用于检测脂溶性维生素的试剂盒
阅读说明：本技术 用于检测脂溶性维生素的试剂盒 (Kit for detecting fat-soluble vitamins ) 是由 韦弢 倪君君 张同兰 谭琛 彭孝枝 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒,包括：至少三瓶脂溶性维生素的校准品、至少三瓶脂溶性维生素的质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂和提取液,其中,提取液用于提取待处理样品中的脂溶性维生素；至少三瓶脂溶性维生素的校准品和至少三瓶脂溶性维生素的质控品均为脂溶性维生素的冻干品,其中,脂溶性维生素包括维生素A和维生素E；混合内标蛋白沉淀剂包括：含有蛋白沉淀剂、维生素A-d3内标物和维生素E-d6内标物的混合溶液；流动相添加剂包括：含有甲酸的甲醇溶液。本发明能够提高试剂盒中脂溶性维生素的稳定性。(The invention provides a kit for detecting fat-soluble vitamins, comprising: the method comprises the following steps of (1) calibrating at least three bottles of fat-soluble vitamins, quality control products of at least three bottles of fat-soluble vitamins, a mixed internal standard protein precipitator, a mobile phase additive and an extracting solution, wherein the extracting solution is used for extracting the fat-soluble vitamins in a sample to be treated; at least three bottles of calibrator of fat-soluble vitamins and at least three bottles of quality control products of the fat-soluble vitamins are freeze-dried products of the fat-soluble vitamins, wherein the fat-soluble vitamins comprise vitamin A and vitamin E; the mixed internal standard protein precipitant comprises: a mixed solution containing a protein precipitant, a vitamin A-d3 internal standard and a vitamin E-d6 internal standard; the mobile phase additive comprises: a methanol solution containing formic acid. The invention can improve the stability of fat-soluble vitamins in the kit.)
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于检测脂溶性维生素的试剂盒。
背景技术
脂溶性维生素是食品中天然存在的微量营养素，可以提供和维持必需的和广泛的生理生化功能。其中，脂溶性维生素A是酶的辅基和酶的组成不断，对生物体的新陈代谢起调节作用，是生长和发育不可或缺的重要营养元素之一。脂溶性维生素E是生育酚与三烯生育酚的总称，参与脂肪的代谢，维持内分泌的正常机能。
目前，用于检测脂溶性维生素的试剂盒中的脂溶性维生素的稳定性通常较差，因此，需要低温冷冻保存、超低温保存甚至是充氮保存。但是，试剂盒中的脂溶性维生素在上述条件保存时降解速度依然较快，从而导致提高试剂盒中脂溶性维生素的稳定性的效果较差。
发明内容
本发明提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒，能够提高试剂盒中脂溶性维生素的稳定性。
本发明实施例提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒，包括：
至少三瓶脂溶性维生素的校准品、至少三瓶脂溶性维生素的质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂和提取液，其中，所述提取液用于提取待处理样品中的脂溶性维生素；
所述至少三瓶脂溶性维生素的校准品和所述至少三瓶脂溶性维生素的质控品均为脂溶性维生素的冻干品，其中，脂溶性维生素包括维生素A和维生素E；
所述混合内标蛋白沉淀剂包括：含有蛋白沉淀剂、维生素A-d3内标物和维生素E-d6内标物的混合溶液；
所述流动相添加剂包括：含有甲酸的甲醇溶液。
本发明中所提供的试剂盒中的脂溶性维生素的校准品和脂溶性维生素的质控品均为冻干品，均可以放置于棕色安剖瓶中，加入水溶液即可复溶，具有即用即溶、使用方便、不易降解以及便于长途运输的优势。
具体地，每一瓶脂溶性维生素的校准品之间同一种脂溶性维生素的含量不同，每一瓶脂溶性维生素的质控品之间同一种脂溶性维生素的含量也不同。
具体地，所述试剂盒于2℃-8℃条件下，避光密闭储存，以利于提高试剂盒中脂溶性维生素的稳定性。
具体地，为了更准确地检测出待测样品中脂溶性维生素的浓度，所述混合内标蛋白沉淀剂中的内标物均为每一种脂溶性维生素的同位素，可以避免在对目标物检测时内标物与目标物发生反应，而影响目标物的检测。
优选地，所述蛋白沉淀剂包括：乙醇溶液和/或甲醇溶液。
具体地，所述混合内标蛋白沉淀剂中的蛋白沉淀剂既可以用于溶解维生素A-d3内标物和维生素E-d6内标物，同时又可以更好地去除杂质，对目标物进行提纯。所述蛋白沉淀剂包括单一的乙醇溶液、单一的甲醇溶液或者乙醇溶液与甲醇溶液任意比例混合后的溶液。
优选地，所述流动相添加剂包括：流动相添加剂A和流动相添加剂B；
当用于检测待处理样品的洗脱流动相A包括甲醇溶液时，所述流动相添加剂A包括含有2％-4％甲酸的甲醇溶液；
当用于检测待处理样品的洗脱流动相B包括含有乙腈的甲醇溶液时，所述流动相添加剂B包括含有3％-5％甲酸的甲醇溶液。
针对流动相添加剂A中的甲酸来说，2％-4％是指2％至4％范围内的任一比例，比如，含有2％、2.5％、3％、3.5％以及4％甲酸。
针对流动相添加剂B中的甲酸来说，3％-5％是指2％至4％范围内的任一比例，比如，含有3％、3.5％、4％、4.5％以及5％甲酸。
具体地，采用质谱条件检测脂溶性维生素时，为了保证更好的质子化效果，通常需要在洗脱流动相中加入易挥发性的酸，如三氟乙酸、乙酸和甲酸。由于长期使用三氟乙酸，容易污染仪器，不易冲洗，甚至影响仪器在负源情况下的响应。同时由于乙酸在低于20℃时易结晶，因此选择洗脱流动相中的添加剂为甲酸。同时，为了保证获得峰形完好的脂溶性维生素的色谱图，因此选择流动相添加剂A包括含有2％-4％甲酸的甲醇溶液，流动相添加剂B包括含有3％-5％甲酸的甲醇溶液。
优选地，为了保证从待测样品中提取的脂溶性维生素浓度，所述提取液包括：含有0.5％-3％乙醇的正己烷溶液或者含有0.5％-3％乙醇的环氧乙醚。
针对提取液中的乙醇来说，0.5％-3％是指0.5％至3％范围内的任一比例，比如，含有0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％以及3％乙醇。
优选地，所述脂溶性维生素的冻干品包括：牛血清蛋白、赋形剂、抗氧化剂、助溶剂和脂溶性维生素。
具体地，为了降低基质效应，提高检测结果的准确性，因此选择了代替基质为牛血清蛋白。为了解决维生素A和维生素E易氧化的问题，在脂溶性维生素的冻干品中加入了抗氧化剂。为了保证脂溶性维生素的冻干品中的脂溶性维生素能够很好的复溶，在该脂溶性维生素的冻干品中加入了助溶剂。
优选地，所述脂溶性维生素的冻干品通过下述操作得到：
将所述牛血清蛋白、所述赋形剂、所述抗氧化剂、所述助溶剂和纯化水在避光密闭的条件下混匀，得到混合物；
将所述脂溶性维生素加入到所述混合物中并在避光密闭的条件下混匀，得到半成品；
将所述半成品在波长大于500nm的光线条件以及预设的冻干条件下进行冻干，获得脂溶性维生素的冻干品。
具体地，将所述牛血清蛋白、所述赋形剂、所述抗氧化剂、所述助溶剂和纯化水在常温(20-25℃)常压密封且避光的容器(比如，棕色圆底烧瓶、棕色流动相瓶)中搅拌混匀，可以在1500rpm-2000rpm的转速下搅拌15-20 min得到混合物；然后再加入脂溶性维生素在同样的条件下进行搅拌混匀，在1000rpm-1500rpm的转速下搅拌12-20min得到半成品。
具体地，需要将所述混合物的pH调节至pH6.8～pH7.6范围内，以用于模拟待检测血液的pH环境，从而进一步提高利用该试剂盒对待检测血液中的脂溶性维生素进行检测的准确性。
具体地，在牛血清蛋白、赋形剂、抗氧化剂、助溶剂和纯化水混匀后再加入脂溶性维生素混匀，可以在保证混匀的前提下有效减少脂溶性维生素的混匀时间，从而缩短脂溶性维生素的暴露时间，减少脂溶性维生素的降解，进一步提高了该脂溶性维生素冻干品中脂溶性维生素的稳定性。
具体地，可以将半成品在波长大于500nm的光线条件下进行分装入瓶 (比如，棕色安剖瓶等避光可密闭的瓶子)中，然后加半塞，并在预设的冻干条件下进行冻干，直接获得试剂盒中的脂溶性维生素的校准品和脂溶性维生素的质控品。其中，加半塞是为了保证半成品中的水分在预设的冻干条件中可以顺利去除。也可以将半成品在波长大于500nm的光线条件以及预设的冻干条件下进行冻干，获得脂溶性维生素的冻干品，再进行分装入瓶获得试剂盒中的脂溶性维生素的校准品和脂溶性维生素的质控品。
具体地，由于维生素A和维生素E对光敏感，易氧化降解，在波长大于 500nm的光线条件下，即革除紫外线以及500nm以下的蓝紫光，可以有效降低维生素A和维生素E的降解。比如，可以使用防紫外线黄色安全灯达到上述光线条件。
优选地，所述冻干条件包括：
在-50℃～-30℃下冷冻2-5h，并在-35℃～-20℃下升华6-12h，然后在0℃～10℃下解析干燥3-5h，以及在15℃～25℃下加强干燥3-10h。
具体地，可以利用真空冷冻干燥机对上述半成品进行冻干，首先将真空冷冻干燥机在-30℃～-50℃下预冷1-3h，为该半成品提供一个稳定的低温环境；然后将该半成品置于冷冻干燥机中，在-50℃～-30℃下冷冻2-5h，并在 -35℃～-20℃下升华6-12h，然后在0℃～10℃下解析干燥3-5h，以及在15℃～25℃下加强干燥3-10h，如此，在真空下进行干燥，该半成品处于高度缺氧状态下，使易氧化的脂溶性维生素得到了充分保护。
具体地，升华可以直接将90％左右的水分从冷冻后的固体半成品中去除，同时保留了原有的固体骨架结构，呈海绵状，且所得制品的复水性极好。为了改善脂溶性维生素冻干品的贮存稳定性，延长其保护期，需要通过解析干燥去除结合水。为了进一步确保结合水的充分去除，采用加强干燥对残留的结合水进行更彻底的去除。
优选地，当所述赋形剂包括甘露醇时，其中，甘露醇与所述牛血清蛋白的质量比包括14:100-24:100。
针对赋形剂包括甘露醇时，甘露醇与牛血清蛋白的质量比包括 14:100-24:100，14:100-24:100是指14:100至24:100范围内的任一比例，比如，14:100、16:100、18:100、20:100、22:100以及24:100.
优选地，当所述抗氧化剂包括二丁基羟基甲苯和丁基羟基茴香醚时，其中，所述二丁基羟基甲苯与所述牛血清蛋白的质量比包括9:100-12:100，所述丁基羟基茴香醚与所述牛血清蛋白的质量比包括9:100-12:100。
针对抗氧化剂包括二丁基羟基甲苯和丁基羟基茴香醚时，甘二丁基羟基甲苯与所述牛血清蛋白的质量比包括9:100-12:100，丁基羟基茴香醚与牛血清蛋白的质量比包括9:100-12:100，其中，9:100-12:100是指9:100至12:100 范围内的任一比例，比如，9:100、10:100、11:100以及12:100。
具体地，抗氧化剂同时选用二丁基羟基甲苯(BHT)和丁基羟基茴香醚 (BHA)，由于BHA对热稳定，在弱碱条件下不易被破坏，与金属离子作用不着色；而且BHT稳定性高，抗氧化能力强，同时使用BHT和BHA可以进一步保护维生素A不被氧化，提高试剂盒中脂溶性维生素的稳定性。
优选地，当所述助溶剂包括卵磷脂和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯时，所述卵磷脂与所述牛血清蛋白的质量比包括0.2:100-0.5:100，所述聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯与所述牛血清蛋白的质量比包括0.16:100-0.26:100。
针对助溶剂包括卵磷脂和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯时，卵磷脂与牛血清蛋白的质量比包括0.2:100-0.5:100，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯与牛血清蛋白的质量比包括0.16:100-0.26:100，其中，0.2:100-0.5:100是指0.2:100至0.5:100 范围内的任一比例，比如，0.2:100、0.3:100、0.4:100以及0.5:100； 0.16:100-0.26:100是指0.16:100至0.26:100范围内的任一比例，比如，0.16:100、 0.18:100、0.20:100、0.22:100、0.24:100以及0.26:100。
具体地，当助溶剂同时包括卵磷脂和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯时，可以实现脂溶性维生素的冻干品的快速复溶，而且提高了该脂溶性维生素的冻干品中脂溶性维生素的稳定性。
优选地，试剂盒进一步包括：用于对待处理样品进行前处理的复溶液，其中，复溶液包括含有0％-20％水的甲醇溶液。
针对复溶液来说，0％-20％是指0％至20％范围内的任一比例，比如，含有0％、5％、10％和15％以及20％的水。
本发明提供的用于检测脂溶性维生素的试剂盒，该试剂盒中包括：至少三瓶脂溶性维生素的校准品、至少三瓶脂溶性维生素的质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂和用于提取待处理样品中的脂溶性维生素的提取液，而且脂溶性维生素的校准品和脂溶性维生素的质控品均为脂溶性维生素的冻干品，脂溶性维生素包括维生素A和维生素E。本发明所提供的试剂盒中的脂溶性维生素具有更高的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一个实施例提供的一种用于检测脂溶性维生素的试剂盒的示意图；
图2是本发明一个实施例提供的一种脂溶性维生素的冻干品的制备方法的流程图；
图3是本发明一个实施例提供的一种基于试剂盒的脂溶性维生素的检测方法的流程图；
图4是本发明一个实施例提供的基于试剂盒检测维生素A的线性关系图；
图5是本发明一个实施例提供的基于试剂盒检测维生素E的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，由于维生素A和维生素E易氧化，而且易收到光、氧、金属离子对其的影响，现有的用于检测脂溶性维生素的试剂盒中的脂溶性维生素通常为液体状态，为了提高其中脂溶性维生素的稳定性，需要低温冷冻保存、超低温保存甚至是充氮保存，但是采用这种方式保存的试剂盒中的液体脂溶性维生素的稳定性仍较差。
本发明一个实施例提供了一种用于检测脂溶性维生素的试剂盒，包括：
至少三瓶脂溶性维生素的校准品、至少三瓶脂溶性维生素的质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂和提取液，其中，所述提取液用于提取待处理样品中的脂溶性维生素；
至少三瓶脂溶性维生素的校准品和至少三瓶脂溶性维生素的质控品均为脂溶性维生素的冻干品，其中，脂溶性维生素包括维生素A和维生素E；
混合内标蛋白沉淀剂包括：含有蛋白沉淀剂、维生素A-d3内标物和维生素E-d6内标物的混合溶液；
流动相添加剂包括：含有甲酸的甲醇溶液。
本发明提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒，该脂溶性维生素的试剂盒中包括：至少三瓶脂溶性维生素的校准品、至少三瓶脂溶性维生素的质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及用于提取待处理样品中的脂溶性维生素的提取液，其中，脂溶性维生素的校准品和脂溶性维生素的质控品均为冻干品，即用即溶解、使用方便、不易降解且便于长途运输，该试剂盒中的脂溶性维生素具有较高的稳定性。
下面以几个实施例对本发明所提供的用于检测脂溶性维生素的试剂盒进行详细说明。
实施例1：用于检测脂溶性维生素的试剂盒
试剂盒主要组成成分如表1所示：
表1
组成成分
组分标识
剂型
规格
脂溶性维生素校准品
C1、C2、C3、C4、C5、C6
固体
6瓶
脂溶性维生素质控品
QC(L)、QC(M)、QC(H)
固体
3瓶
混合内标蛋白沉淀剂
P14
液体
24mL×1瓶
流动相添加剂A
A10
液体
8mL×1瓶
流动性添加剂B
B11
液体
8mL×1瓶
提取液
T12
液体
24mL×1瓶
复溶液
F13
液体
12mL×1瓶
具体地，脂溶性维生素校准品和脂溶性维生素质控品在分别加入500μL 水复溶后，其中每一种脂溶性维生素的浓度如下所示：
脂溶性维生素的校准品C1：维生素A为0.0281±0.005μg/mL，维生素 E为1.125±0.23μg/mL；
脂溶性维生素的校准品C2：维生素A为0.1125±0.02μg/mL，维生素E 为2.25±0.45μg/mL；
脂溶性维生素的校准品C3：维生素A为0.225±0.02μg/mL，维生素E 为4.5±0.5μg/mL；
脂溶性维生素的校准品C4：维生素A为0.45±0.05μg/mL，维生素E 为9.0±0.9μg/mL；
脂溶性维生素的校准品C5：维生素A为0.9±0.1μg/mL，维生素E为 18±1.8μg/mL；
脂溶性维生素的校准品C6：维生素A为1.8±0.2μg/mL，维生素E为 36±3.6μg/mL；
脂溶性维生素质控品QC(L)：维生素A为0.2±0.02μg/mL，维生素E为 5±0.5μg/mL；
脂溶性维生素质控品QC(M)：维生素A为0.6±0.06μg/mL，维生素E 为15±1.5μg/mL；
脂溶性维生素质控品QC(H)：维生素A为1.2±0.12μg/mL，维生素E为 30±3μg/mL；
混合内标蛋白沉淀剂P14：含有0.2μg/mL维生素A-d3内标物和0.5μg/mL 维生素E-d6内标物的乙醇混合溶液；
流动相添加剂A(A10)为含有2.5％甲酸的甲醇溶液；
流动相添加剂B(B11)为含有4％甲酸的甲醇溶液；
提取液T12为含有1％乙醇的正己烷溶液；
复溶液F13为含有2％水的甲醇溶液；
该试剂盒中进一步包括：使用说明书、合格证、内衬、包装盒、EP管、 96孔板、热封膜、与试剂盒的使用、储存、运输过程相关的说明中的至少一个。
具体地，该脂溶性维生素的检测试剂盒的示意图如图1所示，其中，脂溶性维生素校准品与脂溶性维生素质控品为冻干品，使用时请按照使用说明书操作，分别加入水溶液复溶后为0.5mL/瓶；该试剂盒组分均在2～8℃条件下，避光、密闭储存。
需要说明的是，使用说明书上记载有实施例3中的检测方法；通过实施例2中的制备方法可以制备得到脂溶性维生素的校准品和脂溶性维生素的质控品。
实施例2：脂溶性维生素的冻干品的制备方法
本发明实施例提供了基于上述实施例1中的试剂盒的脂溶性维生素的冻干品的制备方法，如图2所示，包括：
步骤201：将牛血清蛋白、赋形剂、抗氧化剂、助溶剂和纯化水在避光密闭的条件下混匀，得到混合物；
步骤202：将脂溶性维生素加入到混合物中并在避光密闭的条件下混匀，得到半成品；
步骤203：将半成品在波长大于500nm的光线条件以及预设的冻干条件下进行冻干，获得脂溶性维生素的冻干品。
具体地，赋形剂包括甘露醇，甘露醇与牛血清蛋白的质量比包括20:100；抗氧化剂包括二丁基羟基甲苯和丁基羟基茴香醚，二丁基羟基甲苯与牛血清蛋白的质量比包括10:100，丁基羟基茴香醚与牛血清蛋白的质量比包括 10:100；助溶剂包括卵磷脂和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，卵磷脂与牛血清蛋白的质量比包括0.4:100，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯与牛血清蛋白的质量比包括0.2:100。
具体地，将50g牛血清蛋白、10g甘露醇、5g二丁基羟基甲苯、5g丁基羟基茴香醚、0.2g卵磷脂、0.1g聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯和1000g纯化水置于棕色圆底烧瓶中，并调节棕色圆底烧瓶中混合物的pH在pH6.8～pH7.6 范围内，然后在棕色圆底烧瓶20℃密闭的条件下采用磁力搅拌在1200rpm 的转速下搅拌15min，得到混合物；再根据实施例1中校准品和质控品中维生素的含量加入相应质量的脂溶性维生素，在20℃密闭的条件下采用磁力搅拌在1200rpm的转速下搅拌5min，得到半成品；
在使用防紫外线黄色安全灯且洁净无尘的环境下，将半成品分装至棕色安剖瓶中，加半塞，然后将装瓶的半成品置于已在-50℃预冷2h的真空冷冻干燥机中，先在-50℃下冷冻3h，再在-25℃下升华7h，然后在10℃下解析干燥3h，以及在20℃下加强干燥5h，将棕色安剖瓶塞紧密封，即获得试剂盒中的脂溶性维生素的校准品和脂溶性维生素的质控品。
实施例3：脂溶性维生素的检测方法
本发明实施例提供了基于上述实施例1中的试剂盒的脂溶性维生素的检测方法，如图3所示，包括：
步骤301：分别向试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素的校准品中加入水溶液复溶，得到至少三种浓度的标准工作液；
步骤302：分别向至少三种浓度的标准工作液中加入试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂，得到至少三种浓度的标准溶液，其中，至少三种浓度的标准溶液中的混合内标蛋白沉淀剂的量相同；
步骤303：利用试剂盒中的流动相添加剂配制流动相；
步骤304：利用液质联用仪和流动相在预设的检测条件下分别检测每一种标准溶液，获得每一种标准溶液对应的第一检测结果；
步骤305：根据各个第一检测结果、标准溶液中的每一种脂溶性维生素的浓度以及混合内标蛋白沉淀剂中每一种脂溶性维生素的内标物的浓度，拟合每一种脂溶性维生素所对应的标准曲线方程；
步骤306：利用试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素的质控品确定标准曲线方程的斜率和截距是否分别在预设的范围内；
步骤307：如果是，对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
步骤308：向第一上清液内加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂，涡旋混匀并离心，取离心后的上层溶液作为待测样品；
步骤309：利用液质联用仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；
步骤310：基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。
在本发明实施例中，利用用于检测脂溶性维生素的试剂盒可以得到至少三个浓度的脂溶性维生素的标准溶液，通过液质联用仪对含有不同浓度的脂溶性维生素的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有脂溶性维生素的内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的脂溶性维生素的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到每一个脂溶性维生素的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂，进行涡旋混匀，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用液质联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。如此通过试剂盒实现同时对脂溶性维生素的快速检测。
需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆。
具体地，检测条件包括：
检测条件中的液相条件，包括：
色谱柱包括但限于C18色谱柱，填料粒径为2.7μm，内径为3.0mm，长度为50mm；
柱温包括25-35℃；流速包括0.3-0.6mL/min，进样量为1-10μL。
检测条件中的质谱检测条件，包括：
液质联用仪采用ESI离子源，正离子扫描模式，多反应监测模式，离子喷雾电压：3000V-6000V；加热气温度：250-550℃；喷雾气电压：30-70psi；气帘气压力：20-50psi。
具体地，利用试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素质控品确定标准曲线方程的斜率和截距是否分别在预设的范围内，是利用标准曲线方程对至少三瓶脂溶性维生素质控品进行检测，判断检测得到的脂溶性维生素质控品的浓度是否在脂溶性维生素质控品的真实浓度(靶值)±1.96SD的范围内，如果是，则可用该标准曲线待测样品中的脂溶性维生素的浓度；否则表明该检测结果不准确，需要根据检测得到的脂溶性维生素质控品的浓度和脂溶性维生素质控品的真实浓度对该标准曲线的斜率和截距进行校正。
下面以几个实施例对基于实施例1中的试剂盒的脂溶性维生素的检测方法进行详细说明。
3.1、制备系列浓度的标准溶液
分别向实施例1中的六瓶脂溶性维生素校准品中加入0.5mL水溶液复溶，得到六种不同浓度的标准工作液，用移液器分别移取六种不同浓度的标准工作液200μL、试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂210μL分别置于96孔板各孔中，混合制成六种含有不同浓度的混合溶液，并且六种标准溶液中的内标物的量相同，再向上述混合溶液中加入萃取剂、试剂盒中的提取液进行涡旋混匀并离心，得到离心后的上层溶液即为标准溶液。
需要说明的是，不同浓度的标准溶液可按照处理待处理样品时的前处理操作获得，即，萃取剂、提取液、加入萃取剂后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间、复溶液、加入复溶液后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与实施例3.3中的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。
3.2、拟合标准曲线方程
利用液质联用仪对实施例3.1中六种标准溶液分别进行检测，得到六种不同浓度的脂溶性维生素的标准溶液的色谱图。
从上述脂溶性维生素的标准溶液色谱图中分别得到六种标准溶液中每一种脂溶性维生素以及混合内标蛋白沉淀剂中每一种脂溶性维生素的内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的每一种脂溶性维生素的峰面积与每一种脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述标准溶液中每一种脂溶性维生素的浓度与每一种脂溶性维生素的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为 y＝a*x+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。
具体地，可以分别得到针对维生素A的第一标准曲线方程，针对维生素E的第二标准曲线方程。
上述检测条件包括：
采用高效液相色谱-串联质谱检测系统，比如AB SCIEX Triple QuadTM 4500MD系统。
检测条件中的液相条件：
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18，填料粒径2.7μm，内径为3.0mm，长度为50mm；
流动相A为含有0.1％甲酸的水溶液；
流动相B为含有0.1％甲酸的甲醇溶液。
流动相A与流动相B的体积比：
0.00min：10％:90％；0.30min：10％:90％；
0.31min：2％:98％；4.00min：2％:98％；
4.01min：10％:90％；5.00min：10％:90％；
柱温为28℃；流速为0.4mL/min，进样量为5μL。
具体地，将试剂盒中的8mL流动相添加剂A(含有2.5％甲酸的甲醇溶液)加入到192mL纯化水中，得到流动相A；将试剂盒中的8mL流动相添加剂B(含有4％甲酸的乙腈溶液)加入到292mL含有25％乙腈的甲醇溶液中，得到流动相B。
检测条件中的质谱检测条件：
所述液质联用仪采用ESI离子源，正离子扫描模式，多反应监测模式；离子喷雾电压：5500V；加热气温度：450℃；喷雾气电压：40psi；气帘气压力：30psi。
3.3、待测样品的前处理
3.3.1：取待处理血液至少500μL，在离心速度为3000-3500rpm下离心 10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
3.3.2：用移液枪移取500μL步骤3.3.1中的血清或血浆于96孔板各孔中，然后加入100μL纯化水、200μL正己烷、210μL实施例1中的混合内标蛋白沉淀剂和200μL实施例1中的提取液后，将96孔板封膜(比如，利用封板膜进行封膜)，并在2000rpm的转速下涡旋混合8min后，再在4000rpm 的转速下离心15min后，取离心后的上层溶液(上层有机相)350μL，利用氮气将移取的上层溶液吹干，顺次加入100μL实施例1中的复溶液(含有 2％水的甲醇溶液)，在2000rpm的转速下涡旋混合4min，并在4000rpm 的转速下离心10min，取离心后的第二上清液20μL作为待测样品。
在本发明实施例中，采用96孔板可以实现待测样品的批量化前处理过程，同时处理多个待测样本，而且96孔板转置自动进样，从而进一步简化了脂溶性维生素的检测流程。
3.4、待测样品的检测
利用液质联用仪采用实施例3.2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中每一种脂溶性维生素的色谱峰面积和待测样品中每一种脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积，将待测样品中的每一种脂溶性维生素的色谱峰面积与每一种脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积作为纵坐标y，代入到实施例3.2的标准曲线方程为y＝a*x+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。具体地，根据第一标准曲线方程可以得到待测样品中维生素A的浓度，根据第二标准曲线方程可以得到待测样品中维生素E的浓度。
实施例4：针对半成品中脂溶性维生素的稳定性的说明
将实施例2中获得的针对实施例1中的试剂盒中的脂溶性维生素的校准品的半成品、脂溶性维生素的质控品的半成品分别封装后置于2℃～8℃的条件下保存，并分别在不同时间对半成品中每个浓度点选取三个样品按照实施例3中的方法进行检测，并利用均值计算检测获得的脂溶性维生素的实际浓度和理论投入脂溶性维生素浓度(靶值浓度)的百分比，如表2和表3所示，其中表2为半成品中的维生素A的实际浓度与靶值浓度的比值，表3为半成品中的维生素E的实际浓度与靶值浓度的比值。
表2
天数
C1
C2
C3
C4
C5
C6
QC(L)
QC(M)
QC(H)
0
100.5％
99.8％
100.2％
98.6％
97.5％
100.1％
99.2％
99.6％
97.9％
1
99.6％
100.1％
98.6％
99.1％
98.2％
100％
100.5％
97.2％
99.1％
3
100.2％
99.5％
99.2％
98.2％
99.3％
100.3％
99.1％
99％
98.7％
5
99.1％
98.6％
98％
97.3％
97.8％
99.2％
98.6％
97.9％
97.1％
7
98.1％
97.6％
96.8％
96.3％
95.8％
98.1％
96.4％
95.9％
96％
表3
天数
C1
C2
C3
C4
C5
C6
QC(L)
QC(M)
QC(H)
0
100.1％
99.8％
99.2％
100.6％
98.5％
100％
99.8％
98.6％
98.9％
1
100％
100.3％
99.3％
99.5％
99.2％
100.4％
99.7％
98.2％
99.1％
3
99.9％
100％
99.7％
98.4％
97.9％
98.2％
98.1％
97.9％
98.7％
5
97.3％
97.6％
98.8％
99％
98.8％
98.1％
97.6％
97.1％
97.3％
7
97.1％
96.4％
95.8％
95.8％
96.1％
96％
95.4％
96.7％
97％
由表2和表3可知，半成品在2℃～8℃的条件下放置5天时，维生素A 和维生素E的实际浓度与靶值浓度的相对偏差均未超过3％，放置7天时也未超过5％，因此，由实施例2制备得到的半成品中的脂溶性维生素有较好的稳定性。
实施例5：针对冻干品中脂溶性维生素的水分含量的说明
随机抽取实施例1中的4盒试剂盒，在室温下避光保存，使用卡尔-费休水分测定仪采用容量滴定法分别检测随机抽取的试剂盒中的脂溶性维生素的冻干品(包括脂溶性维生素的校准品、脂溶性维生素的质控品)的水分。如表4和表5所示，其中表4为冻干品中的水分含量，表5为冻干品的外观考察情况，其中外观考察包括对封装好的冻干品在不同时间的外观形貌考察和复溶后的状态考察。
表4
时间
C1
C2
C3
C4
C5
C6
QC(L)
QC(M)
QC(H)
0月
1.35％
1.56％
1.32％
1.48％
1.62％
1.56％
1.45％
1.38％
1.52％
1月
1.35％
1.52％
1.36％
1.26％
1.54％
1.52％
1.29％
1.35％
1.49％
3月
1.64％
1.68％
1.57％
1.48％
1.58％
1.78％
1.61％
1.58％
1.62％
5月
1.68％
1.65％
1.72％
1.68％
1.69％
1.72％
1.98％
1.62％
1.64％
6月
1.7％
1.72％
1.69％
1.72％
1.68％
1.86％
1.74％
1.71％
1.87％
表5
由表4和表5可知，脂溶性维生素的冻干品在室温避光下保存6个月时，脂溶性维生素的冻干品中的水分含量均未超过3％，而且脂溶性维生素的冻干品均为白色固体、复溶后为透明液体，因此该试剂盒中的脂溶性维生素的稳定性良好。
实施例6：针对冻干品中脂溶性维生素的稳定性的说明
将实施例2中获得的针对实施例1中的试剂盒中的脂溶性维生素的冻干品(包括脂溶性维生素的校准品、脂溶性维生素的质控品)在室温下避光保存，并分别在不同时间对冻干品中每个浓度点选取三个样品按照实施例3中的方法进行检测，并利用均值计算检测获得的脂溶性维生素的实际浓度和理论投入脂溶性维生素浓度(靶值浓度)的百分比，如表6和表7所示，其中表6为冻干品中的维生素A的实际浓度与靶值浓度的比值，表7为冻干品中的维生素E的实际浓度与靶值浓度的比值。
表6
时间
C1
C2
C3
C4
C5
C6
QC(L)
QC(M)
QC(H)
0月
100％
99.9％
100.1％
99.2％
98.9％
100.1％
99.9％
100％
99.5％
1月
99.8％
100％
996％
99.3％
98.3％
99.8％
99.5％
100％
99.1％
3月
100.2％
99.6％
99.2％
99.1％
98.4％
99.5％
99.4％
99.6％
98.7％
5月
99.6％
98.9％
98.5％
98.5％
98.2％
99.2％
98.6％
99.4％
98.6％
6月
98.9％
98.2％
98.6％
97.9％
97.8％
98.1％
97.6％
98.9％
98.1％
表7
时间
C1
C2
C3
C4
C5
C6
Q7
Q8
Q9
0月
100.2％
100％
99.5％
100％
99.5％
99.5％
100％
99.9％
99％
1月
99.9％
99.8％
99.3％
99.8％
99.2％
99.4％
99.1％
99.2％
99.1％
3月
99.7％
99.6％
99.1％
99.6％
98.9％
98.9％
98.9％
99％
98.6％
5月
98.9％
99.1％
98.6％
99.1％
98.8％
98.4％
98.4％
98.4％
98.1％
6月
98.1％
98.4％
98.4％
98.4％
97.9％
98.5％
97.9％
97.9％
97.6％
由表6和表7可知，脂溶性维生素的冻干品在室温条件下避光放置6个月时，维生素A和维生素E的实际浓度与靶值浓度的相对偏差均未超过3％，因此，由实施例2制备得到的脂溶性维生素的冻干品中的脂溶性维生素有较好的稳定性。
实施例7：针对试剂盒的线性考察的说明
将实施例1中所述的试剂盒按照使用说明书上记载的实施例3中的检测方法进行处理，并根据实施例3.2进行标准曲线方程的拟合，以考察校准品的线性情况。
具体地，针对维生素A来说，由六个脂溶性维生素的校准品制备得到的六种标准溶液，以每种浓度的标准溶液中维生素A的浓度与维生素A-d3内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x1，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的维生素A的峰面积与维生素A-d3内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a1*x1+b1，并且得出权重系数a1、 b1，权重系数a1为标准曲线方程的斜率，权重系数b1为标准曲线方程的截距，维生素A的线性关系图见图4，其中，图4中的线性方程为 y1＝3.9259*x1+0.1067，相关系数为0.99947。
具体地，针对校准品中的维生素A来说，每个校准品中的维生素A的靶值浓度、实际浓度以及回收率如表8所示。
表8
具体地，针对维生素E来说，由六个脂溶性维生素的校准品制备得到的六种标准溶液，以每种浓度的标准溶液中维生素E的浓度与维生素E-d6内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的维生素E的峰面积与维生素E-d6内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a2*x2+b2，并且得出权重系数a2、 b2，权重系数a2为标准曲线方程的斜率，权重系数b2为标准曲线方程的截距，维生素E的线性关系图见图5，其中，图5中的线性方程为 y2＝2.3767*x2-0.2821，相关系数为0.99875。
具体地，针对校准品中的维生素E来说，每个校准品中的维生素E的靶值浓度、实际浓度以及回收率如表9所示。
表9
综合上述验证试验、表8和表9可知，本实施例的回收率符合要求，该方法检测血液中每一种脂溶性维生素，重现性良好，回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。本实施例中的每一种脂溶性维生素的线性关系数据所对应的相关系数均大于0.9900，线性关系良好。
实施例8：针对试剂盒的批内精密度和批间精密度的说明
随机抽取1批次实施例1中所述的试剂盒，按照实施例3中待测样品的前处理以及检测条件对试剂盒中的三个脂溶性维生素的质控品(QC(L)、 QC(M)和QC(H))进行重复检测，测定脂溶性维生素的质控品中每一种脂溶性维生素的浓度，其中，三个脂溶性维生素的质控品中每一种脂溶性维生素的浓度如表10所示，表中VA为维生素A，VE为维生素E。
表10
由表10可知，脂溶性维生素的质控品中每一种脂溶性维生素的检测浓度均在其给定的靶值范围内，而且批内精密度范围为0.69％～4.80％，符合试剂盒企业标准，即出品的试剂盒精密度需达到的标准批内精密度：CV<10％。
随机抽取3批次实施例1中所述的试剂盒，按照实施例3中待测样品的前处理以及检测条件对所抽取的试剂盒中的三个脂溶性维生素的质控品 (QC(L)、QC(M)和QC(H))进行重复检测，测定脂溶性维生素的质控品中每一种脂溶性维生素的浓度，其中，三个脂溶性维生素的质控品中每一种脂溶性维生素的浓度如表11所示，表中VA为维生素A，VE为维生素E。
表11
由表11可知，脂溶性维生素的质控品中每一种脂溶性维生素的检测浓度均在其给定的靶值范围内，而且批间精密度范围为1.47％～5.76％，相对极差均小于8％，符合相关批间精密度的要求。
需要说明的是，图4和图5中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
此外应理解，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，如添加或减少一种或数种冻干品中的原料以及对各原料的配比做一定的调整等，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。