一测多评法测定丹红化瘀制剂成分含量的方法
阅读说明：本技术 一测多评法测定丹红化瘀制剂成分含量的方法 (Method for determining contents of components of Danhong Huayu preparation by one-test-multiple-evaluation method ) 是由 唐清 匡艳辉 林娟 王德勤 李楚源 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种一测多评法测定丹红化瘀制剂成分含量的方法,以新橙皮苷为内标,建立新橙皮苷与参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B之间的相对校正因子,通过只测定新橙皮苷的含量,用相对校正因子计算出另外五种成分的含量,建立全面的可控制丹红化瘀制剂的质量标准。(The invention discloses a method for determining the component content of a danhong Huayu preparation by a one-test-multiple-evaluation method, which takes neohesperidin as an internal standard, establishes relative correction factors between the neohesperidin and sodium ginsengenin, protocatechualdehyde, salvianolic acid D, naringin and salvianolic acid B, calculates the content of other five components by only determining the content of the neohesperidin and using the relative correction factors, and establishes a comprehensive quality standard for controlling the danhong Huayu preparation.)
技术领域：
本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一测多评法测定丹红化瘀制剂成分含量的方法。
背景技术：
“一测多评”法(quantitative analysis ofmulti-components by single-marker,QAMS)是一种通过只测定某个代表性的成分(有效、廉价、易得)，同时可以计算出其他待测的有效成分的含量，使其计算值与实际值符合定量方法学要求的质量控制方法。“一测多评”法能够较好的解决中药质量控制中缺乏对照品这一瓶颈问题，且能够较好完成不稳定成分定量评价，具有检测成本低、分析效率高的优点。
丹红化瘀制剂主要由丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡、枳壳七味原料药组成，包括但不限于丹红化瘀口服液、丹红化瘀汤或丹红化瘀片、丹红化瘀颗粒、丹红化瘀胶囊、丹红化瘀滴丸等药学上可接受的剂型。
其中丹红化瘀口服液为广州白云山和记黄埔中药有限公司独家品种(国药准字Z10960051)，目前2015年版《中国药典》第一部收录了其质量标准，包括丹参、柴胡、当归、川芎等药材的薄层鉴别以及HPLC法测定原儿茶醛含量。目前尚未见丹红化瘀制剂一测多评法的研究报道。
丹红化瘀制剂由多种药材制成，有效成分复杂，将一测多评方法用于其中是否适合，以及如何进行其中的有效成分分析成为一个问题。本发明人对此进行了研究，并选择了药理活性明确且含量比较丰富的几种成分(分别为新橙皮苷、参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B)进行测定。在开发一测多评方法时，目标化合物的选择将严重影响测定方法的可靠性和实用性，目前没有筛选目标化合物的科学方法。在一测多评的研究中，由于分析物含量是由内标物和其他化合物之间的相对校正因子计算获得，而相对校正因子的稳定性会影响最终的含量测定结果的准确性，所以选择哪个成分作为内标物也是一个关键问题。本发明人对此进行了研究，找到了一种稳定的化合物作为内标物，发现该类化合物特别适合用于丹红化瘀制剂的一测多评方法，从而解决了相关的技术问题。
发明内容
：针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明提供一种实用性高、操作简单、节约成本、稳定可控的一测多评法测定丹红化瘀制剂成分含量的方法，该方法以更加稳定的新橙皮苷为内标，建立新橙皮苷与参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B之间的相对校正因子，通过只测定新橙皮苷的含量，用相对校正因子计算出另外五种成分的含量，建立全面的可控制丹红化瘀制剂的质量标准，检测结果更加稳定可控。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一测多评法测定丹红化瘀制剂成分含量的方法，以新橙皮苷为内标，建立新橙皮苷与丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B之间的相对校正因子，通过只测定新橙皮苷的含量，用相对校正因子计算出另外五种成分的含量，采用液相色谱法进行测定，色谱与系统适用性试验条件：C18色谱柱；流动相以乙腈为流动相A，0.2-0.8wt％优选0.5wt％甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱程序，梯度条件为：0～25min，5-12％A；25～30min，12～15％A；30～70min，15～25％A；流速0.8-1.2mL/min，优选为1mL/min；检测波长280nm～290nm，优选为286nm，柱温28-32℃，优选为30℃。
丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸B、柚皮苷的含量的计算公式如下：
含量(mg/g)＝(CS/W)×(AU/AS)×V×D×F
CS新橙皮苷对照品的浓度(mg/mL)；
W样品取样量(g)；
AU样品中其他成分的峰面积；
AS新橙皮苷对照品的峰面积；
V提取溶剂的体积(mL)；
D稀释倍数；
F相对校正因子；
其中相对校正因子F的计算公式如下：
式中，AS为新橙皮苷对照品的峰面积，WS为新橙皮苷对照品的浓度或质量，AK为某待测成分的峰面积；WK为某待测成分的浓度或质量。
优选地，丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B的相对较正因子范围分别为0.1-15、0.1-15、0.1-15、0.1-15、0.1-15。
优选地，丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B的相对校正因子分别为3.173±0.30、0.461±0.30、1.728±0.30、1.252±0.30、1.498±0.30。
特别优选地，丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B的相对校正因子分别为3.173±0.15、0.461±0.15、1.728±0.15、1.252±0.15、1.498±0.15。
供试品溶液的制备：取丹红化瘀制剂，置于容量瓶或锥形瓶中，加50wt％～90wt％优选为80wt％甲醇水溶液至每1ml溶液中中含有0.1ml丹红化瘀制剂，摇匀，过微孔滤膜，即得供试品溶液。所述微孔滤膜为0.45μm微孔滤膜。
丹红化瘀制剂主要由丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡、枳壳七味原料组成，包括但不限于丹红化瘀口服液、丹红化瘀汤、丹红化瘀片、丹红化瘀颗粒、丹红化瘀胶囊、丹红化瘀滴丸、丹红化瘀膏等药学上可接受的制剂。
对照品溶液的制备：分别精确称取6种对照品适量，用80wt％甲醇水溶液配置成一定浓度的丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、新橙皮苷、丹酚酸B的混合标准品溶液。
本发明的有益效果如下：本发明以新橙皮苷为内标，建立新橙皮苷与参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B之间的相对校正因子，通过只测定新橙皮苷的含量，用相对校正因子计算出另外五种成分的含量，简便快捷、全面准确且灵敏度高，节约检测成本和时间，提高了工作效率，建立全面的可控制丹红化瘀制剂的质量标准，检测结果更加稳定可控。
附图说明：
图1是混合对照品和丹红化瘀口服液的HPLC图；
其中，a、混合对照品的HPLC图，b、丹红化瘀口服液的HPLC图，1、丹参素钠，2、原儿茶醛，3、丹酚酸D，4、柚皮苷，5、新橙皮苷，6、丹酚酸D。
具体实施方式
：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本实施例丹红化瘀制剂为丹红化瘀口服液
仪器：美国Waters公司2695高效液相色谱仪；戴安U3000；色谱柱：Waters XBridge(250mm×4.6mm，5μm)；CP225D型十万分之一天平(德国sartorius公司)；BT 214D型万分之一天平(德国sartorius公司)
材料：实验共收集30批丹红化瘀口服液样品，均为广州白云山和记黄埔中药有限公司生产提供，丹参素钠(批号：110855-201614，纯度：98.1％)、原儿茶醛(批号：110810-201608，纯度：99.3％)、橙皮苷(批号：110721-201115，纯度：95.3％、批号：110721，纯度：96.2％)、新橙皮苷(批号：111857-201703，纯度：99.2％)、丹酚酸B(批号：111562-201716，纯度：94.1％)、购自中国药品生物制品检定所，柚皮苷(批号：Y-006-171216，纯度：>98％)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；甲酸为色谱纯(科密欧公司)；甲醇为分析纯(广州化学试剂厂)；水为蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
方法与结果：
色谱条件：Waters Xbridge(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.5％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～25min，5％→12％A；25～30min，12％→15％A；30～70min，15％→25％A；流速1.0mL/min；检测波长286nm，柱温30℃；进样量10μL。上述色谱条件下，各待测成分分离度较好，见图1。本发明中，丹酚酸D及柚皮苷出峰时间接近，在Waters Xbridge色谱柱上能较好分离(分离度>1.5)。
对照品溶液的制备：分别精确称取6种对照品适量、用80wt％甲醇水溶液配置成丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、新橙皮苷、丹酚酸B浓度分别约为400、25、70、70、70、25μg/mL的混合标准品溶液。
供试品溶液的制备：取丹红化瘀口服液，精密量取1ml，置10ml容量瓶，加80wt％甲醇水溶液至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤过，取续滤液，即得。
内标物的选择：
新橙皮苷为本产品中含量较高、分离度好且出峰位置处于色谱图中间部分的成分，选择新橙皮苷作为内标物可以减少其他色谱峰相对保留时间的误差以及相对峰面积的误差。
选择丹酚酸B作为内标，进行一测多评含量分析，相对保留时间见表1，计算12批次含量如表2所示。从表中可知，用丹酚酸B作为内标时，因为其峰面积较小、含量较低，使得计算其他物质的含量时容易产生误差，原儿茶醛的外标法与、一测多评法的相对平均偏差(％)较大。故选择丹酚酸B作为内标物不适合。
所以在本发明中，通过和酚酸类成分的比较，最终选择了黄酮类的新橙皮苷作为内标物。是因为通过实验研究发现，新橙皮苷是本产品中含量较高、分离度好且出峰位置处于色谱图中间部分的成分，作为内标物可以减少其他色谱峰相对保留时间的误差以及相对峰面积的误差。而选择丹酚酸B作为内标，进行一测多评含量分析，因为其峰面积较小、含量较低，使得计算其他物质的含量时容易产生误差，相对平均偏差较大。故最终选择了结构相对稳定、研究结果误差在可控范围的新橙皮苷作为内标物。
表1不同仪器相对保留时间结果
表2丹红化瘀口服液中6种成分不同方法测定结果(mg/ml)
方法学考察：
线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，以峰面积A为纵坐标，进样量C为横坐标进行回归分析，结果见表3。
表3六个成分的回归方程及线性范围
精密度试验：精密吸取混合对照品10μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、新橙皮苷、丹酚酸B的峰面积，计算RSD。结果各成分峰面积RSD(n＝6)分别为1.23％、1.49％、0.68％、1.62％、2.21％、0.42％，表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取同一份丹红化瘀口服液供试液分别于0、2、4、6、8、12、24、48h进样分析，计算得丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、新橙皮苷、丹酚酸B峰面积的RSD分别为1.24％、1.57％、1.29％、0.59％、2.41％、0.61％，结果表明供试品溶液在48h内稳定。
重复性试验：取同一批丹红化瘀口服液制备6份供试液，按上述色谱条件进样分析，测定6份供试液中丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、新橙皮苷、丹酚酸B的平均含量为4.2894、0.4200、0.8409、1.7650、1.0760、0.3774mg/ml，RSD分别为1.33％、1.16％、1.35％、1.34％、1.22％、1.23％，结果表明方法重复性良好。
加样回收率试验：分别精密量取同一批次丹红化瘀口服液0.5ml 6份，加入含丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、新橙皮苷、丹酚酸B浓度为2.145、0.21、0.3921、0.8645、0.5415、0.1905mg/ml的80wt％甲醇溶液1ml，按照供试品溶液制备方法制备供试品，按上述色谱条件进样分析，测定各成分含量，计算加样回收率。上述各成分的平均加样回收率分别为：97.12％、101.34％、102.27％、100.73％、101.37％、92.54％，RSD分别为3.12％、2.88％、2.37％、2.24％、2.86％、3.65％，结果表明该方法准确度良好。
待测成分相对校正因子的计算：
精密吸混合对照品溶液0.5、1、2、5、10、15、20μl，按上述色谱条件进样分析，记录各色谱峰峰面积。以新橙皮苷为内标，按照公式计算相对校正因子(f)＝(Ai×Cr)/(Ar×Ci)[Ai为内标的峰面积；Ar为待测成分的峰面积；Ci为内标的浓度；Cr为待测成分的浓度)，计算不同浓度时丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B的相对校正因子，结果见表4。
表4丹红化瘀口服液中六种成分的相对校正因子测定结果
一测多评耐用性评价：
不同仪器相对较正因子的影响：分别考察了Waters e2695和U3000两台仪器上的丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B的相对校正因子结果，结果见表5，结果表明各成分相对校正因子的RSD均<4％，表示不同的仪器对各成分相对校正因子无显著影响。
表5不同仪器对各成分相对校正因子的影响
待测组分色谱峰的定位：
精密吸取混合对照品溶液，在Waters e2695和U3000两台仪器中，分别测定并计算待测成分丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B的相对保留值。结果表明不同品牌色谱仪对相对保留时间的影响较小(RSD<5％)，见表6，因此，可根据相对保留值法对各成分的色谱峰进行定位。
表6不同仪器相对保留时间结果
一测多评法与外标法测定结果的比较：
各吸取30个批次的丹红化瘀口服液供试品溶液10μL，进样分析，采用一测多评法和外标法计算丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、柚皮苷、丹酚酸B的含量，结果见表7。结果表明，两种方法所测得的含量无明显差异(RAD<4％)，说明一测多评法可用于丹红化瘀口服液多成分含量测定。
表7丹红化瘀口服液中6种成分不同方法测定结果(mg/ml)
实施例2：
参考实施例1，不同之处在于丹红化瘀口服液用丹红化瘀汤代替。
丹红化瘀汤，其活性成分由2015年版《中国药典》第一部677页丹红化瘀口服液项下的丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡、枳壳七味原料组成：
制备方法如下：将丹参等七味原料，加水煎煮两次，第一次加入8-10倍量水，煎煮半小时，第二次5-8加入倍量水，煎煮20分钟，合并两次滤液，过滤，即得丹红化瘀汤。或浓缩成稠膏，即得丹红化瘀膏。
实施例3：
参考实施例1，不同之处在于丹红化瘀口服液用丹红化瘀片代替。
丹红化瘀片，其活性成分由2015年版《中国药典》第一部677页丹红化瘀口服液项下的丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡、枳壳七味原料组成：
制备方法如下：将丹参等七味原料，加水煎煮两次，每次半小时，过滤，合并两次滤液，滤液低温浓缩至稠膏状，或浓缩成相对密度为的清膏，干燥，加辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，即得丹红化瘀颗粒。或压制成片或包薄膜衣，即得丹红化瘀片。
实施例4：
参考实施例1，不同之处在于丹红化瘀口服液用丹红化瘀滴丸代替。
丹红化瘀片，其活性成分由2015年版《中国药典》第一部677页丹红化瘀口服液项下的丹参、当归、川芎、桃仁、红花、柴胡、枳壳七味原料组成：
制备方法如下：将丹参等七味原料，加水煎煮两次，每次半小时，过滤，合并两次滤液，滤液低温浓缩至稠膏状，或浓缩成相对密度为的清膏，干燥，加辅料适量，混匀，泛丸，干燥，即得丹红化瘀滴丸。