一种银杏叶提取物产品中5种银杏酸的超痕量检测方法
阅读说明：本技术 一种银杏叶提取物产品中5种银杏酸的超痕量检测方法 (Ultra-trace detection method for 5 ginkgolic acids in ginkgo leaf extract product ) 是由 梅秀明 张驰 吴肖肖 蒋迪尧 纪晗旭 杨淼 张宇 乔玲 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种银杏叶提取物产品中5种银杏酸的超痕量检测方法,属于检测技术领域。该方法是将待测样品经超声提取后采用液相色谱串联质谱进行检测,通过对提取溶剂和提取次数的考察,以及超声时间的确定,建立了一种前处理简单易操作、提取效率高,定性、定量结果准确的高灵敏检测方法,可以满足银杏叶提取物产品中银杏酸含量的精准检测,能够全面监测银杏叶提取物产品中银杏酸含量,对保障银杏叶提取物产品的安全性具有重要的作用。(The invention discloses an ultra-trace detection method for 5 ginkgoic acids in a ginkgo leaf extract product, and belongs to the technical field of detection. The method is characterized in that a sample to be detected is subjected to ultrasonic extraction and then is detected by adopting liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and through the investigation of an extraction solvent and extraction times and the determination of ultrasonic time, a high-sensitivity detection method with simple pretreatment, easy operation, high extraction efficiency and accurate qualitative and quantitative results is established, so that the accurate detection of the content of ginkgolic acid in the ginkgo biloba extract product can be met, the content of ginkgolic acid in the ginkgo biloba extract product can be comprehensively monitored, and the method has an important effect on ensuring the safety of the ginkgo biloba extract product.)
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种银杏叶提取物产品中5种银杏酸的超痕量检测方法。
背景技术
银杏叶提取物为银杏科植物银杏的叶子经干燥后加工制成的提取物，具有活血化瘀、通经疏络的功效，通常可以制成保健品、药品等，多用于改善微血管循环、治疗缺血性心脑血管疾病等。银杏酸是存在于银杏的叶、种子、根和树皮中的2-羟基-6烷基-苯甲酸酯类化合物，是银杏提取物中的最主要毒性物质，常见的银杏酸有5种，分别为白果新酸(C13:0)、白果酸(C15:1)、氢化白果酸(C15:0)、十七烷一烯银杏酸(C17:1)和十七烷二烯银杏酸(C17:2)。银杏酸具有致敏、致突变和较强的细胞毒性，可以引起过敏反应、基因突变、神经损伤，从而导致恶心、胃灼热、过敏性休克、过敏性紫癜、抽搐、瘫痪等不良反应。目前世界各国都将银杏酸作为银杏类产品质量控制的关键指标。
测定银杏叶中银杏酸的方法有很多，TLC法快速、廉价、操作简便，但由于误差大、精密度有限，仅适用于定性分析；GC和GC-MS测定银杏酸需要衍生化，比较繁琐，而且不容易判断结果，因为测定的是银杏酸衍生物，而不是银杏酸本身。液相色谱-质谱联用技术具有效率高、速度快、灵敏度高等优点，适用于测定痕量、分离困难或变化多端的组分，同时给出了样品的保留时间、分子量和特征组分结构碎片等丰富的信息。
现有的银杏酸类物质检测中，有的只定量一个白果新酸，然后根据经验系数换算成总银杏酸的含量，但是仅仅通过测定1个或者2个银杏酸，很难准确的判定产品中总银杏酸的含量，对于评估银杏类产品的安全性问题具有一定风险性。因此，建立5种银杏酸的检测方法，意义重大。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种银杏叶提取物产品中5种银杏酸的超痕量检测方法，该方法前处理简单、便捷、提取效率高，液相色谱串联质谱不仅可以较好的分离5种银杏酸，且检测结果稳定、可靠，灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种银杏叶提取物产品中5种银杏酸的超痕量检测方法，包括以下步骤：
步骤1，预处理：取待测样品粉碎、过筛，加入提取溶剂，超声提取，静置冷却，滤纸过滤分离，过滤后的残渣再用提取溶剂提取一次，合并两次滤液，定容瓶定容，过有机滤膜后即得到待检样品液；
步骤2，检测：将步骤1获得的待检样品液用液相色谱串联质谱检测，通过二级离子碎片的丰度比定性，外标法定量；
所述5种银杏酸为白果新酸、白果酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸和十七烷二烯银杏酸；
所述液相色谱条件如下：
色谱柱为C18色谱柱(1.8μm，2.1×50mm)
流动相：流动相A为0.2％乙酸水溶液，流动相B为异丙醇和乙腈的混合物，异丙醇和乙腈的体积比为40：60
梯度程序：0～3.0min,60％～92％B；3.0～6.0min,92％B；6.0～8.0min,92％～95％B；后运行：2min
进样量：2μL；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；
所述质谱条件如下：
离子化模式：电喷雾双喷离子源，负离子模式(Dual AJS ESI-)
质谱扫描方式：多反应监测(MRM)
雾化器压力：40psi
气体温度：300℃，气体流速：10L/min
鞘气(N2)温度：300℃；鞘气(N2)流速：11L/min
毛细管电压：3000V
碎裂电压：0V。
进一步地，所述待测样品为银杏叶提取物的产品。
进一步地，步骤1中提取溶剂为甲醇。
进一步地，步骤1中提取方式为超声，时间为30min。
进一步地，步骤1中过滤后的残渣再用提取溶剂提取一次是向残渣中加入甲醇，超声提取，滤纸过滤后合并两次滤液。
质谱监测母离子、定量子离子、定性子离子质荷比、碰撞能、碎片电压如下，标注*为定量离子：
有益效果：
本发明提供了一种准确稳定测定银杏叶提取物产品中5种银杏酸的超痕量检测方法，通过对提取溶剂、提取次数、超声时间等条件的优化，建立了一种提取效率高、定性和定量结果准确的高灵敏度检测方法，本发明中5种银杏酸的定量限为0.05～0.1μg/kg，标准曲线在0.5μg/L～100μg/L之间，线性关系良好，相关系数大于0.999，加标回收检测结果为：5种银杏酸的日内回收率在90.75-111.69％，RSD在0.15-5.60％，日间回收率在91.33-105.69％，RSD在1.02-4.36％，灵敏度和准确性都较高，本发明的检测方法可以满足银杏叶提取物产品中5种银杏酸含量的超痕量检测。
本发明的检测方法可用于银杏叶提取物产品中微量银杏酸含量的精准检测，可确保银杏叶提取物产品的安全性，保障消费者的生命健康和安全。
附图说明
图1为5种银杏酸在液相色谱串联质谱检测设备上的总离子流图，其中：1、C13:0，白果新酸；2、C15:1，白果酸；3、C17:2，十七烷二烯银杏酸；4、C15:0，氢化白果酸；5、C17:1，十七烷一烯银杏酸。
图2为液相检测系统中5种银杏酸的离子色谱图，其中：1、C13:0，白果新酸；2、C15:1，白果酸；3、C17:2，十七烷二烯银杏酸；4、C15:0，氢化白果酸；5、C17:1，十七烷一烯银杏酸。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
用甲醇为溶剂配制5种银杏酸标准品浓度为0.5μg/L～100μg/L系列标准溶液，进液相色谱-串联质谱检测，建立外标法标准曲线。
称取样品0.1g，加入5种银杏酸的标准溶液，浓度分别为0.5ng/g、1ng/g和2ng/g，加入10mL甲醇，超声提取30min，静置10min，滤纸过滤分离，取滤液，残渣再用甲醇提取一次，合并两次的滤液，用定容瓶定容后过微孔滤膜，用液相色谱-串联质谱检测，分别测定日内和日间的加标回收结果，计算加标回收率和相对标准偏差。
检测结果：标准曲线在0.5μg/L～100μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.999。
表1加标回收检测结果表
5种银杏酸的日内回收率在90.75～111.69％，RSD在0.15～5.60％，日间回收率在91.33～105.69％，RSD在1.02～4.36％。加标回收率和相对标准偏差数据验证了此检测方法的准确性和精密度都较高。
实施例2
将标准样品用提取液稀释至一定低浓度，按照实施案例1中的检测条件，当信噪比(S/N)为3时为对应目标物的检出限。
检测结果：当称样量为0.1g，定容体积为25mL时，5种银杏酸的检出限如下：白果新酸(C13:0)，0.01ng/g；白果酸(C15:1)，0.02ng/g；氢化白果酸(C15:0)，0.02ng/g；十七烷一烯银杏酸(C17:1)，0.05ng/g；十七烷二烯银杏酸(C17:2)0.02ng/g。
实施例3
称取粉碎过筛后的1号样品0.1g，分别加入10mL甲醇、乙腈、乙醇，超声30min，静置10min，滤纸过滤后定容，取滤液过有机滤膜(0.22μm)后移入进样瓶，上机检测。
表2不同提取溶剂提取银杏酸含量(μg/g)
如表2所示，甲醇提取的效果最好，所以选用甲醇作为提取银杏酸的溶剂。
实施例4
称取粉碎过筛后的1号样品0.1g(精确至0.000 1g)至15mL刻度试管，加入10mL甲醇，分别超声10min、20min、30min、40min、50min，静置10min，滤纸过滤后定容，取滤液过有机滤膜(0.22μm)后移入进样瓶，检测。
表3超声时间对提取银杏酸的影响(μg/g)
如表3，随着超声时间的延长，特别是10min-30min，银杏酸的提取效率逐渐提高，30min后，银杏酸含量上升趋势减缓，为了节约提取的时间，选择了超声30min。
实施例5
称取粉碎过筛后的1号样品0.1g(精确至0.0001g)至15mL刻度试管，加入10mL甲醇，超声30min，静置10min滤纸过滤，定容，测得的总银杏酸含量为2.10μg/g，考虑到残渣中还含有一定的银杏酸，所以在滤渣中加入10mL甲醇，超声提取30min，滤纸过滤，并定容，取滤液过有机滤膜后移入进样瓶，检测得到的银杏酸含量为0.25μg/g，两次提取比一次提取效率提高11.90％，所以确定二次提取。
检测结果：确定二次提取模式为银杏叶提取物产品中5种微量银杏酸的提取方法。
实施例6
液相色谱-串联质谱与液相色谱检测银杏酸的比较：将5种银杏酸混合标准溶液进样液相色谱检测系统，混标中5种银杏酸的浓度都是10μg/mL，采用Kromasil 100-5C18柱子(250×4.6mm)，进样量20μL，流动相是0.2％乙酸水溶液和甲醇。5种银杏酸在液相色谱检测系统中的出峰图见图2。两种检测设备的检测结果显示：液相色谱-串联质谱检测系统的出蜂时间快，进样量少，且检出限显著低于液相色谱检测系统，很多银杏叶提取物产品中的银杏酸在液相色谱检测系统中未检出，这对于产品中银杏酸含量的控制具有很大的风险。本发明建立的液相色谱-串联质谱检测微量银杏酸含量具有显著的优越性。
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