一种l-苹果酸有关物质的hplc检测方法
阅读说明：本技术 一种l-苹果酸有关物质的hplc检测方法 (HPLC detection method of L-malic acid related substances ) 是由 孙立杰 苏燕 段孟彤 石俭 石笑笑 于 2020-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药检测技术领域,具体公开一种L-苹果酸有关物质的HPLC检测方法。所述L-苹果酸有关物质的HPLC检测方法中,所述HPLC的检测条件：色谱柱为亲水型C18柱；柱温为20-40℃；流动相为5-100mmol/L磷酸二氢钠水溶液,pH 2-5；流速为0.1-1mL/min；检测波长为210nm；洗脱方式为等度洗脱。本发明提供的L-苹果酸有关物质的HPLC检测方法,可实L-苹果酸中杂质,特别是酒石酸、马来酸、富马酸和L-苹果酸二聚体杂质的有效分离,峰形和分离度情况良好,可以满足L-苹果酸中L-苹果酸二聚体杂质的检出,为提高和控制L-苹果酸的质量提供了可靠保障。(The invention relates to the technical field of medicine detection, and particularly discloses an HPLC (high performance liquid chromatography) detection method for L-malic acid related substances. In the HPLC detection method of the L-malic acid related substances, the detection conditions of HPLC are as follows: the chromatographic column is a hydrophilic C18 column; the column temperature is 20-40 ℃; the mobile phase is 5-100mmol/L sodium dihydrogen phosphate water solution, and the pH value is 2-5; the flow rate is 0.1-1 mL/min; the detection wavelength is 210 nm; the elution mode is isocratic elution. The HPLC detection method of the related substances of the L-malic acid provided by the invention can effectively separate impurities in the L-malic acid, particularly tartaric acid, maleic acid, fumaric acid and L-malic acid dimer impurities, has good conditions of peak shape and separation degree, can meet the detection requirement of the L-malic acid dimer impurities in the L-malic acid, and provides reliable guarantee for improving and controlling the quality of the L-malic acid.)
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种L-苹果酸有关物质的HPLC检测方法。
背景技术
L-苹果酸是苹果酸的左旋异构体，具有重要的生理功能，是人体内部循环的重要中间产物，且易被人体吸收，可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用。L-苹果酸已经在医药领域应用十分广泛，但现有的对L-苹果酸杂质的研究目前主要集中在富马酸和马来酸，关于L-苹果酸相关杂质研究仍不完善。
本发明技术人员在L-苹果酸的稳定性研究过程中，发现了一个降解杂质，该杂质是由L-苹果酸自身聚合而成的L-苹果酸二聚体。而现有的中国2015版药典、USP、BP和EP药典方法中L-苹果酸有关物质检测中均只记载了富马酸和马来酸的质量控制方法，对L-苹果酸二聚体杂质均没有研究，并且药典方法不能有效分离L-苹果酸二聚体杂质。
发明内容
针对现有技术及药典中对L-苹果酸二聚体杂质均没有研究，且现有技术及药典方法均不能有效分离L-苹果酸二聚体杂质的问题，本发明提供一种L-苹果酸有关物质的HPLC检测方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种L-苹果酸有关物质的HPLC检测方法，所述HPLC的检测条件：
色谱柱：亲水型C18柱；
柱温：20-40℃；
流动相：5-100mmol/L磷酸二氢钠水溶液，pH 2-5；
流速：0.1-1mL/min；
检测波长:210nm；
洗脱方式：等度洗脱。
相对于现有技术，本发明提供的L-苹果酸有关物质的HPLC检测方法，可实L-苹果酸中杂质，特别是酒石酸、马来酸、富马酸和L-苹果酸二聚体杂质的有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足L-苹果酸中L-苹果酸二聚体杂质的检出。本发明提供的L-苹果酸有关物质的检测方法精密度和准确度高，重现性好，可用于L-苹果酸的质量控制及综合评价，为提高和控制L-苹果酸的质量提供了可靠保障。
优选的，所述检测方法中的进样体积为1-100μL。
优选的，所述检测方法中的进样体积为80μL。
优选的，所述柱温为35℃。
优选的，所述流动相为20mmol/L磷酸二氢钠水溶液，其pH为2.6。
上述优选的流动相的浓度和pH能够使色谱峰更好地分离，利于L-苹果酸二聚体杂质的检出，同时可有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。
优选的，所述流速为0.5mL/min。
优选的，配制供试品溶液和对照品溶液；精密量取所述供试品溶液和对照品溶液，按照所述HPLC的检测条件进行色谱分离，并记录色谱图；按加校正因子的主成分自身对照法计算供试品溶液中L-苹果酸二聚体杂质的含量。
优选的，所述供试品溶液的配置方法为：用所述流动相将L苹果酸稀释至10mg/mL。
上述优选的供试品溶液的浓度有利于对供试品中L-苹果酸二聚体杂质与其它物质色谱峰的有效分离，以及对其含量进行更准确的计算。
优选的，所述对照品溶液的配置方法为：用所述流动相将酒石酸、马来酸和富马酸稀释成酒石酸、马来酸和富马酸的浓度分别为30μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的混合溶液。
附图说明
图1是本发明实施例1中HPLC法测定的供试品溶液的色谱图，其中，峰1：草酸，峰2：酒石酸，峰3：苹果酸，峰4：富马酸，峰5：L-苹果酸二聚体；
图2是本发明实施例2中L-苹果酸二聚体杂质的线性关系曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.仪器与条件：
高效液相色谱仪：日立L-2000；
色谱柱：碳十八色谱柱(250mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：35℃；
流动相：20mmol/L磷酸二氢钠水溶液，pH 2.6；
流速：0.5mL/min；
检测波长:210nm；
进样体积：80μL；
洗脱方式：等度洗脱；
供试品溶液：取L-苹果酸供试品250mg，精密称定，置于25mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液；
供试品自身对照溶液：精密量取供试品溶液适量，用流动相将其稀释1000倍，作为供试品自身对照溶液；
对照品溶液：为确保产品质量，本实施例按以下表1中的企业标准进行对照溶液的配制：取酒石酸、马来酸和富马酸，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含酒石酸30μg、马来酸5μg和富马酸10μg的混合溶液，作为对照品溶液；
系统适应性溶液：取酒石酸、马来酸、富马酸和L-苹果酸，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含酒石酸30μg、马来酸5μg、富马酸10μg和L-苹果酸1mg的系统适应性溶液。
2.检测方法
精密量取系统适应性溶液，注入液相色谱仪，各组分的出峰顺序为酒石酸、L-苹果酸、马来酸和富马酸，理论塔板数以L-苹果酸峰计算不低于2000，酒石酸峰、L-苹果酸峰、马来酸峰和富马酸峰的分离度均应符合要求。
精密量取供试品溶液和对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的5倍，得到的供试品溶液的色谱图如图1所示。供试品溶液色谱图中，按外标法以峰面积计算，含酒石酸、马来酸和富马酸不得过0.30％、0.05％和0.10％，用自身对照法计算出L-苹果酸二聚体的校正因子为0.77(校正因子计算方法为L-苹果酸和L苹果酸二聚体杂质线性斜率的比值)，按加校正因子的主成分自身对照法计算出供试品溶液中L-苹果酸二聚体的含量。L-苹果酸二聚体(与富马酸相对保留时间1.1)的峰面积不得大于自身对照溶液主峰面积的3倍(0.3％)，其他单个杂质峰面积不得大于自身对照溶液中主峰峰面积(0.10％)；其他杂质峰面积的和不得大于自身对照溶液中主峰峰面积的3倍(0.30％)。
供试品溶液中有关物质的检测结果如表1所示。
表1
企业标准
有关物质含量％
富马酸不得过0.10％
0.057％
马来酸不得过0.05％
未检出
酒石酸不得过0.30％
0.12％
L-苹果酸二聚体不得过0.3％
0.049％
其他单个杂质不得过0.10％
0.044％
其他总杂质不得过0.30％
0.060％
实施例2
1.仪器与条件：
高效液相色谱仪：日立L-2000；
色谱柱：碳十八色谱柱(250mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：20℃；
流动相：5mmol/L磷酸二氢钠水溶液，pH 2；
流速：0.1mL/min；
检测波长:210nm；
进样体积：1μL；
洗脱方式：等度洗脱；
供试品溶液、供试品自身对照溶液、对照品溶液和系统适应性溶液与实施例1相同。
2.检测方法
检测方法与实施例1相同。
经检测得到的供试品溶液中的有关物质含量(富马酸、马来酸、酒石酸、L-苹果酸二聚体、其他单个杂质和其他总杂质)的结果与实施例1的检测结果基本相当。
实施例3
1.仪器与条件：
高效液相色谱仪：日立L-2000；
色谱柱：碳十八色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
柱温：40℃；
流动相：100mmol/L磷酸二氢钠水溶液，pH 5；
流速：1mL/min；
检测波长:210nm；
进样体积：100μL；
洗脱方式：等度洗脱；
供试品溶液、供试品自身对照溶液、对照品溶液和系统适应性溶液与实施例1相同。
2.检测方法
检测方法与实施例1相同。
经检测得到的供试品溶液中的有关物质含量(富马酸、马来酸、酒石酸、L-苹果酸二聚体、其他单个杂质和其他总杂质)的结果与实施例1的检测结果基本相当。
实施例4
方法学考察及结果
1.线性关系：
取L-苹果酸二聚体，精密称定，分别用流动相稀释成浓度为0.256μg/mL、8.127μg/mL、15.238μg/mL、20.318μg/mL、25.397μg/mL、30.476μg/mL、40.635μg/mL、50.794μg/mL和71.112μg/mL的溶液，按照实施例1中的色谱条件进行检测，测得L-苹果酸二聚体的线性关系曲线如图2所示。其线性关系数据如表2所示。
表2
表2中的数据表明L-苹果酸二聚体在0.256-71.112ug/mL范围内呈良好的线性关系。
2.重复性
取L-苹果酸，精密称定，用流动相作为稀释液配制成L-苹果酸含量为10mg/mL的溶液，作为重复性验证供试品溶液，按照实施例1中的色谱条件进行检测，测定结果如表3所示。
表3
由表3中可知，6次重复试验结果中各杂质的检测结果重现性良好，表明该方法重复性良好。
3.精密度
取L-苹果酸，精密称定，用流动相作为稀释液配制成L-苹果酸含量为10mg/mL的溶液，作为精密度验证的供试品溶液，连续进样6次，按照实施例1中的色谱条件进行检测，测定结果如表4所示。
表4
由结果可知6次试验结果，各杂质的检测结果重现性良好，表明该方法精密度良好。
4.灵敏度
取L-苹果酸二聚体杂质，用流动相定量稀释，按照实施例1中的色谱条件进行检测，检测不同浓度下的信噪比，当信噪比大于3时，L-苹果酸二聚体的浓度为0.1μg/mL，因此，其检测限浓度为0.1μg/mL；当信噪比大于10时，L-苹果酸二聚体的浓度为0.2506μg/mL，因此，其定量限浓度为0.2506μg/mL。
5.加样回收实验
取L-苹果酸二聚体杂质，用流动相稀释，精密称取并加入供试品溶液中，用流动相定容，按照实施例1中的色谱条件进行检测，检测并计算L-苹果酸二聚体杂质的回收率，计算结果如表5所示。
表5
从表5可以看出，L-苹果酸二聚体的平均加样回收率为104.82％，相对标准偏差RSD＝3.57％，说明其回收效果良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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