小鼠，收获肺，并将样品存储在-30度下，在两个标记的尼龙袋中，每个含有来自每组的5个样品。

结果：

表10

“气雾剂”是指标准品气雾剂喷气喷雾器(Safer Labs)；

“喷雾器”是指喷雾器超声eRapid机器(Altera)

“1第天”是指在第5天单次剂量；

“5天”是指在第1-5天5次每日剂量。

实例17

用特加维因的液体制剂和特加维因的纳米悬浮液进行猪研究

猪对液体悬浮液的耐受性差

在一系列药代动力学研究中，将特加维因静脉内注射到小型猪，以从全身暴露和对药物产品制剂的耐受性方面确定适合于GLP毒理学研究的制剂。这些研究都是在辛克莱研究公司(Sinclair Research)(密苏里州奥克斯瓦斯(Auxvasse,MO))进行的。

在第一个研究中，药物在由吐温80、乙醇、聚乙二醇(PEG)和维生素E TGPS(d-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)组成的制剂中获得。将此储备制剂在20％(磷脂稳定的大豆油)中稀释到最终剂量浓度。两只猪在6小时内施用1.7mg/kg，两只猪在24小时内施用2.2mg/kg。制剂提供良好的全身暴露。

相对于24h的持续时间，比较较短的6h持续时间的剂量标准化值导致在输注结束时出现较高的峰值浓度(Cmax/剂量)，因为总剂量是在较短的持续时间内给出。然而，两次输注持续时间之间的总体全身暴露时间(AUCs/剂量)类似，这意味着在更长的输注时间下，有可能获得类似的总体全身暴露，同时避免更高的血浆峰值浓度。

然而，尽管用此制剂观察到良好的全身暴露，但观察到明显的输注反应，并且在6h或24h的输注期间，小型猪不耐受此制剂。假设吐温/乙醇/PEG/维生素E/基于脂内溶剂的赋形剂和可能的药物沉淀是造成输注反应的原因，而不是特加维因本身。实际上，无论是纳米颗粒形式还是溶解在DMSO中，特加维因都不会引起红细胞的溶血。

特加维因的冻干纳米悬浮液耐受性更好，但由于稳定性问题最终被放弃

在后续研究中，将特加维因研磨到纳米粒子大小，并使用非溶剂制剂。在本研究中，研究B01-109，获得冻干形式的特加维因，并且将其在重构中，以提供由特加维因10mg/mL、2.5mg/mL泊洛沙姆188和5mg/mL山梨糖醇的悬浮液组成的储备制剂。将此储备溶液用生理盐水稀释到静脉内施用的最终所需浓度。在4小时的输注内，两只猪以2.9mg/kg输注，2只猪以12.3mg/kg输注。在12.1mg/kg剂量组中的一只猪具有非常高的全身暴露。尽管有这头猪，但剂量标准化的AUC和就较轻微程度来说的Cmax在相同持续时间内给定的2.8到12.1mg/kg剂量内呈线性。除在12.1mg/kg剂量组中的一只猪之外，与在研究B01-107中使用的吐温/乙醇/PEG/维生素E/基于脂质内溶剂的制剂相比，此冻干形式的纳米研磨特加维因的标准化暴露较少。

尽管如此，因为此制剂被小型猪很好地耐受，没有在研究B01-107中观察到的输注反应，因此对于将来的工作，放大冻干方法。然而，在放大方法中，我们不能够获得具有足够稳定性的冻干产品，因此需要特加维因的替代冻干制剂。

在研究TXPK-006-2059-24h中，使用研磨的特加维因的冻干制剂。将使用的冻干制剂在水中重构到BC2059的最终浓度为25mg/mL、0.125％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.0625％脱氧胆酸钠(NaDOC)和10％蔗糖。将此大批溶液在生理盐水中稀释到所需浓度，以便在24小时h输注内以12.3或49.2mg/kg向每个处理组的两只猪给药施用。在注射器中观察到测试物品絮凝，并且在整个24h输注时间段中搅动注射器。尽管如此，与研究B01-107和B01-109相比，全身暴露极其低。后续制剂工作示出，具有此冻干制剂的盐水导致测试物品聚集，并且不可使用离子(盐)稀释剂。

特加维因的冷冻液体纳米悬浮液起作用

在这一点上，放弃冻干，并且研究研磨的特加维因的冷冻液体制剂。在研究TXPK-001-2059-猪24h PK中，将三只小型猪分配到三组中一个，每组一个，其中在24h内施用制剂。Particle Sciences提供两种冷冻研磨的悬浮液。BC2059-1为25mg/mL BC2059、0.125％PVP、0.0625％NaDOC、10％蔗糖悬浮液(批料号515-10)，并且BC2059-2为25mg/mL BC2059、0.625％泊洛沙姆188、10％山梨糖醇悬浮液(批料号515-13)。这两种制剂的稀释剂均为D5W。第三组为具有泊洛沙姆188/盐水稀释剂的BC2059 PVP/NaDOC/蔗糖冷冻制剂BC2059-1，以研究泊洛沙姆188在全身暴露中可能的作用。

在这3种冷冻测试物品制剂中，用D5W稀释的25mg/mL特加维因、0.625％泊洛沙姆188、10％山梨糖醇纳米悬浮液示出最高的全身暴露。此制剂的剂量标准化AUC稍微小于在研究B01-107中24h输注中观察到的剂量标准化暴露，但不是显著因此。剂量标准化暴露显著高于在研究B01-109中4只猪中的3只中观察到的，指示在所述研究中的盐水稀释剂可能对BC2059冻干泊洛沙姆188制剂的全身暴露产生影响，尽管程度比用特加维因的PVP/NaDOC制剂观察到的要小得多。

表11

在小型猪中BC2059的单次剂量药代动力学

^a20 mg/mL BC2059于30％乙醇、50％PG、10％吐温80和10％D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(批次P492-01)中；报告2只小型猪的值

^b10 mg/mL BC2059、2.5mg/mL泊洛沙姆188和5mg/mL山梨糖醇(批次号BET 1213-001-29)；报告2只小型猪的值

^c25 mg/mL BC2059、0.125％PVP、0.0625％NaDOC和10％蔗糖(批次号BET 1213-001-49)；报告2只小型猪的值

^d25 mg/mL BC2059、0.125％PVP、0.0625％NaDOC、10％蔗糖纳米悬浮液(批次515-10)稀释到在葡萄糖5％中的2mg/mL最终浓度；单只小型猪

^e25 mg/mL BC2059、0.625％泊洛沙姆188、10％山梨糖醇纳米悬浮液(批次515-13)稀释到在葡萄糖5％中的2mg/mL最终浓度；单只小型猪

^f25 mg/mL BC2059、0.125％ PVP、0.0625％ NaDOC、10％蔗糖，纳米悬浮液(批次515-10)稀释到在泊洛沙姆188/盐水中的2mg/mL最终浓度，0.05％泊洛沙姆的最终浓度；单只小型猪

基于在小型猪中这些单次剂量输注研究的结果，选择重复2剂量毒理学研究的制剂是25mg/mL BC2059的冷冻制剂，其具有0.625％的泊洛沙姆188、10％山梨糖醇(纳米悬浮液)并用D5W稀释。

在进行2-剂量非GLP研究以支持IND授权的GLP毒理学研究的剂量选择期间，我们习得放大方法和Particle Sciences批料号515-33的生产，其冷冻制剂导致特加维因在小瓶中聚集。

鉴于在冷冻下的此聚集，我们随后决定采取保持在2℃-4℃下在0.625％poloxamer 188和10％山梨糖醇制剂中25mg/mL纳米研磨的BC2059。在多个批次中的研磨BC2059悬浮液中均未观察到聚集，条件是不冷冻制剂。在2℃-4℃下冷冻的泊洛沙姆/山梨糖醇制剂用于IND授权的GLP毒理学研究和非GLP米格鲁犬研究。

实例18

喷雾的特加维因在特发性肺纤维化小鼠模型中的功效

此实验的目的是研究在博来霉素诱导的特发性肺纤维化(IPF)小鼠模型中的特加维因纳米悬浮液。测试物品如下：

在0.625％泊洛沙姆188和10％山梨糖醇中的在纳米研磨的悬浮液中特加维因(BC2059)25mg/mL。测试物品在约4℃下冷冻。

喷雾设备为Altera超声eRapid机器喷雾器(型号678G1002)。

动物为8-12周龄C57BL/6雄性小鼠(缅因州巴尔港杰克逊实验室(Jackson Lab,Bar Harbor,ME))。

实验程序

表12

通过气管内(IT)注射博来霉素(伊利诺斯州绍姆堡(Schaumburg,IL)APPPharmaceuticals)诱导小鼠肺纤维化模型。在第0天向每只动物施用一次剂量的0.025U溶解在50微升盐水0.9％中博来霉素，或以PBS作为对照。

通过全身暴露的方法，将特加维因纳米悬浮液以气雾剂的形式向第3组施加。将小鼠放置在塑料盒内。此盒子是密封的，并且其一侧与喷雾器装置的出口连接，并且另一侧与封闭水系统连接。整个过程在动物房的通风橱内进行。在每个治疗会话中，在15min内将5ml的25mg/ml特加维因(125mg)喷雾到室内的每组4-5只小鼠。为了增加小鼠对气雾剂的暴露，用注射器收集在气雾剂室中沉淀的特加维因，并对其进行了第二次和第三次重新喷雾。在博来霉素施用后第5天和第21天之间每天两次对小鼠进行喷雾。第1组和第2组以相同方式接收5ml喷雾媒剂。

在第0、5、8、12、16、19和21天记录动物的体重。

如前所述(Morales-Nebreda L等人《美国呼吸细胞和分子生物学杂志(AJRCMB)》2015)，在第21天使用FlexiVent小鼠呼吸机(加拿大魁北克省蒙特利尔(Montreal,PQ,Canada)Scireq)根据Scireq建立的协议在第21天执行肺力学测量。在强制振荡和准静态压力-体积曲线协议之前，通过三项总肺容量操作获得每只小鼠的标准通气史，这些协议用于计算气道阻力、动态和准静态组织顺应性以及弹性。

在第21天，处死所有动物并收获肺。使用如先前描述的羟基脯氨酸测定(Morales-Nebreda L等人《美国呼吸细胞和分子生物学杂志》2015)评估总肺胶原蛋白含量。简单来说，收获小鼠肺并将其悬浮在1ml的0.5M乙酸中，并且然后均质化，首先使用组织均质器(在冰上60s)，并且然后在Dounce均质器中(在冰上)使用15个冲程。将所得均质物旋转(12,000×g)10分钟，并将上清液用于后续分析。使用大鼠尾部胶原蛋白(密苏里州圣路易斯西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))在0.5M乙酸中制备胶原蛋白标准品。通过以下制备天狼星红染料：将0.2g的天狼星红F3B(西格玛-奥德里奇公司)与200ml水混合；将1ml的天狼星红染料添加到100μl的胶原标准品或肺匀质物中，并且然后在室温下在定轨振荡器上连续混合30分钟。然后将沉淀的胶原蛋白粒化，并用0.5M乙酸(12,000×g，每次15分钟)洗涤一次。将所得团块再悬浮在1ml的0.5M NaOH中，并使用比色酶标仪(加利福尼亚州埃库莱斯伯乐(Bio-Rad,Hercules,CA))以分光光度法(540nm)对天狼星红染色进行定量。

结果

第2组在博来霉素治疗后示出统计学上显著的体重减轻，这是IPF诱导的指标中的一个。相比之下，第3组的吸入特加维因治疗可逆转博来霉素诱导的肺损伤引起的体重下降。

表13

另外，博来霉素诱导的第2组肺顺应性降低，指示纤维化的诱导。在第3组博来霉素损伤后吸入特加维因治疗使顺应性值逆转到接近第1组经假治疗的对照的那些值。

表14

另外，如通过羟基脯氨酸测定测量的总肺胶原蛋白含量在第2族中示出显著提高，指示在博来霉素损伤之后活化纤维化；相比之下，在第3组中在博来霉素损伤之后吸入特加维因治疗逆转此改变，并且胶原蛋白水平与在第1组中假治疗的对照接近。

表15

因此，此实验展示特加维因具有治疗IPF的极大可能。

实例19

评估雾化特加维因制剂

使用振动筛网和压缩空气喷雾器对一系列BC-2059(特加维因)制剂进行雾化，以确定最有效的气雾剂产生方法。表征气雾剂在仅啮齿动物的鼻子暴露室内的气雾剂浓度和粒径分布。每种制剂均具有不同的调节的变量以评估对气雾剂性能的影响。这些包括API的粒径减小，赋形剂特性和利用的喷雾器。

本研究的目的是确定一种可雾化测试物品BC-2059进行啮齿动物吸入研究的方法。

将测试物品BC-2059以15mg/mL的浓度悬浮在0.1％吐温80的净化水中。使用Covaris S220x超声发生器(马萨诸塞州波士顿(Boston MA)的Covaris)对悬浮液进行超声处理，并且然后在涡旋混合一分钟。总共重复15次超声处理和涡旋混合。

利用12mL球磨罐和三个金属球，将剩余的大批BC-2059粉末在Planetary BallMill(德国莱驰(Retsch,Germany))中以150RPM碾磨10分钟。将研磨的BC-2059粉末以15mg/mL的浓度悬浮在0.1％的吐温80的净化水中。使用上文概述的程序超声处理悬浮液。

利用12mL球磨罐和三个金属球，将剩余的大批BC-2059粉末在Planetary BallMill(德国莱驰)中以300RPM碾磨60分钟。将研磨的BC-2059粉末以15mg/mL的浓度悬浮在0.1％吐温80的净化水和10％PEG 400的净化水中。使用上文概述的程序超声处理悬浮液。使用10％乙醇的净化水制备附加15mg/mL BC-2059悬浮液。使用VWR超声发生器(宾夕法尼亚州拉德诺(Radnor PA)的VWR)将悬浮液超声处理10分钟，并且使用涡旋混合器混合4分钟。

在没有另外改性的情况下以原样使用附加制剂(25mg/mL BC-2059于0.625％泊洛沙姆188和10％山梨糖醇中的纳米研磨的悬浮液)。

气雾剂由一系列表面活性剂制备的制剂用4种单独的喷雾器(Aeroneb Solo(爱尔兰Aerogen))、Pari LC Plus(弗吉尼亚州中洛锡安Pari Respiratory Equipment Inc.)、Hospitak Up Mis，Hospitak Inc.纽约州Farmdale)和Hudson Micro-Mist(Teleflex Inc.北卡罗来纳州三角研究园(Research Triangle Park,NC))并过渡到2层流过去的啮齿动物暴露系统来产生。

通过过滤器样品(GF/A 47-mm filters)的分析确定在暴露环境中气雾剂的总浓度。过滤器样品以0.3L/min的标称流速收集。对整个研究过程中收集的过滤器样品进行重量分析，以确定总气雾剂浓度，并提交HPLC分析。

将具有测试物品的过滤器用1:1乙腈:甲醇提取，并通过HPLC-UV测定进行分析。

使用In Tox，mercer式级联冲击器在呼吸区域处测量测试物品的粒径分布(PSD)。

结果

气雾剂浓度(重力和化学)在下表16中示出。

表16

方法开发汇总

使用In-Tox级联撞击器测量由0.1％吐温80的超纯水制备的悬浮液的测试环境的粒径，并且发起人使用压缩空气喷雾器提供泊洛沙姆悬浮液。每种制剂的质量中值空气动力学直径和几何标准差在下表17中列出。粒径分布在图1和图2中示出。

表17

粒径分布

结论

将BC-2059的制剂喷雾并引入仅鼻吸入暴露室。使用重量和HPLC测定对暴露环境的气雾剂浓度进行表征。测量的泊洛沙姆制剂的最高重力气雾剂浓度为2.47mg/L，这对应于活性测试物品的0.48mg/L。用级联撞击器测量此制剂的粒径分布，其MMAD为2.46μm，其中几何标准差为1.45μm。

在回顾泊洛沙姆制剂的结果对先前的结果时，0.484mg/L的BC2059气雾剂浓度将在30分钟内对30克小鼠导致1.5mg/kg的肺沉积剂量(10％DF)。基于标准的小鼠肺重量，这将导致肺组织中～0.2mg/g。先前的测试导致～0.02mg/g(测定的浓度)。

因此，与其它BC2059制剂相比，此喷雾的BC2059纳米研磨的悬浮液得到气雾剂的最佳浓度。