次乌头碱及其结构类似物作为Sirt3抑制剂和诱导体内外氧化应激的应用
阅读说明：本技术 次乌头碱及其结构类似物作为Sirt3抑制剂和诱导体内外氧化应激的应用 (Application of hypaconitine and structural analogs thereof as Sirt3 inhibitor and in-vivo and in-vitro oxidative stress induction ) 是由 段亚君 黄蓉 徐帅 王垣钰 韩际宏 张爽 杨潇潇 陈元利 于 2021-01-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于次乌头碱作为Sirt3抑制剂的新用途,具体公开了次乌头碱及其结构类似物作为Sirt3抑制剂和诱导体内外氧化应激的应用,次乌头碱对细胞Sirt3蛋白表达的影响,次乌头碱作为Sirt3抑制剂的应用,次乌头碱的结构类似物作为Sirt3抑制剂的应用,次乌头碱通过抑制Sirt3诱导体内外氧化应激的应用,次乌头碱的结构类似物通过抑制Sirt3诱导体内外氧化应激的应用。次乌头碱对Sirt3有明显的抑制作用,并且导致氧化应激水平升高,可以成为Sirt3的抑制剂用于科学研究以及药物临床。(The invention belongs to a new application of aconitine as a Sirt3 inhibitor, and particularly discloses an application of aconitine and a structural analogue thereof as a Sirt3 inhibitor and inducing in vivo and in vitro oxidative stress, an influence of the aconitine on the expression of cell Sirt3 protein, an application of the aconitine as a Sirt3 inhibitor, an application of the structural analogue of the aconitine as a Sirt3 inhibitor, an application of the aconitine for inducing in vivo and in vitro oxidative stress by inhibiting Sirt3, and an application of the structural analogue of the aconitine for inducing in vivo and in vitro oxidative stress by inhibiting Sirt 3. The hypaconitine has obvious inhibition effect on Sirt3, causes the increase of oxidative stress level, and can be used as the inhibitor of Sirt3 for scientific research and pharmaceutical clinic.)
技术领域
本发明属于次乌头碱及其类似物的新用途，具体地涉及次乌头碱及其结构类似物作为Sirt3抑制剂和诱导体内外氧化应激的应用。
背景技术
NAD依赖性脱乙酰酶Sirt3主要定位于线粒体，作为一种脱乙酰酶， Sirt3能使多种抗氧化酶(包括锰超氧化物歧化酶MnSOD，过氧化氢酶，产氧化物歧化酶SOD2，谷胱甘肽还原酶GSH等)去乙酰化而被激活，进而参与氧化应激调节，清除活性氧水平。
次乌头碱双酯型生物碱，存在于毛茛科植物乌头，短柄乌头，黄花乌头的块根又名下乌头碱，海帕乌头碱，高乌头碱。据报道次乌头碱可以通过多个靶点直接抑制炎性细胞因子和炎性介质的产生，发挥抗炎功能。次乌头碱是否能诱导体内外氧化应激，抑制Sirt3表达还未有报道。。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的缺点与不足，提供了次乌头碱作为Sirt3 抑制剂的应用，本发明还提供了次乌头碱的结构类似物作为Sirt3抑制剂的应用，本发明还提供了次乌头碱通过抑制Sirt3诱导体内外氧化应激的应用，本发明还提供了次乌头碱的结构类似物通过抑制Sirt3诱导体内外氧化应激的应用。
根据本发明第一方面实施例的次乌头碱作为Sirt3抑制剂的应用，所述次乌头碱化学结构为：
根据本发明第二方面实施例的次乌头碱的结构类似物作为Sirt3抑制剂的应用。
根据本发明第三方面实施例的次乌头碱通过抑制Sirt3诱导体内外氧化应激的应用。
根据本发明第四方面实施例的次乌头碱的结构类似物通过抑制Sirt3 诱导体内外氧化应激的应用。
根据本发明实施例的次乌头碱及其类似物作为Sirt3抑制剂的应用，通过蛋白印迹法检测次乌头碱处理的细胞中的Sirt3蛋白的表达情况，结果显示次乌头碱对Sirt3蛋白有明显的抑制作用。
附图说明
图1为次乌头碱的化学结构；
图2中为蛋白质免疫印记法检测细胞中Sirt3蛋白表达水平；
图3中与对照组相比，*P<0.05；**P<0.01(n＝4,mean±SD)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面参照附图1-3描述根据本发明实施例的次乌头碱及其类似物作为 Sirt3抑制剂的应用。
根据本发明实施例的次乌头碱及其类似物作为Sirt3抑制剂的应用，所述次乌头碱化学结构为：
其中，次乌头碱及其结构类似物通过抑制Sirt3诱导体内外氧化应激的应用。
次乌头碱作为Sirt3的抑制剂，下面采用蛋白质免疫印记实验检测次乌头碱对Sirt3蛋白表达的影响。
(1)细胞培养：用含10％胎牛血清的高糖DMEM进培养H9c2心肌细胞. 将细胞放入37℃、5％CO2培养箱培养。当心肌细胞布满到培养皿90％左右时，弃培养液，用PBS浸洗三次，而后弃PBS，加入0.25％胰酶消化细胞，放显微镜下观察，当细胞回缩变圆时，迅速加入PBS液终止消化，用移液枪吹落心肌细胞，而后将细胞悬液转移至4mL离心管中，800rpm条件下离心2分钟。弃上层培养液，并用1ml新培养液重悬细胞，按需要接种于6 孔板中培养。24小时后倒置显微镜下观察，H9c2心肌细胞呈长梭形，取长势良好的细胞用于实验。
(2)细胞蛋白提取
用PBS将细胞洗涤后向6孔板的每孔中加入200μL蛋白裂解液，置于水平摇床上剧烈摇晃2min；用移液器将细胞吹下，转移到1.5mL离心管中，用涡旋振荡器震荡细胞后在冰上静置5min重复此过程1次，最后再次震荡后置于4C离心机内，最高速离心10min，将上清转移到新的1.5 mL离心管中，置于-20℃冰箱内保存备用。
(3)BCA法测定蛋白浓度
试剂配制
Reagent A：BCA 1g，Na2CO3 1.6958g，酒石酸钠0.161g，NaHCO3 0.9241g， NaOH0.4g。用dH2O定容到100ml。
Reagent B：0.4g CuSO4.5H2O溶解在10ml dH2O中。
①蛋白标准品为BSA，浓度为0.1～0.5mg/ml。
②混合BCA工作液：A:B＝50：1。
③250μl BCA中加入20μl BSA标准品或适当稀释的样品，混匀，60℃反应30min。
④冷却后。测量562nm的吸光值，计算样品浓度。
(4)Western blot
1)配胶
按照说明书所示配方配制分离胶和浓缩胶。
2)制备蛋白样品
按照步骤(4)所测得的浓度计算蛋白样品的上样体积，并用蛋白裂解液将各样品补齐到统一的体积后，加入5×loading buffer，震荡混匀并离心，置于100℃金属浴上煮沸5min，离心后震荡混匀，再次离心，使管中液体都沉积到管电泳结束后将分离胶取下，按照说明底。
3)凝胶电泳
安装好电泳装置，将4℃预冷的1×电泳缓冲液加入到电泳槽中，再用移液器将上步所得的蛋白样品加入浓缩胶胶孔中，在124V恒定电压下电泳90分钟。
4)转膜书安装转膜装置，置于磁力搅拌器上，100V定压转膜1h。
5)封闭
按照蛋白Maker将NC膜剪成适当的大小，浸泡于5％脱脂牛奶中，置于水平摇床上，在室温下缓慢震荡封闭1h。
6)抗体孵育
吸去牛奶，加入相应的一抗，置于4℃冰箱中的摇床上缓慢震荡孵育过夜；孵育完成后回收一抗，用含0.5％吐温20的1×PBST洗膜3 次，每次8min；洗完后加入二抗，置于水平摇床上，在室温下缓慢震荡。孵育1h；回收二抗，1×PBST洗膜3次，每次8min。
7)ECL检测
将ECLA液和B液按1:1比例混匀，滴到NC膜上，拍照成像。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。