一种寡糖的液相色谱分析方法
阅读说明：本技术 一种寡糖的液相色谱分析方法 (Liquid chromatography analysis method of oligosaccharide ) 是由 梁鑫淼 夏东海 郭志谋 金高娃 闫竞宇 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种寡糖的液相色谱分析方法。其特征是：在高pH、高柱温条件下,采用亲水色谱模式对寡糖进行分析。本方法通过在流动相中添加低末端吸收的碱性添加剂,以增强寡糖的紫外信号。本方法在高pH、高柱温条件下进行,加速了还原糖的变旋,使较宽的差向异构分裂峰变成窄的单峰。本发明在增强了寡糖紫外信号的同时,还具有不产生异构峰的优点,这对寡糖的色谱定性、定量分析及其分离纯化具有十分重要的意义。(The invention relates to a liquid chromatography analysis method of oligosaccharide. The method is characterized in that: and (3) analyzing the oligosaccharide by adopting a hydrophilic chromatographic mode under the conditions of high pH and high column temperature. The method enhances the ultraviolet signal of the oligosaccharide by adding a basic additive with low terminal absorption in the mobile phase. The method is carried out under the conditions of high pH and high column temperature, so that the derotation of reducing sugar is accelerated, and a wider epimerization splitting peak is changed into a narrow single peak. The invention enhances the ultraviolet signal of the oligosaccharide and has the advantage of no generation of isomeric peaks, which has important significance for chromatographic qualitative and quantitative analysis and separation and purification of the oligosaccharide.)
技术领域
本发明属于生物化学分析检测领域，涉及一种寡糖的液相色谱分析方法。
技术背景
寡糖又称低聚糖，是由2-10个单糖分子通过糖苷键聚合而成的碳水化合物(DairyScience and Technology,second edition,2008.)。寡糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒感染、降血糖和降血脂、调节肠道菌群和增强免疫力等多种生物活性(山东化工,2015,44:40-45.)。常见的寡糖有壳寡糖、母乳寡糖、果寡糖和阿卡波糖等。不同寡糖的区别主要是单糖组成、连接方式和聚合度的不同，而寡糖的种类和来源又会直接影响其生物活性，因此寡糖的分析对其生物活性的研究具有十分重要的意义。
液相色谱分析是寡糖分析的一种重要手段。鉴于寡糖本身无紫外吸收或紫外吸收较弱，多采用衍生化法(生物化工,2019,5(3):16-19.)引入发色团以满足其紫外检测的需求，然后采用亲水色谱柱或反向色谱柱予以分离。但衍生化法不仅操作繁琐费时，而且衍生化后寡糖异构体的特征碎片往往会消失。
采用亲水色谱柱直接对还原糖进行分析则会克服上述缺点，但需要使用电喷雾检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器或质谱检测器等通用型检测器。而在检测器条件受限的情况下，如在只有紫外检测器时则需要选择低末端吸收的添加剂以增强寡糖的紫外信号。此外，在还原糖的分析中，其α型和β型变旋所产生的差向异构体也会被色谱柱分离，呈宽的分裂峰，这将影响色谱柱的峰容量和还原糖之间的分离度。因此，需要开发一种末端吸收弱且能同时控制差向异构体分离的寡糖的液相色谱分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种寡糖的液相色谱分析方法，在增强了寡糖紫外信号的同时，还具有不产生异构峰的优点，这对寡糖的色谱定性、定量分析及其分离纯化具有十分重要的意义。
为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：在高pH、高柱温条件下，采用亲水色谱模式对寡糖进行分析。
所述pH为8～12，通过在流动相中添加碱性添加剂进行调节。
其中，所述流动相为有机相和水相。有机相为乙腈、乙醇、甲醇等中的一种或多种组合。
其中，碱性添加剂的添加方式为在两相中分别添加或在任意一相中添加。碱性添加剂的种类、浓度及其pH如下：
a)氨水，质量分数0.0001～30％；
b)三乙胺，体积分数0.0001～100％；
c)磷酸铵缓冲盐，浓度1-200mM，pH 8-12；
d)磷酸三乙胺缓冲盐，浓度1-200mM，pH 8-12；
e)甲酸铵缓冲盐，浓度1-200mM，pH 8-12；
f)乙酸铵缓冲盐，浓度1-200mM，pH 8-12；
g)碳酸氢铵缓冲盐，浓度1-200mM，pH 8-12。
所述柱温为40～90℃。
所述亲水色谱柱为硅胶或键合有极性官能团的耐碱亲水色谱柱。
其中，极性键合基团为酰胺、氨基酸、氨基、羧基、糖基和两性离子等中的一种或几种。
其中，亲水色谱柱柱内径为2.1-10mm；柱长为50-250mm；填料粒径为1.7-10μm；填料孔径为填料比表面积为180-350m2/g。
所述分析方法采用的检测器为紫外检测器、电喷雾检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器和质谱检测器中的一种或几种。
其中，紫外检测波长为190～400nm。
本发明具有如下优点：
1.可紫外检测。本发明在流动相中添加的碱性添加剂具有较弱的末端吸收，对寡糖紫外信号的抑制作用较弱，能够在低波长下对寡糖直接进行紫外检测。
2.不产生异构峰。本发明在高pH、高柱温条件下进行，使得还原糖的α型和β型差向异构体一直处于快速变旋之中，色谱柱无法分离，从而使较宽的差向异构分裂峰变成窄的单峰。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的XBridge Amide色谱柱对几丁寡糖的液相色谱分析谱图。
图2为本发明实施例2所述的XBridge Amide色谱柱对壳寡糖的液相色谱分析谱图。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
XBridge Amide色谱柱对几丁寡糖的液相色谱分析，采用如下色谱条件：
碱性色谱条件：
色谱柱：XBridge Amide(Waters,4.6×150mm,3.5μm)；
柱温：50℃；30℃(对比例)；
流动相：A,ACN(含0.02％氨水，即每100mL乙腈中含有质量浓度28-30％氨水0.02mL)；B,0.02％氨水(pH＝10.3，即每100mL水中含有质量浓度28-30％氨水0.02mL)；
流速：1mL/min；
洗脱条件：0～35min,75％～55％A，线性；
样品：几丁寡糖溶液(10mg/mL，溶样溶剂：A/B＝1/1(v/v))；
进样量：10μL；
紫外检测波长：195nm；
中性色谱条件(对比例)：
色谱柱：XBridge Amide(Waters,4.6×150mm,3.5μm)；
柱温：50℃；
流动相：A,ACN；B,H2O；
流速：1mL/min；
洗脱条件：0～15min,80％～60％A，线性；
样品：几丁寡糖溶液(10mg/mL，溶样溶剂：A/B＝1/1(v/v))；
进样量：10μL；
紫外检测波长：195nm；
几丁寡糖含有共轭的酰胺结构，因此可以直接进行紫外检测，但存在明显的差向异构分裂峰(图1a)。对比图1c与图1a、图1b可知，高pH和高温能够抑制差向异构现象，且能够分离出更多的样品峰。因此采用本发明后，几丁寡糖的液相色谱分析中不产生异构峰，且能够看到更多的样品组分。
实施例2
XBridge Amide色谱柱对壳寡糖的液相色谱分析，与实施例1不同之处在于采用如下色谱条件：
碱性色谱条件：
样品：壳寡糖溶液(10mg/mL，溶样溶剂：A/B＝1/1(v/v))；
壳寡糖因含有碱性的氨基，因此其常规亲水色谱分析在酸性条件下进行，酸性色谱条件(对比例)：
色谱柱：XBridge Amide(Waters,4.6×150mm,3.5μm)；
柱温：50℃；
流动相：A,体积分数80％ACN(含10mM甲酸铵，由pH＝3.2的100mM甲酸铵100mL、采用100mL水和800mL乙腈稀释而来)；B,体积分数20％ACN(含10mM甲酸铵，由pH＝3.2的100mM甲酸铵100mL、采用700mL水和200mL乙腈稀释而来)；
流速：1mL/min；
洗脱条件：0～10min,80％～60％A，线性；10～30min,60％～32％A，线性；
样品：壳寡糖溶液(10mg/mL，溶样溶剂：A/B＝1/1(v/v))；
进样量：10μL；
紫外检测波长：195nm；
壳寡糖的共轭结构较少，因此在常规亲水色谱分析中无法直接进行紫外检测且存在差向异构分裂峰(图2a，因噪音太高、紫外信号太差，无法明显观察到实际存在的差向异构现象)。对比图2c与图2a、图2b(弱的差向异构现象)可知，高pH和高温能够抑制差向异构现象，且使得壳寡糖能够直接进行紫外检测。因此采用本发明后，壳寡糖有较好的紫外响应且不产生异构峰。
本方法通过在流动相中添加低末端吸收的碱性添加剂，以增强寡糖的紫外信号。本方法在高pH、高柱温条件下进行，加速了还原糖的变旋，使较宽的差向异构分裂峰变成窄的单峰。本发明在增强了寡糖紫外信号的同时，还具有不产生异构峰的优点，这对寡糖的色谱定性、定量分析及其分离纯化具有十分重要的意义。
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