一种结构新颖的喜树碱衍生物的应用
阅读说明：本技术 一种结构新颖的喜树碱衍生物的应用 (Application of camptothecin derivative with novel structure ) 是由 王洪波 田京伟 刘宗亮 李敏 王珊珊 王文艳 李小鹏 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于有机合成领域,公开了一种结构新颖的喜树碱衍生物制备抗肿瘤药物的应用。本发明通过结构修饰在保证新型喜树碱衍生物稳定性和抗肿瘤活性的前提下降低其毒性,有效量的喜树碱衍生物或其药学上可接受的盐酸盐用于制备抗肿瘤药物治疗结直肠癌等疾病或病症。(The invention belongs to the field of organic synthesis, and discloses application of a camptothecin derivative with a novel structure in preparation of an anti-tumor medicament. The invention reduces the toxicity of the novel camptothecin derivative on the premise of ensuring the stability and the antitumor activity of the camptothecin derivative through structural modification, and the effective amount of the camptothecin derivative or the pharmaceutically acceptable hydrochloride thereof is used for preparing antitumor drugs for treating diseases or symptoms such as colorectal cancer and the like.)
技术领域
本发明属于有机合成领域，涉及一种喜树碱衍生物及其制备方法和治疗结直肠癌的研究，具体为一种结构新颖的喜树碱衍生物制备抗肿瘤药物的应用。本发明通过结构修饰改造以SN38为基本骨架，对结直肠癌有良好抑制效果的化合物。
背景技术
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其在世界范围内的发病率和死亡率都居肿瘤的第3位，长期威胁着人类生命健康。近二十多年来，由于经济的快速发展及生活方式的西化，我国的结直肠癌发病率呈逐年上升趋势，并且发病年龄有呈年轻化的趋势。作为常见的消化道恶性肿瘤之一，结直肠癌的死亡率一直居高不下，单纯手术的3年生存率不甚理想，而化疗及联合化疗可显著提高5年生存率，是临床的主要治疗手段。
根据美国国立综合癌症网络发布的2018年版本的结肠癌、直肠癌临床实践指南，以5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康(CPT-11)组成的FOLFIRI方案是目前治疗进展期结直肠癌的标准化治疗方案，CPT-11临床上的广泛应用使得治疗的效率占半数以上。
喜树碱衍生物在体内外对多种恶性肿瘤均具有很好的抗肿瘤活性，在临床上常用于胃癌、结肠癌和膀胱癌等恶性肿瘤的治疗，临床上易引起恶心、呕吐和食欲不振等胃肠反应，同时还会引起包括骨髓抑制、白细胞和血小板减少等毒副反应，此外该类化合物水溶性差且内酯环不稳定。
为了增强喜树碱的抗肿瘤活性、水溶性和稳定性，降低毒副作用，科学家进行了大量的结构优化工作，但是目前已经上市的喜树碱类的药物仅有：拓扑替康、CPT-11、贝洛替康、10-羟基喜树碱。处于临床阶段的包括：鲁比特康、9-氨基喜树碱、依沙替康和洛托替康等。
虽然有大量的文献报道了多种新型喜树碱的研究也取得了一定的进展，但是在保持抗肿瘤活性的同时减少其毒副作用仍是极具挑战性的。
发明内容
本发明旨在提供一种结构新颖的喜树碱的衍生物，并提供上述化合物的细胞水平及靶点水平的活性筛选结果及其制备抗肿瘤药物的应用。
本发明通过结构修饰合成了一种结构新颖的喜树碱衍生物，
所述喜树碱衍生物结构所示：
所述喜树碱衍生物的合成路线如下所示：
经过一系列的优化改造，我们发现新型喜树碱衍生物是优良的TOPO I抑制剂能够有效抑制多种结直肠癌癌细胞的增殖，是潜在的治疗结直肠癌的药物。
为实现上述发明目的，技术方案如下所述：
一种结构新颖的喜树碱衍生物制备抗肿瘤药物的应用，所述喜树碱衍生物如结构式A所示：
优选的，本发明提供通式所示的新型喜树碱衍生物或其药学上可接受的盐酸盐制备抗肿瘤药物的应用。
优选的，所述肿瘤细胞为直肠癌，进一步具体的为LS180、HCT116、HT-29和CT-26。
本发明中所采用的述语“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益/风险比例，通常是水或油的或可分散的，并可有效的用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可用的并与通式化合物的化学性质相容的。
有益效果
新型喜树碱衍生物相比CPT-11表现出对肿瘤细胞更强的抗肿瘤活性和对正常细胞更低的毒性，新型喜树碱衍生物相比CPT-11更适宜作为抗肿瘤药物给药。
本发明通过结构修饰，在保证新型喜树碱衍生物稳定性和抗肿瘤活性的前提下降低了其毒性，有效量的新型喜树碱衍生物或其药学上可接受的盐酸盐用于制备抗肿瘤药物治疗结直肠癌等疾病或病症。
附图说明
图1为新型喜树碱衍生物A及CPT-11对小鼠毒性影响。
图2为新型喜树碱衍生物A及CPT-11对小鼠肠毒性影响。
图3为新型喜树碱衍生物A、CPT-11及其代谢产物SN38在肿瘤和结直肠组织中的分布(C代表结直肠组织，T代表肿瘤组织)。
具体实施方式
新型喜树碱衍生物A的合成路线如下所示：
实施例1新型喜树碱衍生物A
实施例1新型喜树碱衍生物A
1)化合物A-1的制备：向含SM1(200mg,0.51mmol,1.0eq)的甲苯(5ml)溶液中加入SM2(335.7mg,1.02mmol,2.0eq)和三光气(302mg,1.02mmol,2.0eq)。反应混合物在120℃下搅拌3小时，产率为60％，去除溶剂，得到14.9g黄色粗品，经凝胶柱层析(MeOH:DCM＝2:100～3:100)纯化得到3.2g黄色固体。
2)化合物A的制备：取化合物A-1(3.2g,4.3mmol,1.0eq)于MeOH(50mL)中，加入1NNaOH溶液(12.9mL,12.9mmol,3.0eq)。将得到的溶液在0℃下搅拌2h。用盐酸调整混合物PH＝7，用Na2SO4干燥。凝胶柱层析(MeOH:DCM＝3:100～5:100)浓缩纯化，得到1.1g黄色固体产物。
3)LC-MS m/z:664.4.2(M-H)+；RT＝1.165min(2.5min).
4)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.63(s,0H),11.16(s,1H),10.32(s,1H),8.03(dd,J＝11.6,7.3Hz,2H),7.40(dd,J＝6.3,2.7Hz,2H),7.01(s,1H),5.61(d,J＝2.6Hz,1H),5.51(s,2H),5.37(d,J＝22.7Hz,1H),5.30(s,2H),5.09–4.87(m,1H),3.99(s,1H),3.88(s,1H),3.63(s,1H),3.08(q,J＝7.5Hz,2H),2.16(p,J＝7.0Hz,2H),1.29(t,J＝7.5Hz,6H),0.95(d,J＝25.7Hz,3H).
5)HPLC:[email protected]:96.9％；214nm:97.5％
实施例2药理试验
新型喜树碱衍生物A对结直肠癌LS180 HCT116 HT-29和CT-26的抑制实验，本发明采用MTT法来研究化合物对结直肠癌LS180 HCT116 HT-29和CT-26的抑制作用。步骤如下：
将LS180、HCT116、HT-29和CT-26细胞种植在96孔板上，密度为3×103/孔(100μL)，在37度，5％CO2培养箱中过夜培养使细胞贴壁。24h后细胞加入不同浓度的被测试化合物进行处理，对于LS180、CT-26细胞，化合物使用RPMI-1640完全培养基稀释10μM的储备液进行配置，以含0.1％DMSO的RPMI-1640完全培养基溶液为对照。对于HCT116、HT-29细胞，化合物使用McCoys 5A完全培养基稀释10μM的储备液进行配置，以含0.1％DMSO的McCoys 5A完全培养基溶液为对照。每种化合物每个浓度设3个平行孔，每孔加入带化合物培养基体积为100μL。加完后于37℃，5％CO2条件下培养72h。每孔加入10％的浓度为5mg/mL的MTT溶液。37℃静置孵育4h，弃去含MTT的培养基，每孔加入150μL DMSO溶解沉淀，使紫色结晶完全溶解，于570nm处测定吸光度值A，根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率。
细胞存活率＝实验组OD/对照组OD×100％。
新型喜树碱衍生物A对结直肠癌细胞LS180、HCT116、HT-29和CT-26抑制实验的结果如表1所示。
表1新型喜树碱衍生物A对LS180、HCT116、HT-29和CT-26细胞的抑制效果
抑制试验结果显示：浓度为0.1μM时喜树碱衍生物A对LS180细胞的抑制率为54％，对HCT116、HT-29和CT-26细胞的抑制率为10％-33％。浓度为2μM时喜树碱衍生物A对结直肠癌细胞LS180和HT-29的抑制效果能够达70％左右，对结直肠癌细胞HCT116和CT-26的抑制效果达50％左右。MTT实验结果表明本发明的喜树碱衍生物A对LS180、HCT116、HT-29和CT-26细胞具有明显的抑制活性并且具有浓度依赖，说明本发明的喜树碱衍生物A能够用于制备抗肿瘤药物。
新型喜树碱衍生物A的毒性试验
将小鼠随机分为3组(n＝12/组):(a)对照组；(b)50mg/kg新型喜树碱衍生物A；(c)CPT-11 50mg/kg。腹腔注射CPT-11和新型喜树碱衍生物A连续4天。对照组腹腔给予生理盐水，连续7天测量小鼠体重，食物摄入量，腹泻指数，用以下标准对小鼠腹泻进行评分:(0)正常(正常或无粪便)；(1)轻度腹泻(大便湿软)；(2)中度腹泻(粪便潮湿、不成形，中度肛周染色)；(3)严重腹泻(稀便伴严重肛周染色)。7天后处死小鼠，将小鼠结肠用4％多聚甲醛包裹，石蜡包埋进行组织学分析。将其切成4.5mm厚的切片，制备苏木精和伊红(H&E)。石蜡染色切片进行组织形态学检查。
毒性试验显示(如图1所示)：在7天的观察期间没有动物死亡。第2天，CPT-1150mg/kg和化合物式A 50mg/kg的体重开始下降。与对照组相比，CPT-11 50mg/kg组小鼠体重和食量均有所下降。与CPT-11 50mg/kg相比，化合物式A 50mg/kg小鼠从第5天开始体重增加。给药后CPT-11 50mg/kg和化合物式A 50mg/kg组小鼠摄食量开始下降，但化合物式A50mg/kg组小鼠摄食量高于CPT-11 50mg/kg组。
其中，CPT-11和新型喜树碱衍生物A引起腹泻均发生在给药后的第3天，但是喜树碱衍生物A 50mg/kg组腹泻程度远低于CPT-11 50mg/kg组。
毒性实验结果显示：CPT-11给药时出现腹泻、体重降低以及进食量降低等症状，与现有文献记载的内容一致，出现了CPT-11在临床应用的剂量限值性毒性。但是，与CPT-11相比，新型喜树碱衍生物A的优势在于给药时低毒性表征。
而且，对喜树碱衍生物A及CPT-11对小鼠肠毒性影响的研究也发现，如图2所示：与CPT-11组相比，对照组和新型喜树碱衍生物A组的结直肠组织结构更加完整；CPT-11组引起广泛的结直肠组织损伤，表现为上皮损伤和严重的炎性浸润，如图所示肠隐窝萎缩(隐窝数量减少、隐窝的底部之间的距离增加)，杯状细胞数量减少以及杯状细胞内粘液的消失，而且，淋巴细胞侵入上皮细胞和管腔中，隐窝基底部和和黏膜肌层淋巴细胞增多。新型喜树碱衍生物A 50mg/kg组只出现杯状细胞减少，隐窝内出现少量淋巴细胞浸润；进一步印证了新型喜树碱衍生物A组相比CPT-11组具有更低的毒性，表明新型喜树碱衍生物A适宜作为抗肿瘤药物使用。
以上说明：同样作为抗肿瘤药物使用时，化合物式A相比CPT-11在保持对肿瘤细胞的抑制活性的同时毒副作用更小，因此，化合物式A更适宜作为抗肿瘤药物使用。分析原因在于新型喜树碱衍生物A相比CPT-11对肿瘤细胞具有更优的生物利用度和更强的靶点性、以及对正常肠细胞更低的组织浓度，因此，具有比CPT-11更优的成药性。而且，喜树碱衍生物A的药代动力学数据和组织分布数据也印证了上述分析。
药代动力学结果如表2所示，新型喜树碱衍生物A的AUC数值为67949.48远优于CPT-11的AUC数值379.58，说明新型喜树碱衍生物A有更高的生物利用度，因此表现出更优的抗肿瘤活性。
表2.小鼠给药后新型喜树碱衍生物A的药代动力学参数
而且，喜树碱衍生物A和CPT-11的组织分布结果如图3所示：新型喜树碱衍生物A在结直肠组织中的浓度显著低于CPT-11，在给药0.25h和1h分别为CPT的1/10和1/2，说明新型喜树碱衍生物A对正常肠细胞的毒性明显小于CPT-11，给药时不会产生迟发性腹泻等不良影响。另外新型喜树碱衍生物A的代谢物SN38在肿瘤中的浓度远高于CPT-11的代谢物SN38，在给药0.25h和1h，其浓度是CPT-11的代谢物SN38的6倍，说明新型喜树碱衍生物A具有肿瘤靶点性在肿瘤组织中分布更高，同时由于新型喜树碱衍生物A在正常细胞中的浓度明显低于CPT-11，因此，新型喜树碱衍生物A相比CPT-11表现出对肿瘤细胞更强的抗肿瘤活性和对正常细胞更低的毒性，进一步印证新型喜树碱衍生物A相比CPT-11更适宜作为抗肿瘤药物给药。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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