果糖在制备治疗缺血性损伤药物中的应用
阅读说明：本技术 果糖在制备治疗缺血性损伤药物中的应用 (Application of fructose in preparation of medicine for treating ischemic injury ) 是由 周炳 梁静 吉训明 于盼盼 韩荣荣 于 2021-01-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了果糖在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用,涉及生物医药技术领域。包括以下方面：建立缺血损伤细胞模型及动物模型,对损伤模型进行果糖处理,发现果糖可调节神经元能量代谢与氧化还原代谢,减轻模型细胞与模型动物的缺血性损伤,具体为：降低缺血损伤后神经元死亡率,减少缺血损伤动物的脑梗死面积,并改善其神经行为学特征。(The invention discloses an application of fructose in preparation of a medicine for treating cerebral arterial thrombosis, and relates to the technical field of biological medicines. The method comprises the following steps: establishing an ischemia damaged cell model and an animal model, carrying out fructose treatment on the damaged model, finding that fructose can regulate neuron energy metabolism and redox metabolism, and relieving the ischemic damage of model cells and the model animal, specifically: reducing neuronal mortality after ischemic injury, reducing cerebral infarction area of animals with ischemic injury, and improving neurobehavioral characteristics of the animals.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体的说，涉及到果糖在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用。
背景技术
脑卒中是致死、致残的最主要疾病之一，社会及家庭负担严重。脑卒中患者中缺血性脑卒中约占80％。过去数年，缺血性脑卒中的诊疗取得很大进展，多数患者可进行药物或手术治疗。但依赖时间窗内的溶栓和取栓治疗，只有约46％的患者预后良好(90天mRS0-2分)，且存在症状性出血等风险，综合治疗效果远低于预期。因此亟需更有效、安全的缺血性脑卒中防治策略。
缺血性脑卒中发生时，局部动脉血管闭塞，脑血流下降，脑组织深度缺氧和微血管功能障碍，引发代谢稳态失衡。脑组织供血、供氧、供糖等减少或完全停止，氧化还原代谢失衡，产生大量氧自由基，同时，当CBF低于10ml/(100g·min)时，半暗带能量耗尽，细胞将发生不可逆坏死，演变成梗死核心。因此缺血发生时，维持氧化还原与能量代谢稳态对减轻缺血损伤、促进功能预后良好至关重要，是重要的缺血性脑卒中药物治疗靶点。
现有技术中有1,6-二磷酸果糖，由于果糖二磷酸钠是细胞代谢的重要产物，能调节糖代谢中若干酶活性的功效，外源性的果糖二磷酸钠可作用于细胞膜，通过激活细胞膜上的果糖激酶，增加细胞膜内高能磷酸键和三磷酸腺苷的浓度，从而促进钾离子内流恢复细胞静息状态，增加红细胞内二磷酸腺苷的含量，抑制氧自由基和组织胺的释放。因而可作为一种恢复与改善细胞代谢的分子水平药物，在临床上具有辅助治疗冠心病、心律失常、急性脑梗塞等疾病。现有技术中有甘油果糖注射液，是一种高渗透性脱水药。其中甘油能参与脑代谢过程，改善脑代谢；果糖不需胰岛素即可被代谢利用；氯化钠能调节电解质平衡。本品作用机制为：静脉注射后能提高血浆渗透压，导致组织内(包括眼、脑、脑脊液等)的水分进入血管，从而减轻组织水肿，降低颅内压、眼内压和脑脊液容量及其压力；通过促进组织中含有的水分向血液中移动，使血液得到稀释，降低毛细血管周围的水肿，改善微循环，使脑灌注压升高，脑血流量增大，是临床降低颅内压、消除脑水肿的一线药物。
糖在体内常见的代谢途径有糖酵解途径(glycolytic pathway)、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)等。前者又称EMP途径，是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径。糖酵解途径在无氧及有氧条件下都能进行，是葡萄糖进行有氧或者无氧分解的共同代谢途径。后者是葡萄糖氧化分解的一种方式。由于此途径是由6-磷酸葡萄糖(G-6-P)开始，故亦称为己糖磷酸旁路。此途径在胞浆中进行，可分为两个阶段。第一阶段由G-6-P脱氢生成6-磷酸葡糖酸内酯开始，然后水解生成6-磷酸葡糖酸，再氧化脱羧生成5-磷酸核酮糖。NADP+是所有上述氧化反应中的电子受体。第二阶段是5-磷酸核酮糖经过一系列转酮基及转醛基反应，经过磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中间代谢物最后生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，后二者还可重新进入糖酵解途径而进行代谢。
然而，目前现有技术中鲜有对果糖通路的研究，关于果糖通路对神经元氧化还原与能量代谢调节有待进一步探索，还没有通过果糖通路治疗缺血性脑卒中的记载。本发明首次报道果糖可调控代谢网络治疗脑缺血损伤。
发明内容
本发明的目的是提供果糖在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用，果糖通过调节神经元细胞能量代谢与氧化还原代谢，进而达到改善缺血性脑损伤的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供果糖在制备治疗脑缺血损伤药物组合物中的应用。果糖通过调节神经元能量代谢与氧化还原代谢，改善缺血性损伤，如缺血性脑损伤。
本发明果糖可采用不同形式的给药途径，包括但不局限于静脉给药、肌肉注射、局部给药、腹腔注射、颅内注射、胸腔内给药、颅内给药、经肺给药、皮下给药、舌下给药、口服给药、滴鼻给药、介入给药、植入给药、敷贴给药、经皮给药、涂膜给药或直肠内给药等。进一步地，以静脉注射或颅内给药等形式降低血脑屏障效应，利于提高药物作用效率。
本发明果糖可在急性脑梗期、卒中康复期、溶栓前或后、取栓前或后给药。
本发明果糖可采用不同形式的药物剂型，包括但不局限于注射剂、粉针剂、滴剂、贴剂、片剂、颗粒剂、舌下片剂、微针剂、泡腾片、溶液剂、乳剂、脂质体制剂、悬浮剂、软膏剂、霜剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂、锭剂、滴剂、滴丸剂、丸剂、胶囊剂、散剂、粉末剂、擦剂、细粒剂、糖浆剂等剂型等。
进一步地，本发明的药物组合物含有作为有效成分的果糖或其药理学上可接受的盐，同时可以根据需要选择加入在药物的制备中通常所使用的赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、着色剂、调味剂、矫味剂等。
本发明的药物组合物可以分别按照该领域中所惯用的方法调制、成形或制备。进一步地，可以通过冷冻干燥，制备成易于保存的状态，使用时在水、生理盐水、缓冲液等稀释剂中进行溶解而制备成适当的浓度后使用。
本发明药物组合物中果糖的浓度可为0.1-15mM，优选0.5-10mM，优选1-8mM，优选1-6mM。
本发明所述缺血性损伤包括缺血性脑损伤、缺血性脑卒中，以及其他器官或部位的缺血、缺氧性损伤，如缺血性心肌损伤，缺血性肾损伤等。
本发明的药物组合物可以单独使用，或同时含有其它有效成分。可以同时给药或间隔给药，间隔给药可在各有效成分同时起作用的时间范围内；给药途径和给药方法既可以相同，也可以不同；可以单独制备或收纳在适于联合用药的单个包装内的套装制剂的形式。
本发明的有益效果在于：本发明利用大鼠MCAO损伤模型和神经元OGD损伤模型，首次观察到果糖通路在调节神经元能量代谢与氧化还原代谢中的重要作用，绘制出果糖通路代谢图谱。发现其可抑制缺血对神经元的损伤，抑制缺血损伤引起的行为学改变，对脑缺血损伤有保护作用。同时，本发明选用果糖作为活性成分，对缺血性脑损伤神经元的氧化还原与能量代谢具有调节作用，可显著提高神经元活力，改善受损神经元活力和存活率，改善神经行为学，缩小脑梗面积，对缺血性脑损伤显示出突出的治疗效果，且强于现有技术中其他类似药物。
附图说明
图1显示脑卒中模型大鼠大脑皮层的代谢组改变；
图2大鼠经IPC处理6小时后果糖通路显著上调；
图3显示果糖代谢通路时间特异性调节谱图；
图4显示果糖通路对DIV7神经元ATP水平的影响；
图5显示果糖通路对DIV7神经元NADPH水平的影响；
图6显示果糖在不同阶段给药对OGD损伤神经元存活率的影响；
图7显示果糖在不同阶段给药对OGD损伤神经元ATP产量的影响；
图8显示果糖在不同阶段给药对OGD损伤神经元NADPH产量的影响；
图9显示同位素标记果糖在正常条件及OGD处理时在PPP与TCA通路的分布；
图10显示果糖以不同给药途径处理对MCAO大鼠神经行为学及脑梗死影响；
图11显示不同浓度的果糖对细胞活力的影响；
图12显示果糖、果糖-1,6-二磷酸、甘油果糖对DIV7神经元活力的影响，结果显示果糖具有显著增强神经元活力的作用；
图13显示果糖、果糖-1,6-二磷酸、甘油果糖对OGD损伤神经元活力的影响，结果显示果糖具有显著减轻神经元缺血损伤的作用；
图14显示果糖、果糖-1,6-二磷酸、甘油果糖对OGD损伤神经元存活率的影响，结果显示果糖具有显著减轻神经元缺血损伤的作用。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：果糖通路的选择
1.1建立缺血性脑卒中模型
(1)细胞模型：利用氧糖剥夺(OGD)模型模拟缺血性脑卒中，采用体外培养7天(DIV7)的原代神经元，处理时将培养液更换为无葡萄糖培养液，置于低氧箱(1％O2+5％CO2+94％N2)中，37℃氧糖剥夺1.5h，换回正常培养基，常氧条件下，继续正常培养24h。
(2)动物模型：利用大鼠中动脉栓塞诱导(MCAO)损伤模型模拟缺血性脑卒中，取250-300g雄性SD大鼠，异戊烷麻醉，仰卧固定于手术台上。剪开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉，暴露颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉，用动脉夹夹闭颈总动脉，在颈内动脉和颈外动脉上各穿一结扎线。在颈外动脉上剪口并导入线栓，轻推线栓，至大脑中动脉的起始处，形成大脑中动脉供血中断(Middle Cerebral Artery Occlusion，简称MCAO)，缝线固定，术后1.5h拔栓，实行血流再灌注，动物回笼饲养24h，之后进行神经行为学评价，麻醉后处死，取脑，进行TTC染色，观察脑梗死面积。
1.2缺血性脑卒中引发代谢紊乱
我们通过构建细胞模型和大鼠中动脉栓塞(MCAO)模型，模拟缺血性脑卒中的发生，研究模型大鼠脑皮层内代谢物水平改变。缺血性脑卒中发生时，动脉血管闭塞使梗死核心周围脑血流(CBF)下降，脑组织深度缺氧和微血管功能障碍，引发代谢稳态失衡。结果显示，模型组组与对照组代谢特征差异显著(如图1A所示)；能量底物NAD与还原当量GSH、GSSG、NADPH减少(如图1B、图1C所示)。对差异代谢物进行通路富集后，发现TCA通路、烟酸与烟酰胺代谢通路、GSH通路变化显著(见图1D)，上述通路是维持能量与还原当量稳态的关键通路。提示我们缺血性脑卒中引发脑内代谢紊乱，且主要体现在对能量与氧化还原代谢的影响。
1.3果糖通路的选择与确定
缺血性脑卒中引发代谢稳态失衡，申请人团队从现行有效的内源代谢调控手段入手，寻找缺血性脑卒中治疗靶点。缺血预适应(IPC)是最强的内源性缺血保护方法，通过短暂、非致死的缺血处理，启动内源性保护机制，使组织耐受致死性缺血损伤。
首先，对大鼠进行IPC处理，分别在IPC处理后0、2、6、24小时对大脑皮层进行代谢组分析，发现IPC处理后在代谢物水平引发大鼠大脑皮层内时间特异性代谢改变(如图2所示)，其呈现时间特异性，在IPC处理6小时后，糖酵解通路、PPP通路、果糖通路显著上调，变化尤为显著。且果糖通路上代谢产物果糖-1-磷酸(F1P)和甘油醇-3磷酸(G3P)与对照组相比，产生显著改变(如图3所示)。提示果糖通路是缺血性脑损伤的重要通路之一。
其次，为进一步验证果糖通路在IPC缺血保护中的作用，在细胞水平加入果糖通路抑制剂sorbinil，发现果糖通路被抑制后，IPC不再增强ATP与NADPH含量(如图4、图5所示)，提示果糖通路在调节缺血性脑损伤中的明确作用，其可参与对能量与还原当量稳态的维持。
通过靶点筛选，最终选取果糖通路关键成分——果糖，分别在动物及细胞水平验证其对缺血性脑损伤的作用。
实施例2：果糖对缺血性脑损伤的治疗效果
2.1缺血性脑损伤评价指标
(1)行为学评价：采用Longa评分法进行行为学评价，评分标准：0分＝无神经损伤，1分＝左前肢伸展障碍，2分＝向左打圈，3分＝行走时向左侧倾倒，4分＝意识昏迷，5分＝死亡。
(2)TTC染色法测定脑梗死面积：解剖分离出大鼠全脑，置于模具内，弃小脑及嗅球后切取冠状脑片，厚度约2mm，迅速将脑片置于2％的氯化三苯四氮唑(TTC)的磷酸缓冲溶液中，37℃避光孵育15～20min，孵育过程中每隔3～5min翻动一次，之后取出脑片，PBS清洗后于4％PFA(多聚甲醛)浸泡过夜，取出脑片，PBS清洗后拍照，利用ImageJ计算脑梗死面积。采用Graphpad Prism软件进行数据统计，多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，组间均数两两比较。
(3)神经元存活情况：采用TUNEL染色与免疫荧光染色，统计神经元存活情况，将神经元细胞爬片，4％PFA固定10min，PBS清洗后，于blocking buffer中孵育1h，加入MAP2一抗工作液，4℃过夜，PBS清洗，加MAP2二抗工作液，室温孵育1h，PBS清洗后，进行TUNEL染色，最后加入含DAPI的封片剂封片。通过聚焦显微镜采集数据，采用ImageJ统计细胞死亡数量。
(4)ATP与NADPH含量：采用P0-P1乳鼠，分离皮层神经元，接种神经元时，加入特异检测ATP的慢病毒转染蛋白载体与特异检测NADPH的慢病毒转染蛋白载体iNap，在第7天进行处理，之后用4％PFA固定，进行免疫荧光染色，通过共聚焦显微镜采集数据，采用ImageJ统计病毒载体蛋白荧光强度，计算ATP、NADPH含量。
2.2果糖在不同阶段给药对OGD损伤神经元的影响
通过检测原代神经元培养体系中特异检测ATP的慢病毒转染蛋白载体与特异检测NADPH的慢病毒转染蛋白载体iNap的表达量，表征神经元能量代谢与氧化还原代谢水平。
(1)神经元存活情况：将DIV7神经元分为四组，分别为对照组，OGD组(进行OGD处理)，OGD+Fru(per)组(OGD过程中加入果糖处理)，OGD+Fru(post)组(OGD处理后再灌注阶段加入果糖处理)。OGD结束后复灌24h，4％PFA固定10min，PBS清洗后，加入MAP2一抗工作液，PBS清洗，加二抗工作液，PBS清洗后，进行TUNEL染色，最后加入含DAPI的封片剂封片。观察神经元存活情况。
结果显示，无论在OGD阶段，还是再灌注阶段加入果糖，均能降低OGD所致神经元死亡率，如图6所示。
(2)ATP与NADPH含量：从P0-P1乳鼠分离皮层神经元，在接种神经元同时，加入特异检测ATP的慢病毒转染蛋白载体与特异检测NADPH的慢病毒转染蛋白载体iNap，在第7天，分为四组，分别为对照组，OGD组(进行OGD处理)，OGD+Fru(per)组(OGD过程中加入果糖处理)，OGD+Fru(post)组(OGD处理后再灌注阶段加入果糖处理)。OGD结束后复灌24h，4％PFA固定后，进行MAP2免疫荧光染色，观察神经元ATP与NADPH含量。
结果显示，无论在OGD阶段，还是再灌注阶段加入果糖，均能增强OGD所致神经元ATP、NADPH产量降低，即果糖可增强神经元能量代谢与氧化还原代谢功能。如图7、图8所示。
(3)果糖增加向PPP与TCA通路的流入
采用代谢流实验，在DIV 7神经元中加入U-13C-果糖，分别观察在正常条件及OGD处理后，果糖在各代谢通路的分布情况，发现OGD处理后，与对照组相比，PPP通路上关键代谢产物核糖-5-磷酸与赤藓糖-4磷酸13C标记率增加，说明在OGD发生时，果糖向PPP通路分布增强，即通过加强向PPP流动以提高细胞NADPH水平，进而维持氧化还原平衡，同时，OGD处理后，与对照组相比，TCA通路上关键代谢产物草酰乙酸与柠檬酸13C标记率增加。结果表明，果糖在OGD发生时向TCA的流入增强，即通过增强TCA维持细胞能量供应。如图9所示。
2.3果糖以不同途径给药后对MCAO大鼠的影响
取250-300g雄性SD大鼠，分为三组，分别进行MCAO造模处理(MCAO组)，MCAO造模并联合拔栓后尾静脉注射果糖(MCAO+Fru-1组)，MCAO造模并联合拔栓后腹腔注射果糖(MCAO+Fru-2组)，具体造模过程为，将大鼠异戊烷麻醉，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将硅胶线栓通过颈外动脉插入至大脑中动脉的起始处，1.5h后拔栓，立即按上述处理方案进行果糖给药，给药24h后，采用Longa评分法进行行为学评价，之后麻醉处死，取脑，进行TTC染色观察脑梗死面积。
结果显示，果糖以两种给药方式给药均能改善MCAO大鼠神经行为学特征，减少脑梗死面积。尾静脉注射效果整体优于腹腔注射给药。如图10所示。
综上，各实验数据显示，果糖对OGD神经元及MCAO大鼠都有明显的治疗作用，有望开发为治疗缺血性脑血管疾病的新型药物，特别是缺血性脑卒中的新型药物。
2.4不同浓度果糖对细胞活力的影响
采用Luminescent细胞活力测试试剂盒，研究不同浓度果糖对培养7天(DIV 7)神经元活力的影响，摸索果糖在细胞体系中的添加浓度。结果显示，果糖在1-6mM时，提高DIV 7神经元细胞活性的效果更佳。如图11所示。
实施例3：果糖、果糖-1,6-二磷酸、甘油果糖用于防治缺血性损伤的效果比较
选取现有技术中已有的果糖相关药物：果糖-1,6-二磷酸(F1,6P)、甘油果糖(G.Fru.)，通过对比试验验证其对于缺血性损伤的治疗效果。
3.1果糖、果糖-1,6-二磷酸、甘油果糖对DIV7神经元活力的影响
采用Luminescent细胞活力测试试剂盒，研究不同浓度(0、1、2、4、6、8、16mM)果糖(Fru.)、果糖-1,6-二磷酸(F1,6P)、甘油果糖(G.Fru.)对培养7天(DIV 7)神经元活力的影响。
结果显示，三者均可提高神经元活力，其中果糖对神经元活力的改善作用明显优于果糖-1,6-二磷酸和甘油果糖，如图12所示(各浓度组分别与0mM组相比,*P＜0.05)。
3.2果糖、果糖-1,6-二磷酸、甘油果糖对OGD(氧糖剥夺)损伤神经元的保护作用
采用Luminescent细胞活力测试试剂盒：利用96孔板培养神经元细胞，在第7天，对神经元进行1.5小时OGD处理，处理后分别加入果糖、果糖1,6-二磷酸，甘油果糖，浓度均为2mM,24小时之后，采用试剂盒检测细胞活力。
结果显示，OGD极显著降低细胞活力，果糖可显著提高OGD损伤神经元的细胞活力，而果糖1,6-二磷酸和甘油果糖在该模型体系中具有提高OGD损伤神经元活力的趋势，但并表现出显著性差异。如图13所示(*P＜0.05，***P＜0.001)。
采用免疫荧光染色法：将神经元培养7天后对其进行1.5小时OGD处理，处理后分别加入果糖、果糖1,6-二磷酸，甘油果糖，浓度均为2mM,24小时之后，进行MAP2与DAPI染色。
结果显示，OGD极显著降低神经元存活率，采用药物治疗后，甘油果糖对神经元存活率的改善效果轻微，果糖和果糖1,6-二磷酸均显示出提高神经元存活率的功效，其中果糖效果显著优于果糖1,6-二磷酸。如图14所示(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。